预测CD19抗体治疗在患者中的治疗益处的方法与流程
本公开内容涉及鉴定受益于抗cd19抗体治疗的患者中的特性和生物标记物。
背景技术：
cd19是免疫球蛋白超家族的95-kda的跨膜糖蛋白，其含有两个细胞外免疫球蛋白样结构域和广泛的胞质尾区。该蛋白质是泛b淋巴细胞表面受体，由前b细胞向前发育的最早期泛表达，直至其在终末分化成浆细胞的过程中得到下调。它对b-淋巴细胞谱系具有特异性，除一些滤泡树突状细胞以外，在造血干细胞和其他免疫细胞上不表达。cd19发挥着b细胞受体(bcr)信号传导的正调节物的功能，对于b细胞激活和增殖以及在体液免疫应答发展中均非常重要。其与cd21和cd81联合起到共刺激分子的作用，对于针对t-细胞依赖性抗原的b细胞应答来说至关重要。cd19的胞质尾区在物理上与经由src-家族的蛋白质酪氨酸激酶触发下游信号传导路径的酪氨酸激酶家族相关。cd19是淋巴来源的癌症的引人注意的靶点，因为其在几乎所有的慢性淋巴细胞性白血病(cll)和非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)以及许多其他不同种类的白血病包括急性淋巴细胞性白血病(all)和毛细胞白血病(hcl)中均高度表达。
针对cd19的抗体的临床开发之前受到cd19抗原内化的限制，但是，抗体修饰技术的改进已经恢复了该潜在的治疗靶点。mor00208(之前称作xmab5574)是与cd19结合的fc改造的人源化单克隆抗体。由于xmab改造的突变，相对于未经修饰的抗体，mor00208fc与fcγr的结合增加，在体外显著提高了针对肿瘤的依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性(adcc)、依赖于抗体的细胞介导的吞噬作用(adcp)和直接的细胞毒性作用(细胞凋亡)。mor00208未显示介导依赖于补体的细胞毒性。
mor00208已在cll、all和nhl临床试验中加以研究，或者目前正在研究中。具体地，完成了题为
mor00208的单一药剂效力已经在cll和nhl中得以报道。但是，通常患者对单克隆抗体治疗的反应率是多变的，这说明需要有精确预测哪些患者可能对这些抗体治疗有反应的方法，以便将治疗给予那些最可能受益的患者。可以发现患者的特定生物标记物或特性，其每个生物标记物特定的浓度或范围与对该治疗的反应性相关。
天然杀伤(nk)细胞计数对于经利妥昔单抗(rituximab)、环磷酰胺、盐酸阿霉素(羟基道诺霉素)、硫酸长春新碱(oncovin)和强的松(r-chop)治疗的dlbcl患者的存活的影响已有评价。kim等人,bloodresearch,49:3,162-169(2014年9月)。之前，已有报道外周nk细胞计数与具有aaipi2-3dlbcl的患者的临床结果相关。plonquet等人,annoncol2007；18:1209-15。
显然，仍需要有相当大的努力和投入，以发现并鉴定这些预测效力的患者特性和生物标记物。
技术实现要素：
mor00208已在具有cll、all、nhl和sll的患者中得以研究。因此，迄今已完成了对临床数据的细致分析，以鉴定出最有可能受益于mor00208治疗的患者的特性或生物标记物。
mor00208特异性地靶向cd19表面抗原，并经由其提高的adcc效应子功能介导直接的肿瘤细胞杀灭。在临床前研究中，已经显示，跨越很宽范围的人淋巴瘤和白血病(伯基特(burkitt's)淋巴瘤、cll、毛细胞白血病(hcl)、cd19+慢性粒细胞性白血病(cml)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)和急性成淋巴细胞性白血病(all))，mor00208在体外显著提高了cd19+肿瘤细胞系上的adcc、adcp和直接的细胞毒性作用(细胞凋亡)，cd19抗原表达水平的范围为15,000至105,000分子/细胞。类似的作用在关于新分离的患者cll或all细胞的情况下也有观察到，并也预期转化至原发性非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)细胞，因为报道的all和cllb细胞的表达范围涵盖了对nhlb细胞所观察到的范围(ginaldi等人,1998；olejniczak等人,2006)。基于遍及许多种类型b细胞肿瘤的cd19的广泛且均匀的表面表达，mor00208在当前研究中的效果可以转移至范围很宽的人淋巴瘤和白血病，例如cll、all、nhl和sll及其亚型。
来自题为fc-优化的抗cd19抗体(mor00208)治疗非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)的研究(studyoffc-optimizedanti-cd19antibody(mor00208)totreatnon-hodgkin′slymphoma(nhl))的iia期试验的数据已经得以细致分析。作为这些努力的结果，以下公开内容提供了其中抗cd19抗体有效力的患者的特性和生物标记物。
具体地，对患者的至少以下特性进行了评价：a)年龄，b)性别，c)患者在最近6个月内是否接受利妥昔单抗的剂量，d)患者是否是利妥昔单抗难治性的，e)患者是否具有fcγriiia高或低亲和力等位基因，f)患者是否具有fcγriia高或低亲和力等位基因，g)患者是否对之前的治疗有大于12个月的反应持续时间，h)基线外周t细胞计数(细胞/μl)，i)基线外周nk细胞计数(细胞/μl)，和j)外周nk细胞上的基线cd16表达(每细胞结合的抗体-abc)。
1)基线外周nk细胞计数和2)外周nk细胞上的基线cd16表达二者均清楚地表现出与患者对mor00208治疗的反应的相关性。具体地，基线外周nk细胞计数/μl较高的患者与较高的疾病控制率(dcr)相关。dcr包括具有完全反应(cr)+部分反应(pr)+病情稳定(sd)的患者。而且，与nk细胞计数较低的患者相比较，这些患者具有显著更优的无进展生存期(pfs)。此外，nk细胞上的基线cd16表达为至少60,000(abc)的患者与较高的疾病控制率(dcr)相关。
因此，诊断为cll、all、nhl和sll并且具有a)高外周nk细胞计数或者2)至少60,000abc的外周nk细胞上基线cd16表达的患者更加有可能受益于mor00208治疗。
1)基线外周nk细胞计数和2)外周nk细胞上的基线cd16表达二者均清楚地表现出与患者对mor00208治疗的反应的相关性。具体地，基线外周nk细胞计数为至少50个细胞/μl的患者与较高的疾病控制率(dcr)相关。dcr包括具有完全反应(cr)+部分反应(pr)+病情稳定(sd)的患者。而且，与nk细胞计数较低的患者相比较，基线nk细胞计数为至少50个细胞/μl的患者具有显著更优的无进展生存期(pfs)。此外，nk细胞上的基线cd16表达为至少60,000(abc)的患者与较高的疾病控制率(dcr)相关。
因此，诊断为cll、all、nhl和sll并且具有a)至少50个细胞/μl的基线外周nk细胞计数或者2)至少60,000abc的外周nk细胞上基线cd16表达的患者更加有可能受益于mor00208治疗。
1)基线外周nk细胞计数和2)外周nk细胞上的基线cd16表达二者均清楚地表现出与患者对mor00208治疗的反应的相关性。具体地，基线外周nk细胞计数为至少100个细胞/μl的患者与较高的疾病控制率(dcr)相关。dcr包括具有完全反应(cr)+部分反应(pr)+病情稳定(sd)的患者。而且，与nk细胞计数较低的患者相比较，基线nk细胞计数为至少100个细胞/μl的患者具有显著更优的无进展生存期(pfs)。此外，nk细胞上的基线cd16表达为至少60,000(abc)的患者与较高的疾病控制率(dcr)相关。
因此，诊断为cll、all、nhl和sll并且具有a)至少100个细胞/μl的基线外周nk细胞计数或者2)至少60,000abc的外周nk细胞上基线cd16表达的患者更加有可能受益于mor00208治疗。
附图说明
图1显示了mor00208可变结构域和cdr的氨基酸序列。
图2显示了mor00208的完整重链和轻链的氨基酸序列。
图3显示了作为dcr预测因素(predictor)的外周nk细胞计数的接受者操作特性(roc)分析。
图4显示了作为dcr预测因素的外周nk细胞上的cd16表达水平(abc)的roc分析。
图5显示了作为dcr潜在预测因素的外周t细胞计数的roc分析。
图6说明外周nk细胞计数和外周nk细胞上的cd16表达水平是独立的变量，并不相关。
图7显示了具有特定基线特性和生物标记物的患者亚组中的dcr森林图(forestplot)。
图8显示了外周nk细胞计数为至少100个细胞/μl的患者和nk细胞计数更低的患者之间的无进展生存期差异。
图9显示了外周nk细胞上cd16表达为至少60,000abc的患者和nk细胞上cd16表达更低的患者之间的无进展生存期差异。
图10显示了外周t细胞计数为至少500个细胞/μl的患者和t细胞计数更低的患者之间的无进展生存期差异。
具体实施方式
术语“抗体”是指单克隆抗体，包括任意同种型，例如，igg、igm、iga、igd和ige。igg抗体包括通过二硫键互相连接的两个相同的重链和两个相同的轻链。每个重链和轻链均含有恒定区和可变区。每个可变区含有三个称作“互补决定区”(“cdr”)或“高变区”的片段，其主要负责与抗原表位结合。它们称作cdr1、cdr2和cdr3，其从n-端依次编号。可变区在cdr外部的更高度保守的部分称作“骨架区”。“抗体片段”是指fv、scfv、dsfv、fab、fab’f(ab’)2片段或其他片段，其含有至少一个各自含有cdr和骨架区的可变重链或可变轻链。
“vh”是指抗体或抗体片段的免疫球蛋白重链的可变区。“vl”是指抗体或抗体片段的免疫球蛋白轻链的可变区。
“fc区”是指抗体恒定区，其在人中可以是igg1、2、3、4亚类或其他的。人fc区的序列可获自imgt,humanighc-regions,www.imgt.org/imgtrepertoire/proteins/protein/human/igh/ighc/hu_ighcallgenes.html(2011年5月16日检索)。
术语患者包括人。
nhl是源自淋巴细胞的异质性恶性肿瘤。在美国(u.s.)，发病率预计在65,000/年，死亡人数大约为20,000(美国癌症协会(americancancersociety)，2006；和seercancerstatisticsreview)。该疾病可能在所有年龄发生，通常在40岁以上的成人中开始发作，发病率随着年龄增加。nhl的特征是淋巴结、血液、骨髓和脾中累积的淋巴细胞的克隆增殖，尽管其可以涉及到任何主要器官。目前病理学家和临床医生使用的分类系统是世界卫生组织(who)的肿瘤分类法，其将nhl组织成前体和成熟的b-细胞或t-细胞赘生物。pdq目前将nhl分成对于进入临床试验是惰性(indolent)的或侵袭性的。惰性nhl组主要包括滤泡亚型、小淋巴细胞性淋巴瘤、malt(粘膜相关淋巴样组织)和边缘区；惰性包括大约50％新诊断的b-细胞nhl患者。侵袭性nhl包括组织学诊断为原发性弥漫性大b细胞(dlbl、dlbcl或dlcl)(所有新诊断的患者中40％具有弥漫性大细胞)、burkitt's和套细胞的患者。nhl的临床过程是高度变化的。临床过程的主要决定因素是组织学亚型。大多数惰性型nhl被视作是不能治愈的疾病。患者最初对化学疗法或抗体疗法有反应，大多数将会复发。迄今的研究尚未表明早期干预对存活率的改善。在无症状的患者中，“观察并等待”是可接受的，直至患者表现出症状或疾病进展看起来在加速。随着时间的推进，疾病可以转化为更加侵袭性的组织型(histology)。中位存活期为8-10年，惰性型的患者在其疾病的治疗期间常常接受3次或更多次治疗。对有症状的惰性型nhl患者的初始治疗在历史上已经结合化学疗法进行。最常用的药物包括：环磷酰胺、长春新碱和强的松(cvp)；或环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松(chop)。大约70％到80％的患者将会对其初始的化疗有反应，缓解时间将会持续2-3年的量级。最终大多数患者会复发。抗-cd20抗体利妥昔单抗(rituximab)的发现和临床使用已经提供了反应和存活率的显著改善。目前大多数患者的护理标准是利妥昔单抗+chop(r-chop)或利妥昔单抗+cvp(r-cvp)。干扰素获准与烷基化药物结合用于nhl的最初治疗，但在美国的应用有限。利妥昔单抗疗法已经在若干种nhl显示出是有效的，目前获准作为惰性(滤泡性淋巴瘤)和侵袭性nhl(弥漫性大b细胞淋巴瘤)二者的一线治疗。但是，抗-cd20单克隆抗体(mab)有明显的局限性，包括原发性耐药(复发惰性患者中50％反应)、获得性耐药(再治疗时50％反应率)、罕有完全反应(复发群体中2％完全反应率)和连续的复发模式。最后，许多b细胞并不表达cd20，因此许多b-细胞障碍使用抗-cd20抗体疗法是不能治疗的。
除nhl以外，还有几种类型的由b细胞调节异常引起的白血病。慢性淋巴细胞性白血病(也称作“慢性淋巴细胞白血病”或“cll”)是一种b淋巴细胞异常累积造成的成人白血病。在cll中，恶性淋巴细胞可能看起来是正常和成熟的，但它们不能有效地应对感染。cll是成人中最常见的白血病形式。男性发展cll的可能性是女性的两倍。但是，关键风险因素是年龄。75％以上的新病例在年龄50岁以上的患者中诊断出。每年诊断出多于10,000例病例，死亡数为几乎5,000例每年(美国癌症协会，2006；和seercancerstatisticsreview)。cll是不能治愈的疾病，但大多数情况下进展缓慢。许多患有cll的人正常、积极地生活许多年。由于其发病缓慢，早期cll通常不予治疗，因为据信早期cll干预不会提高生存时间或生活质量。取而代之地，随时间对病情进行监控。初始的cll治疗取决于确切的诊断和疾病的发展而变化。有数十种药物用于cll治疗。组合化疗方案例如fcr(氟达拉滨(fludarabine)、环磷酰胺和利妥昔单抗)和br(依鲁替尼和利妥昔单抗)在新诊断的和复发的cll中均有效。异基因骨髓(干细胞)移植由于其风险性极少作为cll一线治疗使用。
另一种类型的白血病是小淋巴细胞淋巴瘤(sll)，其被认为是缺少cll诊断所要求的克隆淋巴细胞增多的cll变种，但也共享着病理学和免疫表型特征(campo等人,2011)。sll的定义要求存在有淋巴结病和/或脾肿大。而且，外周血中的b淋巴细胞数目不应超过5x109/l。在sll中，只要可能，应当通过淋巴结活检的组织病理学评价确认诊断(hallek等人,2008)。在美国，sll的发生率为cll的大约25％(dores等人,2007)。
另一种类型的白血病是急性成淋巴细胞性白血病(all)，也称作急性淋巴细胞性白血病。all的特征是骨髓中的恶性、不成熟的白细胞(也称作成淋巴细胞)过度产生和连续增殖。“急性”是指循环的淋巴细胞(“胚细胞”(blasts))的未分化、不成熟的状态，以及疾病迅速发展，如果不予治疗预期寿命为数周至数月。all最常见于儿童，发病高峰为年龄4-5岁。年龄12-16岁的儿童更易死于该病。目前，至少80％的儿童all被视为是可治愈的。每年诊断出少于4,000例病例，死亡数为几乎1,500例每年(美国癌症协会，2006；和seercancerstatisticsreview)。
在wo2007076950(us2007154473)中讨论了cd19抗体在非特异性b细胞淋巴瘤中的用途，这两篇文献均通过引用并入。在scheuermann等人的“cd19antigeninleukemiaandlymphomadiagnosisandimmunotherapy,leukemiaandlymphoma,vol.18,385-397(1995)”中描述了在cll、nhl和all中使用cd19抗体，其通过引用整体并入。
在wo2005012493(us7109304)、wo2010053716(us12/266,999)(immunomedics)；wo2007002223(us8097703)(medarex)；wo2008022152(12/377,251)和wo2008150494(xencor)、wo2008031056(us11/852,106)(medimmune)；wo2007076950(us11/648,505)(merckpatentgmbh)；wo2009/052431(us12/253,895)(seattlegenetics)；以及wo2010095031(12/710,442)(glenmarkpharmaceuticals)、wo2012010562和wo2012010561(internationaldrugdevelopment)、wo2011147834(rocheglycart)和wo2012/156455(sanofi)中描述了另外的cd19特异性的抗体，它们全部通过引用整体并入。
术语“cd19”是指称作cd19的蛋白，其具有以下同义词：b4、b-淋巴细胞抗原cd19、b-淋巴细胞表面抗原b4、cvid3、分化抗原cd19、mgc12802和t细胞表面抗原leu-12。
人cd19具有以下氨基酸序列：
“mor00208”是抗cd19抗体。可变结构域的氨基酸序列提供于图1中。mor00208的重链和轻链fc区的氨基酸序列提供于图2中。“mor00208”和“xmab5574”作为同义词使用，描述图1和2所示的抗体。mor00208抗体描述于美国专利申请第12/377,251号中，在此将其全文并入作为参考。
美国专利申请第12/377,251号描述了名为4g7h1.52hybrids239d/i332e/4g7l1.155的如下抗体(之后称作mor00208)：
药物组合物包含活性剂，例如一种用于人类治疗的抗体。药物组合物可以额外包含药学可接受的载体或赋形剂。
“给予”或“给药”是指将药物组合物通过可注射形式例如静脉内、肌内、皮内或皮下途径或黏膜途径，例如，作为鼻喷雾或吸入用气溶胶或作为可消化溶液、胶囊或片剂递送。
根据本公开内容给予的抗体以治疗有效量对患者给药。“治疗有效量”是指足以为指定疾病或病症的临床表现提供一定改善的量。例如，示例研究中的患者接受每周一次12mg/kgmor00208的剂量，维持每两周或每月一次。
对于特定治疗目的来说有效的量将取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的体重和一般状况。应当理解到，通过构建数值矩阵并测试矩阵中的不同点，使用常规试验可以实现适当剂量的确定，其均在经过训练的医师或临床科学家普通技能范围以内。
基线是指在给予期望的治疗之前。例如，在给予期望的抗cd19抗体之前。
使用接受者操作特性(receiveroperatingcharacteristic)(roc)分析对预测性、敏感性和特异性进行分析，并确定潜在生物标记物例如nk细胞计数、nk细胞上的cd16表达水平和t细胞计数的截止量(cut-off)。另外存在有以下方法用于估测优化的截止水平：a)“max.accuracy”–使精确度最高的截止量；b)“max.dor”–使诊断优势比最大的截止量；c)“error.rate”–使错误率最低的截止量；d)“max.accuracy.area”–使精度面积最大的截止量；e)“max.sens+spec”–使敏感度与特异性的总量最高的截止量；f)“max.youden”–使youden指数最大的截止量；g)“se＝sp”–敏感性＝特异性的截止量；h)“min.roc.dist”–使曲线和图像左上角之间的距离最小的截止量；i)“max.efficiency”–使效率最大的截止量；和j)“min.mct”–使误分类代价项最小的截止量。参见lopez-raton,m.,rodriguez-alvarez,m.x,cadarso-suarez,c.和gude-sampedro,f.(2014).optimalcutpoints:anrpackageforselectingoptimalcutpointsindiagnostictests.journalofstatisticalsoftware61(8),1-36。
cd19特异性抗体已经联合其他药物进行了临床前测试。例如，mor00208已经联合氮芥(nitrogenmustards)、嘌呤类似物、沙利度胺类似物、磷酸肌醇3-激酶抑制剂、bcl-2抑制剂和布鲁顿氏(bruton's)酪氨酸激酶(btk)抑制剂进行了测试。
“氮芥”是用作化疗的非特异性dna烷基化药剂。烷基化药剂在核酸碱基上增加烷基(cnh2n+1)，例如，在dna的鸟嘌呤碱基上在咪唑环7位氮原子上增加烷基。烷基化步骤导致形成链间交联(icl)。这些icl是高度细胞毒性的，因为它们阻断了基本的代谢过程，例如复制和转录。氮芥包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、乌拉莫司汀(uramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)和苯达莫司汀(bendamustine)。
苯达莫司汀由mundipharmainternationalcorporationlimited(astellaspharmagmbh许可)以及cephalon以
嘌呤类似物为抗代谢物，其模拟代谢嘌呤的结构，从而干扰核酸的合成。例如，氟达拉滨可以通过取代嘌呤核苷酸腺嘌呤和鸟嘌呤并入到dna和rna中。嘌呤类似物抑制个体的快速增殖细胞例如癌细胞、骨髓细胞或胃肠道中存在的细胞的生长。嘌呤类似物包括巯基嘌呤、硫唑嘌呤、硫鸟嘌呤和氟达拉滨。氟达拉滨或磷酸氟达拉滨
“沙利度胺(thalidomide)类似物”包括，但不限于，沙利度胺本身、来那度胺(cc-5013，revlimidtm)、泊马度胺(pomalidomide)(cc4047，actimidtm)和wo2002068414和wo2005016326中公开的化合物，在此将其均全文并入作为参考。该术语是指使用沙利度胺结构作为骨架的合成化合物(例如，添加侧基，或者这些侧基从母体结构中删除)。类似物与沙利度胺及其代谢化合物在结构上不同，例如，烷基链长度、分子片段有差异，一个或多个官能团，或者离子化有变化。术语“沙利度胺类似物”也包括沙利度胺的代谢物。沙利度胺类似物包括各个化合物的s-和r-对映异构体的外消旋混合物，或者分别的s-对映异构体或r-对映异构体。优选外消旋混合物。
沙利度胺类似物包括以下结构的化合物：
(a)来那度胺
“磷酸肌醇3-激酶抑制剂”是一类通过抑制一种或多种作为pi3k/akt/mtor通路一部分的磷酸肌醇3-激酶发挥作用的药物，上述通路是许多细胞功能例如生长控制、代谢和翻译起始的重要信号传导通路。
有若干种不同类型和同种型的pi3k。第1类pi3k具有称作p110的催化亚基，具有4种类型(同种型)——p110α、p110β、p110γ和p110δ。目前正在研究的抑制剂抑制一种或多种同种型的i类pi3k。
磷酸肌醇3-激酶抑制剂至少包括idelalisib、duvelisib和copanlisib。idelalisib由gileadsciences,inc.出售(商品名zydelig，也称作gs-1101或cal-101)。idelalisib目前被标记用于治疗复发性慢性淋巴细胞性白血病(cll)，与利妥昔单抗联合，用于由于其他伴随疾病而将单独的利妥昔单抗视作适当疗法的患者中；复发性滤泡性b-细胞非霍奇金氏淋巴瘤(fl)，用于已接受至少两种在先系统治疗的患者；复发性小淋巴细胞淋巴瘤(sll)，用于已接受至少两种在先系统治疗的患者。该物质起到磷酸肌醇3-激酶抑制剂的作用；更具体地，其阻断磷酸肌醇3-激酶的δ同种型p110δ。
idelalisib的分子式为：
“布鲁顿氏酪氨酸激酶(btk)抑制剂”是一类通过抑制在b细胞发育中发挥重要作用的酪氨酸-蛋白质激酶btk酶来发挥作用的药物。具体地，btk含有结合(3,4,5)三磷酸磷脂酰肌醇(pip3)的ph结构域。pip3结合诱导btk使磷脂酶c磷酸化，这进而使磷脂酰肌醇pip2水解成两种第二信使三磷酸肌醇(ip3)和二酰甘油(dag)，然后其继续在b细胞信号传导过程中调节下游蛋白质的活性。
布鲁顿氏酪氨酸激酶(btk)抑制剂包括依鲁替尼(ibrutinib)。依鲁替尼由pharmacyclics,inc和johnson&johnson'sjanssenpharmaceutical出售(商品名imbruvica，也称作pci-32765)。依鲁替尼目前被标记用于治疗已经接受至少一次在先治疗的具有套细胞淋巴瘤(mcl)的患者、已经接受至少一次在先治疗的慢性淋巴细胞性白血病(cll)患者、具有17p缺失的慢性淋巴细胞性白血病患者和
“bcl-2抑制剂”是一类通过抑制抗细胞凋亡的b细胞淋巴瘤-2(bcl-2)蛋白质、导致细胞的程序化细胞死亡而发挥作用的药物。bcl-2抑制剂包括维奈托克(venetoclax)。维奈托克由abbvieandgenentech出售(商品名venclextatm，也称作gdc-0199、abt-199和rg7601)。维奈托克目前被标记用于治疗已经接受至少一次在先治疗的具有17p缺失的慢性淋巴细胞性白血病(cll)的患者，其通过fda批准的测试检测。维奈托克的分子式为4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基-1-环己烯-1-基]甲基}-1-哌嗪基)-n-({3-硝基-4-[(四氢-2h-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺，并具有以下结构：
“维奈托克”、“abt”和“abt-199”在本文中作为同义词使用。实施方式
一方面是一种鉴定对抗cd19抗体治疗有反应的患有慢性淋巴细胞性白血病(cll)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、急性成淋巴细胞性白血病(all)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)的受试者的方法，所述方法包括：
a.在用所述抗cd19抗体治疗之前，提供获自所述受试者的样品，
b.测定所述样品中至少一种选自以下的生物标记物的水平：
i.外周nk细胞计数，和
ii.外周nk细胞上的cd16表达水平，
c.将所述样品中的所述至少一种生物标记物的水平与预定的截止水平(cutofflevel)进行比较，
其中所述至少一种生物标记物的水平等于或高于预定的截止水平是受试者将受益于抗cd19抗体治疗的指征。
在实施方式中，样品是血液样品。在实施方式中，所述样品包括外周nk细胞。
在实施方式中，所述生物标记物的预定的截止水平为至少50个细胞/μl、至少75个细胞/μl、至少100个细胞/μl、至少125个细胞/μl、至少150个细胞/μl、至少175个细胞/μl、至少200个细胞/μl、至少225个细胞/μl或者至少250个细胞/μl的基线外周nk细胞计数。在实施方式中，所述生物标记物的预定的截止水平为至少45,000abc、至少60,000abc、至少75,000abc或至少90,000abc的外周nk细胞上的基线cd16表达水平。
在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量(cutoff)为：
a.基线外周nk细胞计数为至少50个细胞/μl，或者
b.外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)。
在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量为：
a.基线外周nk细胞计数为至少50个细胞/μl，并且
b.外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)。
在实施方式中，预定截止水平为基线外周nk细胞计数至少50个细胞/μl。在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量为外周nk细胞上的基线cd16表达水平至少60,000(abc)。
在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量为：
a.基线外周nk细胞计数为至少70个细胞/μl，或者
b.外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)。
在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量为：
a.基线外周nk细胞计数为至少70个细胞/μl，并且
b.外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)。
在实施方式中，预定截止水平为基线外周nk细胞计数至少70个细胞/μl。在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量为外周nk细胞上的基线cd16表达水平至少60,000(abc)。
在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量为：
a.基线外周nk细胞计数为至少80个细胞/μl，或者
b.外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)。
在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量为：
a.基线外周nk细胞计数为至少80个细胞/μl，并且
b.外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)。
在实施方式中，预定截止水平为基线外周nk细胞计数至少80个细胞/μl。在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量为外周nk细胞上的基线cd16表达水平至少60,000(abc)。
在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量为：
a.基线外周nk细胞计数为至少90个细胞/μl，或者
b.外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)。
在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量为：
a.基线外周nk细胞计数为至少90个细胞/μl，并且
b.外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)。
在实施方式中，预定截止水平为基线外周nk细胞计数至少90个细胞/μl。在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量为外周nk细胞上的基线cd16表达水平至少60,000(abc)。
在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量为：
a.基线外周nk细胞计数为至少100个细胞/μl，或者
b.外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)。
在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量为：
a.基线外周nk细胞计数为至少100个细胞/μl，并且
b.外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)。
在实施方式中，预定截止水平为基线外周nk细胞计数至少100个细胞/μl。在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量为外周nk细胞上的基线cd16表达水平至少60,000(abc)。
一方面是一种鉴定对抗cd19抗体治疗有反应的患有慢性淋巴细胞性白血病(cll)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、急性成淋巴细胞性白血病(all)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)的受试者的方法，所述方法包括：
a.在用所述抗cd19抗体治疗之前，提供获自所述受试者的血液样品，
b.测定所述样品中至少一种选自以下的生物标记物的水平：
i.外周nk细胞计数，和
ii.外周nk细胞上的cd16表达水平，
c.将所述样品中的所述至少一种生物标记物的水平与预定的截止水平进行比较，
其中基线外周nk细胞计数为至少50个细胞/μl、至少60个细胞/μl、至少70个细胞/μl、至少80个细胞/μl、至少90个细胞/μl或至少100个细胞/μl，外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)，其中抗cd19抗体包括：包括序列syvmh(seqidno:1)的hcdr1区、包括序列npyndg(seqidno:2)的hcdr2区、包括序列gtyyygtrvfdy(seqidno:3)的hcdr3区、包括序列rsskslqnvngntyly(seqidno:4)的lcdr1区、包括序列rmsnlns(seqidno:5)的lcdr2区和包括序列mqhleypit(seqidno:6)的lcdr3区。
一方面是一种鉴定对抗cd19抗体治疗有反应的患有慢性淋巴细胞性白血病(cll)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、急性成淋巴细胞性白血病(all)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)的受试者的方法，所述方法包括：
a.在用所述抗cd19抗体治疗之前，提供获自所述受试者的血液样品，
b.测定所述样品中至少一种选自以下的生物标记物的水平：
i.外周nk细胞计数，和
ii.外周nk细胞上的cd16表达水平，
c.将所述样品中的所述至少一种生物标记物的水平与预定的截止水平进行比较，
其中基线外周nk细胞计数为至少100个细胞/μl，或者外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)，并且其中抗cd19抗体包括：包括序列syvmh(seqidno:1)的hcdr1区、包括序列npyndg(seqidno:2)的hcdr2区、包括序列gtyyygtrvfdy(seqidno:3)的hcdr3区、包括序列rsskslqnvngntyly(seqidno:4)的lcdr1区、包括序列rmsnlns(seqidno:5)的lcdr2区和包括序列mqhleypit(seqidno:6)的lcdr3区。
在实施方式中，所述生物标记物的预定截止量为：
a.基线外周nk细胞计数为至少100个细胞/μl，并且
b.外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)。
在实施方式中，所述生物标记物的预定的截止水平为至少50个细胞/μl、至少75个细胞/μl、至少100个细胞/μl、至少125个细胞/μl、至少150个细胞/μl、至少175个细胞/μl、至少200个细胞/μl、至少225个细胞/μl或者至少250个细胞/μl的基线外周nk细胞计数。在实施方式中，所述生物标记物的预定的截止水平为至少45,000abc、至少60,000abc、至少75,000abc或至少90,000abc的外周nk细胞上的基线cd16表达水平。
一方面是一种用抗cd19抗体治疗患有慢性淋巴细胞性白血病(cll)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、急性成淋巴细胞性白血病(all)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)的患者的方法，该方法包括：
a.获取患者的基线外周nk细胞计数，或者患者的外周nk细胞上的基线cd16表达水平，和
b.将有效量的抗cd19抗体给予基线外周nk细胞计数为至少50个细胞/μl、至少60个细胞/μl、至少70个细胞/μl、至少80个细胞/μl、至少90个细胞/μl或至少100个细胞/μl或者外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)的患者。
一方面是一种用抗cd19抗体治疗患有慢性淋巴细胞性白血病(cll)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、急性成淋巴细胞性白血病(all)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)的患者的方法，该方法包括：
a.获取患者的基线外周nk细胞计数，或者患者的外周nk细胞上的基线cd16表达水平，和
b.将有效量的抗cd19抗体给予基线外周nk细胞计数为至少100个细胞/μl或者外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)的患者。
在实施方式中，用抗cd19抗体治疗患有慢性淋巴细胞性白血病(cll)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、急性成淋巴细胞性白血病(all)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)的患者的方法包括：
a.获取患者的基线外周nk细胞计数，和
b.将有效量的抗cd19抗体给予nk细胞计数为至少50个细胞/μl、至少60个细胞/μl、至少70个细胞/μl、至少80个细胞/μl、至少90个细胞/μl或至少100个细胞/μl的患者。
在实施方式中，用抗cd19抗体治疗患有慢性淋巴细胞性白血病(cll)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、急性成淋巴细胞性白血病(all)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)的患者的方法包括：
a.获取患者的基线外周nk细胞计数，和
b.将有效量的抗cd19抗体给予nk细胞计数为至少50个细胞/μl、至少60个细胞/μl、至少70个细胞/μl、至少80个细胞/μl、至少90个细胞/μl或至少100个细胞/μl的患者。
在实施方式中，用抗cd19抗体治疗患有慢性淋巴细胞性白血病(cll)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、急性成淋巴细胞性白血病(all)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)的患者的方法包括：
a.获取患者的基线外周nk细胞计数，和
b.将有效量的抗cd19抗体给予nk细胞计数为至少100个细胞/μl的患者。
在实施方式中，用抗cd19抗体治疗患有慢性淋巴细胞性白血病(cll)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、急性成淋巴细胞性白血病(all)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)的患者的方法包括：
a.获取患者的外周nk细胞上的基线cd16表达水平，和
b.将有效量的抗cd19抗体给予nk细胞上的cd16水平为至少60,000(abc)的患者。
在实施方式中，将抗cd19抗体给予基线外周nk细胞计数为至少50个细胞/μl、至少60个细胞/μl、至少70个细胞/μl、至少80个细胞/μl、至少90个细胞/μl或至少100个细胞/μl并且外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)的患者。
在实施方式中，将抗cd19抗体给予基线外周nk细胞计数为至少100个细胞/μl并且外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)的患者。
在实施方式中，将抗cd19抗体给予基线外周nk细胞计数为至少50个细胞/μl、至少75个细胞/μl、至少100个细胞/μl、至少125个细胞/μl、至少150个细胞/μl、至少175个细胞/μl、至少200个细胞/μl、至少225个细胞/μl或至少250个细胞/μl的患者。在实施方式中，将抗cd19抗体给予外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少45,000abc、至少60,000abc、至少75,000abc或至少90,000abc的患者。
一方面是一种用抗cd19抗体治疗患有慢性淋巴细胞性白血病(cll)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、急性成淋巴细胞性白血病(all)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)的患者的方法，所述方法包括：
a.在用所述抗cd19抗体治疗之前，提供获自所述受试者的样品，
b.测定所述样品中至少一种选自以下的生物标记物的水平：
i.外周nk细胞计数，和
ii.外周nk细胞上的cd16表达水平，
c.将所述样品中的所述至少一种生物标记物的水平与预定的截止水平进行比较，
d.将有效量的抗cd19抗体给予外周nk细胞计数为至少100个细胞/μl并且外周nk细胞上的cd16表达水平为至少60,000(abc)的患者。
一方面是一种治疗患有慢性淋巴细胞性白血病(cll)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、急性成淋巴细胞性白血病(all)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)的患者的方法，其包括：
如果
a.患者的基线外周nk细胞计数为至少100个细胞/μl，或者
b.外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)，
则将有效量的抗cd19抗体给予患者。
一方面是一种治疗患有慢性淋巴细胞性白血病(cll)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、急性成淋巴细胞性白血病(all)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)的患者的方法，其包括：
a.获取患者的外周nk细胞计数，
b.将有效量的抗cd19抗体给予外周nk细胞计数为至少100个细胞/μl的患者。
一方面是一种治疗患有慢性淋巴细胞性白血病(cll)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、急性成淋巴细胞性白血病(all)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)的患者的方法，其包括：
a.获取患者的外周nk细胞上的cd16表达水平，
b.将有效量的抗cd19抗体给予外周nk细胞上的cd16表达水平为至少60,000(abc)的患者。
在实施方式中，将抗cd19抗体给予基线外周nk细胞计数为至少100个细胞/μl、并且外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少60,000(abc)的患者。在实施方式中，将抗cd19抗体给予基线外周nk细胞计数为至少50个细胞/μl、至少75个细胞/μl、至少100个细胞/μl、至少125个细胞/μl、至少150个细胞/μl、至少175个细胞/μl、至少200个细胞/μl、至少225个细胞/μl或至少250个细胞/μl的患者。在实施方式中，将抗cd19抗体给予外周nk细胞上的基线cd16表达水平为至少45,000abc、至少60,000abc、至少75,000abc或至少90,000abc的患者。
在实施方式中，基线外周nk细胞计数或外周nk细胞上的基线cd16水平(abc)获自取自患者的血液样品。在实施方式中，在给予抗cd19抗体之前，测量外周nk细胞计数和/或cd16表达水平(abc)。
在实施方式中，cd19特异性抗体包括：包括序列syvmh(seqidno:1)的hcdr1区、包括序列npyndg(seqidno:2)的hcdr2区、包括序列gtyyygtrvfdy(seqidno:3)的hcdr3区、包括序列rsskslqnvngntyly(seqidno:4)的lcdr1区、包括序列rmsnlns(seqidno:5)的lcdr2区和包括序列mqhleypit(seqidno:6)的lcdr3区。
在实施方式中，基线外周nk细胞计数或外周nk细胞上的基线cd16表达水平获自取自患者的血液样品。
在实施方式中，患者患有非霍奇金氏淋巴瘤。在实施方式中，非霍奇金氏淋巴瘤选自滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织、边缘区、弥散性大b细胞、伯基特氏和套细胞。在实施方式中，非霍奇金氏淋巴瘤是滤泡性淋巴瘤。在实施方式中，非霍奇金氏淋巴瘤是惰性非霍奇金氏淋巴瘤。在实施方式中，非霍奇金氏淋巴瘤是小淋巴细胞淋巴瘤。在实施方式中，非霍奇金氏淋巴瘤是黏膜相关淋巴组织。在实施方式中，非霍奇金氏淋巴瘤是边缘区淋巴瘤。在实施方式中，非霍奇金氏淋巴瘤是弥散性大b细胞淋巴瘤。在实施方式中，非霍奇金氏淋巴瘤是伯基特氏淋巴瘤。在实施方式中，非霍奇金氏淋巴瘤是套细胞淋巴瘤。在实施方式中，患者患有慢性淋巴细胞性白血病。在实施方式中，患者患有急性成淋巴细胞性白血病。在实施方式中，患者患有小淋巴细胞淋巴瘤(sll)。
在实施方式中，治疗产生选自疾病控制率(dcr)和无进展生存期更长的治疗效果。
在实施方式中，治疗进一步包括给予有效量的氮芥。在实施方式中，该氮芥是苯达莫司汀。在实施方式中，治疗进一步包括给予有效量的嘌呤类似物。在实施方式中，嘌呤类似物是氟达拉滨。在实施方式中，治疗进一步包括给予有效量的布鲁顿氏酪氨酸激酶(btk)抑制剂。在实施方式中，布鲁顿氏酪氨酸激酶(btk)抑制剂是依鲁替尼。在实施方式中，治疗进一步包括给予有效量的磷酸肌醇3-激酶抑制剂。在实施方式中，磷酸肌醇3-激酶抑制剂是idelalisib。在实施方式中，治疗进一步包括给予有效量的沙利度胺类似物。在实施方式中，沙利度胺类似物是来那度胺。在实施方式中，治疗进一步包括给予有效量的bcl-2抑制剂。在实施方式中，bcl-2抑制剂是维奈托克。
由于示例的抗cd19抗体和其他的抗cd19抗体与cd19结合，据信用其他的抗cd19抗体可以得到类似的结果。其他抗cd19抗体描述于美国专利申请第12/377,251号(xencor)、wo2005012493、wo2010053716(immunomedics)；wo2007002223(medarex)；wo2008022152(xencor)；wo2008031056(medimmune)；wo2007/076950(merckpatentgmbh)；wo2009/052431(seattlegenetics)；和wo2010095031(glenmarkpharmaceuticals)中，在此将其均全文并入作为参考。
在实施方式中，cd19特异性抗体包括与包括以下的抗体交叉竞争的抗体：包括序列syvmh(seqidno:1)的hcdr1区、包括序列npyndg(seqidno:2)的hcdr2区、包括序列gtyyygtrvfdy(seqidno:3)的hcdr3区、包括序列rsskslqnvngntyly(seqidno:4)的lcdr1区、包括序列rmsnlns(seqidno:5)的lcdr2区和包括序列mqhleypit(seqidno:6)的lcdr3区。
在实施方式中，cd19特异性抗体包括与包括以下的抗体结合相同表位的抗体：包括序列syvmh(seqidno:1)的hcdr1区、包括序列npyndg(seqidno:2)的hcdr2区、包括序列gtyyygtrvfdy(seqidno:3)的hcdr3区、包括序列rsskslqnvngntyly(seqidno:4)的lcdr1区、包括序列rmsnlns(seqidno:5)的lcdr2区和包括序列mqhleypit(seqidno:6)的lcdr3区。
在实施方式中，cd19特异性抗体包括序列syvmh(seqidno:1)的hcdr1区、序列npyndg(seqidno:2)的hcdr2区、序列gtyyygtrvfdy(seqidno:3)的hcdr3区、序列rsskslqnvngntyly(seqidno:4)的lcdr1区、序列rmsnlns(seqidno:5)的lcdr2区和序列mqhleypit(seqidno:6)的lcdr3区。
在实施方式中，cd19特异性抗体包括序列evqlvesggglvkpggslklscaasgytftsyvmhwvrqapgkglewigyinpyndgtkynekfqgrvtissdksistaymelsslrsedtamyycargtyyygtrvfdywgqgtlvtvss(seqidno:10)的可变重链和序列divmtqspatlslspgeratlscrsskslqnvngntylywfqqkpgqspqlliyrmsnlnsgvpdrfsgsgsgteftltisslepedfavyycmqhleypitfgagtkleik(seqidno:11)的可变轻链。
在实施方式中，所述抗体包括序列astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpdvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkalpapeektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:12)的重链恒定区。
在实施方式中，cd19特异性抗体包括序列rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:13)的轻链恒定区。
在实施方式中，cd19特异性抗体包括序列为evqlvesggglvkpggslklscaasgytftsyvmhwvrqapgkglewigyinpyndgtkynekfqgrvtissdksistaymelsslrsedtamyycargtyyygtrvfdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpdvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkalpapeektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:8)的重链。
在实施方式中，cd19特异性抗体包括序列为divmtqspatlslspgeratlscrsskslqnvngntylywfqqkpgqspqlliyrmsnlnsgvpdrfsgsgsgteftltisslepedfavyycmqhleypitfgagtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:9)的轻链。
实施方式包括药物组合物。在实施方式中，组合物包括可接受的载体。在实施方式中，组合物以有效的量给药。
实施例
实施例1：t细胞和nk细胞计数
mor00208c201临床研究的范围包括对若干探索性生物标记物的评价。作为该首创方案的一部分，在临床基地进行基线外周t和nk细胞的计数。
t细胞是一类在细胞介导的免疫力中发挥中心作用的淋巴细胞(白血球亚型)。通过细胞表面上t-细胞受体的存在，它们可以与其他淋巴细胞例如b细胞和nk细胞区分开。
天然杀伤细胞或nk细胞是一类对于先天免疫系统来说至关重要的细胞毒性淋巴细胞。nk细胞对病毒感染的细胞提供迅速反应，在感染后大约3天发挥作用，并对病毒形成有反应。典型地，免疫细胞检测到感染细胞表面上存在的主要组织相容性复合物(mhc)，触发细胞因子释放，导致细胞溶解或细胞凋亡。但是，nk细胞是独特的，因为其具有在不存在抗体和mhc的情况下识别应激细胞的能力，允许快得多的免疫反应。
材料和方法
tritestcd3fitc/cd16+cd56pe/cd45percp(用trucount管)：bdbiosciences,cat:340403(us)；342442(europe)。能够配送20μl、50μl和450μl的移液器和吸量管尖：gilsoninc。facs裂解液：bdbiosciences,cat:349202
仪器：流式细胞仪，旋涡混匀仪(vortex)
流式细胞术背景
将全血用特异性结合白细胞表面抗原的荧光染料标记的抗体(tritest试剂)染色。细胞穿过激光束，并散射激光。染色的细胞发出荧光。仪器检测到的这些散射和荧光信号提供了有关细胞大小、内部复杂性和相对荧光强度的信息。tritest试剂使用荧光触发，允许对nk-和t-细胞淋巴细胞种群的直接荧光设门(gating)，以降低门(gate)中未裂解或成核的红血球的污染。
染色
对于每个患者样品，将trucount管用样品标识号标记。将20μltritestcd3/cd16+cd56/cd45试剂移液至管底。将50μl充分混合的抗凝血全血移液至管底中。室温下(20-25℃)储存的抗凝血血液(edta)必须在抽出24小时内染色，并在染色6小时内(保持在室温下，避光)进行分析。将管轻轻涡旋以混合。将管在室温下(20-25℃)在暗处孵育15分钟。向管中加入450μl1xfacs裂解液。将管涡旋，并在室温下(20-25℃)在暗处再孵育15分钟。
使用trucount管，将已知体积的样品直接在trucount管中染色。冻干小球在管中溶解，释放出已知数量的荧光珠。在分析过程中，通过将细胞事件数(cellevents)与珠事件数(beadevents)比较，可以确定样品中阳性细胞的绝对数量(细胞/μl)。
流式细胞术
在将细胞在流式细胞仪上运行之前，将其(低速)彻底涡旋，以减少聚集。
数据分析
目测检查cd45相对于ssc的点图。淋巴细胞呈现为明亮、紧凑的细胞群体，具有低至中等ssc。单核细胞(m)和粒细胞(g)呈现为是不同的群体。当单核细胞和淋巴细胞显示清楚的分离之后完成分析。
淋巴细胞首先设门为cd45阳性、低ssc的细胞群体。cd16/cd56相对于cd3加以预选。t-细胞(t)应当呈现为紧凑、明亮的cd3阳性聚簇。nk-细胞(nk)应当呈现为紧凑、明亮的cd16/cd56阳性聚簇。完成设门，并对t和nk细胞进行计数。
在没有任何预选设门的情况下使用cd16/cd56相对于cd3的图进行珠事件计数。珠应当呈现为pe/fitc双阳性聚簇。
计算绝对计数
通过将细胞事件数与珠事件数进行比较，确定样品中t细胞或nk细胞的绝对数量(细胞/μl血液)。进行multiset软件或手动(使用cellquest或其他软件)数据分析。对于手动计数，将获得的阳性细胞事件数(#)除以获得的珠事件数(#)，然后乘以(总的trucount珠计数(依赖于批次(lotdependent))除以全血样品体积50μl)。结果是绝对细胞数量/微升。
方程：
实例：
实施例2：nk细胞上的cd16定量
作为mor00208c201临床研究的一部分，通过iconcentrallaboratories(farmingdale,newyork)集中对外周nk细胞上的cd16(探索性生物标记物)进行定量。
材料和方法
抗体：cd45amcyan(clone2d1,bdbiosciences,cat#339192)；cd3fitc(cloneucht1,biolegend,cat#300406)；小鼠iggfitc(克隆mopc-21,biolegend,cat#400110)；cd16pe(克隆3g8,biolegend,cat#302008)；mor00208；小鼠iggpe(小鼠mopc-21,biolegend,cat#400114)；cd56percp-cy5.5(克隆hcd56,biolegend,cat#318322)；和小鼠iggpercp-cy5.5(克隆mopc-21,biolegend,cat#400150)。
材料：pharmatherm隔热包装(intelsius,catalog#pht014)；bd
装置：离心机(冷藏能力)；labquake(管振荡器)；涡旋混合器；层流净化罩；孵育器(设定在37℃，5％co2)；advia(细胞计数器)；bdfacscantoii流式细胞仪；desi-vactm容器，1.5升(vwr,cat#62344-930)；humidityspongetmindicating(vwr,cat#61161-319)；和traceablehumidity-on-a-card(vwr,cat#15551-012)。
表1.pbmc(外周血单核细胞)cd16定量检验组
pbmc制备和标记方法
将患者外周血收集在cpt管中，并在隔热包装中连夜从临床基地运送至中心实验室。将cpt管在rt下以1800xg离心25分钟，制动打开。离心之后，将cpt管立即倒立，并在labquake上放置10分钟，以将pbmc层再悬浮在自体血浆中，并溶解大多数形成的细胞聚集物。在无菌条件下，将均化的pbmc/血浆悬液缓慢倾析至50ml无菌锥形管顶部静置的100μm细胞过滤器(cellstrainer)中心。将等体积1xdpbs加入到15ml锥形管中的pbmc/血浆悬液(大约4ml)中。将管在4℃下以300xg离心10分钟，并除去上清液。将管涡旋，以使细胞团块再悬浮。将细胞团块用dbps洗涤，离心，除去上清液，并通过涡旋再悬浮。将洗涤过的pbmc悬液加入到含有1μlvivid储液艾本德微量离心管中；在冰上孵育15分钟，保持于暗处(用铝箔覆盖)。将染色的vividpbmc转染到新标记的锥形管中，然后加入冰冷的facs缓冲液。将细胞离心，再次涡旋，用于再悬浮。将聚苯乙烯离心管标记用于每个样品(表1)。将抗体或同种型对照抗体加入到适当的管中。向每个管中加入等份的vivid染色pbmc(表1)。将管涡旋并孵育。加入facs缓冲液，将细胞离心，并再次涡旋，用于再悬浮。加入bdpharmlyse裂解缓冲液，将细胞涡旋，离心，并抽取，以除去上清液，再次涡旋，以再悬浮。再次加入facs缓冲液，将细胞离心，再次涡旋，用于再悬浮。然后将样品获得至facscantoii血细胞计数器，由标准化mfi推测abc(每细胞结合的抗体(antibodiesboundpercell))，如以下文献中所述：iyers等人,expressionofcd69onactivatedtcellsusingr-phycoerythrinlabeledbeads,cytometry,1996；#ac78(suppl.8):113和iyers.等人,quantibrite:anewstandardforfluorescencequantitation,bectondickinsonimmunocytometrysystems,sanjose,ca.1997.whitepaper。
实施例3：nhl试验
clinicaltrials.gov标识号为nct01685008的fc-优化的抗cd19抗体(mor00208)治疗非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)的研究(thestudyoffc-optimizedanti-cd19antibody(mor00208)totreatnon-hodgkin′slymphoma(nhl))不再招募。
入选标准如下：
1.年龄≥18岁的男性或女性患者。
2.根据real/who分类在组织学上确诊，具有以下b细胞淋巴瘤：a.fl，b.mcl，c.dlbcl，d.其他惰性nhl(例如，mzl/malt)。
3.患者nhl必须在至少1次在先含有利妥昔单抗的方案之后已进展。
4.一个经核磁共振成像(mri)或计算机断层摄影术(ct)扫描的可测量疾病部位，定义为至少一处测量为至少1.5×1.5cm的病变，以下情况例外：对于仅mcl的患者，疾病不可测量、但具有可评价部位(骨髓、脾、外周血、胃肠道)的患者可以招募。
5.之前接受过自体干细胞移植的患者必须移植后至少4周方可给予研究药物，并且必须已经表现出血液学上的完全复原。
6.不连续的在先单克隆抗体治疗(利妥昔单抗除外)或给予放射免疫疗法至少60天之后方可给予研究药物。
7.停止利妥昔单抗至少14天，方可筛选访视，并确认在利妥昔单抗治疗之后无反应或者具有疾病进展。
8.dlbcl患者在基线处具有阳性[18f]氟脱氧葡萄糖-正电子发射断层摄影术(fdg-pet)扫描(cheson反应标准)。
9.预测生存期>3个月。
10.ecog性能状态<3。
11.筛选时的实验室标准：a)绝对嗜中性粒细胞计数(anc)≥1.0(1000/mm3)。b)血小板计数≥75×109/l，在第一次给予研究药物的10天内没有在先输血。c)血红蛋白≥8.0g/dl(可以经输血)。d)血清肌酸酐<2.0x正常值上限(uln)。e)总胆红素≤2.0×uln。f)丙氨酸转氨酶(alt)和天冬氨酸转氨酶(ast)≤2.5×uln。
12.如果女性有怀孕可能，登记之前必须确认妊娠测试阴性，使用双重障碍避孕，口服避孕药加屏障式避孕器，或者确认已经历临床证明的子宫全切术和/或卵巢切除术、输卵管结扎。
13.如果是男性，如果患者与有怀孕可能的女性性行为活跃，在研究期间以及最后一次剂量之后3个月，必须使用有效的屏障法避孕。
14.能够依从所有研究相关过程、药物使用和评价。
15.能够理解并给出书面知情同意书并依从研究方案。
排除标准如下：
1.筛选访视之前14天内用细胞毒性化疗、免疫治疗、放疗或其他淋巴瘤特异性疗法进行在先治疗，或者患者尚未从在先的淋巴瘤特异性治疗的副作用中恢复。
2.筛选访视之前28天内用系统性试验性药物治疗。
3.在先抗cd19抗体或片段治疗。
4.在先异体干细胞移植。
5.已知或疑似对研究药物制剂中含有的赋形剂有超敏反应。
6.临床上显著的心血管疾病或心机能不全、心肌症、先前存在的临床上显著的心律失常、登记3个月内急性心肌梗塞、登记3个月内心绞痛。
7.活动性乙肝或丙肝的临床或实验室证据。
8.hiv感染史。
9.在给予研究药物4周内要求积极的肠胃外抗生素治疗的任何活动性全身感染(病毒、真菌或细菌)。
10.目前用规定的皮质类固醇以外的免疫抑制剂治疗(不超过10-mg强的松当量)。
11.首次给予研究药物之前4周内大手术或放疗。
12.在研究者看来将阻止研究治疗的全身性疾病(心血管、肾、肝等)。
13.中枢神经系统(cns)、脑膜或硬脑膜外疾病包括脑转移瘤史或临床证据。
14.过去5年内其他原发性恶性肿瘤的积极治疗/化疗。
15.怀孕或哺乳期妇女，以及未使用可接受节育方法的有怀孕可能的妇女。
16.不依从于医疗方案史，或者认为可能不合作不可靠的患者。
患者用mor00208如下治疗。患者以两个28天的周期治疗，其中在第1、8、15和22天以12mg/kg的剂量给予mor00208。在两个周期结束时，病情稳定或更好的患者以第三个28天的周期治疗，应用与前两个周期相同的剂量和方案。第三个周期结束时，具有部分反应或更好的患者进入维持期。在维持期中，每14或28天以12mg/kg的剂量给予mor00208，直至疾病进展。
研究结束时，患者特性如下：
表2
dlbcl，弥散性大b-细胞淋巴瘤；ecogps，东部肿瘤协作组体能状态评分(easterncooperativeoncologygroupperformancestatus)；inhl，惰性非霍奇金氏淋巴瘤(包括滤泡性淋巴瘤和其他inhl)；mcl，套细胞淋巴瘤；mos，月。(％)
其他inhl是指异类组的没有进一步指明的惰性、非侵袭性的nhl类型，例如，边缘细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤和黏液相关淋巴组织(malt)淋巴瘤。
关键的首要和第二终点如下：
·首要：总反应率(orr)＝cr+pr
·第二：
○疾病控制率(dcr)＝cr+pr+sd
○无进展生存期(pfs)
表3：
数据为n(％)。*研究者评价。
该研究中的反应标准如表4所定义。其均基于国际工作组反应标准(internationalworkinggroupresponsecriteria)(2007)。
表4:反应标准
缩写：cr，完全缓解；fdg,[18f]氟脱氧葡萄糖；pet，正电子发射断层扫描；ct，计算机断层扫描；pr，部分缓解；spd，直径之积的和；sd，病情稳定；pd，病情进展
在该试验中，dcr(cr+pr+sd)被认为是患者特性和生物标记物分析中最相关的效力终点，因为大多数sd患者具有显著的目标病变减小，但研究的设计本身在第3个周期以外没有治疗。因此，具有sd的患者包括在分析中。
对患者的至少以下特性进行评价，以确定在用抗cd19抗体治疗的患者的特性和观察到的dcr之间是否存在相关性：a)年龄，b)性别，c)患者在最近6个月内是否接受利妥昔单抗剂量，d)患者是否是利妥昔单抗难治性的，e)患者是否具有fcγriiia高或低亲和力等位基因，f)患者是否具有fcγriia高或低亲和力等位基因，g)患者是否对之前的治疗有大于12个月的反应持续时间，h)基线外周t细胞计数(细胞/μl)，i)基线外周nk细胞计数(细胞/μl)，和j)外周nk细胞上的基线cd16表达(每细胞结合的抗体-abc)。
使用以上实施例1和实施例2对基线外周nk细胞计数、t细胞计数和外周nk细胞上的基线cd16表达进行评价。数据显示于表2中。
使用接受者操作特性(roc)分析对预测性、敏感性和特异性进行分析，并确定潜在生物标记物nk细胞计数、t细胞计数和外周nk细胞上的cd16表达水平(abc)的截止量。roc图显示了具有连续或分离顺序输出的二元分类法的表现。当输出阈值移动至在所有可能数值的范围上时，其显示敏感性(正确分类的阳性观察结果的比例)和特异性(正确分类的阴性观察结果的比例)。参见swetsja:therelativeoperatingcharacteristicinpsychology.science1973,182:990–1000；和pepems:thestatisticalevaluationofmedicaltestsforclassificationandprediction.oxford:oxforduniversitypress；2003。在roc语境中，曲线(auc)以下的面积度量的是分类方法(classifier)的性能，因此经常应用于方法的比较。auc越高，意味着分类越好。外周nk/t细胞计数和nk细胞上cd16表达的auc分别为0.66、0.53和0.61(图3、4和5)。
通常，确定截止量依赖于各个方法所涉及的目标。各种标准例如最大精确度、最大诊断优势比、最小误差率、最大敏感度和/或最大特异性将会导致确定不同的截止量。此外，更多这些标准例如敏感性和特异性之间的平衡也会导致确定特定的截止量。
因此，存在有若干种选择最优截止量的方法或标准，包括使精确度、敏感性+特异性、预测值、诊断概率比或患病率(prevalence)最大的方法。由于cd16表达-roc曲线的不对称性(参见图4)，大多数方法得到截止量为60,000abc(roc曲线和二等分线之间的距离最大的点)，但是，nk细胞计数roc曲线的对称性(参见图3)解释了为何当应用不同的方法时可以得到不同的最佳截止量数值。在该具体研究中，对于两种生物标记物，更多的权重分配给敏感性，因此，分别选择100个nk细胞/μl和60,000abc的cd16表达水平作为截止量，以在亚组内对dcr和pfs进行分析。对于外周t细胞计数，auc为0.53，roc曲线在任意特异性和敏感性数值处均与二等分线接近，因此，即使选择大于500个细胞/μl的不同截止量，对dcr和pfs亚组分析的阴性结果也没有影响。
截止量的确定也可以有利于敏感性或特异性而加以平衡。即使分配给敏感性更多权重来鉴定最优截止量，方法将会不同，预期nk细胞计数的截止量更低。在该情形中，确定截止量为至少50个nk细胞/μl。另外可选地，确定截止量为至少60个nk细胞/μl、至少70个nk细胞/μl、至少80个nk细胞/μl、至少90个nk细胞/μl或至少100个nk细胞/μl。
对于使所公开方法的特异性最大化，nk细胞计数的截止量增加，并被确定在至少100个nk细胞/μl直至至少150个nk细胞/μl之间。因此，对于特异性最大化，选择截止量为至少100个nk细胞/μl、至少110个nk细胞/μl、至少120个nk细胞/μl、至少130个nk细胞/μl、至少140个nk细胞/μl或至少150个nk细胞/μl。
在该具体研究中确定的截止量数值(100个nk细胞/μl和60,000abc的cd16表达水平)用于以下统计分析。
使用森林图分析所有患者特性和生物标记物，以确定各个特性与dcr之间的相关性。结果显示于图7中。基于不同患者特性及其与dcr相关性的森林图分析，在dlbcl和inhl患者中，以下特性显示了统计学上显著的差异：1)基线外周nk细胞计数大约100个细胞/μl和外周nk细胞上的基线cd16表达大约60,000abc(χ2未调节p值＝0.029/0.003)(图7)。
为了确保cd16表达和nk细胞计数是独立的特性，其不彼此影响，进行参数和非参数相关性分析。51位患者的cd16表达和nk细胞计数数据是可得的。皮尔逊相关系数(pearson′sr)为0.019，双尾p值0.9，斯皮尔曼相关系数(spearman′sr)为0.036，双尾p值0.8。结果图示于图6中。总之，在确定的阈值下cd16表达和nk细胞计数不相关，因此，将其视为完全独立的患者受益于mor00208治疗的可能性的指征。
发现以下特性不能预测dcr：a)年龄，b)性别，c)患者在最近6个月内是否接受利妥昔单抗的剂量，d)患者是否是利妥昔单抗难治性的，e)患者是否具有fcγriiia高或低亲和力等位基因，f)患者是否具有fcγriia高或低亲和力等位基因，g)患者是否对之前的治疗有大于12个月的反应持续时间，h)基线外周t细胞计数。参见图7。
1)基线外周nk细胞计数和2)外周nk细胞上的基线cd16表达二者均清楚地表现出与患者对mor00208治疗的反应的相关性。具体地，基线nk细胞计数为至少100个细胞/μl的患者与较高的疾病控制率(dcr)相关。dcr包括具有完全反应(cr)+部分反应(pr)+病情稳定(sd)的患者。此外，外周nk细胞上的基线cd16表达为至少60,000(abc)的患者与较高的疾病控制率(dcr)相关。
无进展生存期(pfs)是指疾病治疗期间以及之后患者带病生活但疾病不恶化的时间长度。这是另外的临床试验重要终点，以及患者中效力的指征。pfs在以下患者特性内进行比较：a)基线外周nk细胞计数为至少100个细胞/μl或更低，b)外周nk细胞上的基线cd16表达为至少60,000abc或更低，c)基线外周t细胞计数为至少500个细胞/μl或更低。结果显示于图8-10中。与nk细胞计数更低的患者相比较，nk细胞计数为至少100个细胞/μl的pfs比较患者表现出统计学上显著的差异，hr为0.1561(未调节对数秩p值＝0.0003)。这进一步证实了nk细胞计数在用mor00208治疗患有cll、nhl、all或sll的患者的反应的预测能力。
应当理解到，说明书、具体实施例和数据尽管指出了示例性的实施方式，但其仅为说明给出，无意于对本发明进行限定。从本文含有的讨论、公开内容和数据，本发明范围内的各种改变和修饰对本领域技术人员来说将会是显而易见的，因此视作是本发明的一部分。
序列表
<110>莫佛塞斯公司
<120>预测cd19抗体治疗在患者中的治疗益处的方法
<130>ms252
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<223>合成构建体
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