用于检测总VEGF-A的水平的方法和手段与流程
本发明涉及一种用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的方法,包含用于在vegf-a拮抗剂存在下检测vegf-a的手段的试剂盒,包含适合于在vegf-a拮抗剂存在下检测vegf-a的水平的第一和第二抗体的物质组合物,以及检测包含人vegf-a和非人或嵌合蛋白的复合物的方法。
发明背景
癌症是人类健康的最致命威胁之一。仅仅在美国,癌症每年侵袭近130万新患者,而且是位列心血管疾病之后的第二位死亡原因,占到大约4例死亡中的1例。实体瘤对大多数那些死亡负有责任。虽然某些癌症的医学治疗已经有显著进步,所有癌症的总体5年存活率在过去的20年中仅仅改善了约10％。癌症(或恶性肿瘤)以不受控制的方式快速生长和转移,使得及时检测和治疗极端困难。取决于癌症类型,患者典型地具有数个治疗选项是他们可得的,包括化学疗法,放射和基于抗体的药物。对于预测来自不同治疗方案的临床结局有用的诊断方法会大大有益于这些患者的临床管理。
现在完全确立了血管发生牵涉多种病症的发病机制。这些包括实体瘤,眼内新血管综合征,诸如增殖性视网膜病变或年龄相关黄斑变性(amd),类风湿性关节炎,20和银屑病(folkmanetal.,j.biol.chem.267:10931-10934(1992)；klagsbrunetal.,annu.rev.physiol.53:217-239(1991)；和gamera,vasculardiseases.in:pathobiologyofoculardisease.adynamicapproach.gamera,klintworthgk,eds.2ndedition(marceldekker,ny,1994),pp1625-1710)。在实体瘤的情况中,新血管形成容许肿瘤细胞与正常细胞相比获取生长优势和增殖自主性。因而,已经在肿瘤切片中微血管的密度和乳腺癌以及数种其它肿瘤中患者存活之间观察到关联(weidneretal.,n.engl.j.med.324:1-6(1991)；horaketal.,lancet340:1120-1124(1992)；和macchiarinietal.,lancet340:145-146(1992))。
已经确立了血管内皮生长因子(vegf)在调节正常和异常血管发生中的关键作用(ferraraetal.,endocr.rev.18:4-25(1997))。甚至一个vegf等位基因的丢失导致胚胎致死性的发现指向这种因子在血管系统的发育和分化中所起的不可代替的作用(ferrara等人,见上文)。还已经显示vegf是与肿瘤和眼内病症有关的新血管形成的关键介导物(ferrara等人,见上文)。vegfmrna由大多数所检查的人肿瘤过表达(berkmanetal.,j.clin.invest.91:153-159(1993)；brownetal.,humanpathol.26:86-91(1995)；brownetal.,cancerres.53:4727-4735(1993)；matternetal.,brit.j.cancer73:931-934(1996)；和dvoraketal.,am.j.pathol.146:1029-1039(1995))。还有,眼流体中vegf的浓度与具有糖尿病和其它缺血相关视网膜病变的患者中积极血管增殖的存在高度相关(aielloetal.,n.engl.j.med.331:1480-1487(1994))。而且,研究已经证明vegf在受到急性黄斑变性(amd)侵袭的患者中的脉络膜新血管膜中的局部化(lopezetal.,invest.ophtalmo.vis.sci.37:855-868(1996))。
测量内源vegf水平的能力取决于灵敏且特异性测定法的可得性。已经报告了针对vegf的基于比色,化学发光,和荧光比色的酶联免疫吸附测定法(elisa)(houck等人,见上文(1992)；yeoetal.,clin.wo2008/060777pct/us2007/080310chem.38:71(1992)；kondoetal.,biochim.biophys.acta1221:211(1994)；bakeretal.,obstet.gvnecol.86:815(1995)；hanatanietal.,biosci.biotechnol.biochem.59:1958(1995)；leithandmichelson,cellprolif.28:415(1995)；shifrenetal.,j.clin.endocrinol.metab.81:3112(1996)；takanoetal.,cancerres.56:2185(1996)；toietal.,cancer77:1101(1996)；brekkenetal.,cancerres.58:1952(1998)；obermairetal.,br.j.cancer77:1870-1874(1998)；webbetal.,clin.sci.94:395-404(1998))。例如,houck等人,见上文(1992)描述了看来具有ng/ml灵敏度的比色elisa,它的灵敏度可能不足以检测内源vegf水平。yeo等人,见上文(1992)描述一种两位点时间解析免疫荧光比色测定法,然而,在正常血清中没有检测到vegf(yeoetal.,cancerres.53:2912(1993))。使用改良型式的这种免疫荧光比色测定法,baker等人,见上文(1995)报告了来自妊娠女性的血浆中可检测水平的vegf,在具有先兆子痫的女性中观察到更高水平。使用放射免疫测定法,anthony等人报告了妊娠女性中的类似数据(anthonyetal.,ann.clin.biochem.34:276(1997))。hanatani等人,见上文(1995)开发了一种能够测量循环vegf的化学发光elisa并报告来自30名正常个体(男性和女性)的血清中8-36pg/ml的vegf水平。brekken等人,见上文(1998)描述了使用对单独的vegf或vegf:flk-1复合物任一具有结合偏爱的抗体的elisa测定法。一种用于vegf检测的elisa试剂盒可购自r&dsystems(minneapolis,mn)。r&dvegfelisa试剂盒已经在三明治式测定法中使用,其中使用一种单克隆抗体来捕捉靶vegf抗原并使用一种多克隆抗体来检测vegf。webb等人,见上文(1998)。还见例如obermair等人,见上文(1998)。keytetal.,j.biol.chem.271:7788-7795(1996)；keytetal.,j.biol.chem.271:5638(1996)；和shifren等人,见上文(1996)也开发了一种基于一对双链单克隆抗体的比色elisa。虽然这种elisa能够检测癌症患者中升高的vegf水平,但是它缺乏测量正常个体中vegf的内源水平所需要的灵敏度。rodriguezetal.,j.immunol.methods219:45(1998)描述了一种两位点荧光比色vegfelisa,在纯净的血浆或血清中产生10pg/mlvegf的灵敏度。然而,这种荧光比色测定法只检测vegf的完整无缺165/165和165/110种类(已经报告了vegf165/165能蛋白水解切割成三种其它形式:165/110异二聚体,110/110同二聚体,和55个氨基酸的c端片段(keytetal.,j.biol.chem.271:7788-7795(1996)；kecketal.,arch.biochem.biophys.344:103-113(1997))。
vegf-a是结合vegf-a并阻断它的活性的治疗性拮抗剂诸如例如
发明概述
在第一个方面,本发明涉及一种用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的方法,该方法包含:将样品与第一和第二抗体一起温育,其中所述第一和所述第二抗体均能够在该vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a,并检测形成的复合物,由此在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平。在各实施方案中,所述第一和所述第二抗体的结合彼此不干扰。在各实施方案中,所述抗体之一结合或能够结合固相且所述抗体之另一是可检测标记的。形成的可检测标记的复合物包含该第一抗体,vegf-a,和该第二抗体。
在第二个方面,本发明涉及一种用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的试剂盒,该试剂盒包含:第一和第二抗体,其中所述第一和所述第二抗体均能够在该vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a。在各实施方案中,所述第一和所述第二抗体的结合彼此不干扰。在各实施方案中,所述抗体之一结合或能够结合固相且所述抗体之另一是可检测标记的。
在第三个方面,本发明涉及一种包含第一和第二抗体的物质组合物,其中所述第一和所述第二抗体均能够在vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a或其变体。在各实施方案中,所述第一和所述第二抗体的结合彼此不干扰。在各实施方案中,所述抗体之一结合或能够结合固相且所述抗体之另一是可检测标记的。
在第四个方面,本发明涉及一种检测包含人vegf-a和非人或嵌合蛋白的复合物的方法,其包含如下步骤:(a)将包含所述复合物的样品与可检测标记的结合或能够结合该人vegf-a和/或该非人或嵌合蛋白的抗体一起温育,并(b)检测所述可检测标记的抗体或其抗原结合性片段。
附图简述
图1:a:测定法设计；b:包括vegf-a受体的测定法设计
图2:抗体m-13.2.5和m-13.7.40的轻链和重链的氨基酸序列；cdr以粗体突显；fr标有下划线
图3:有和没有vegf-a受体r1或r2的biacore传感图序列简述
seqidno:1:人vegf-a
seqidno:2:m-13.2.5的轻链的氨基酸序列
seqidno:3:m-13.2.5的重链的氨基酸序列
seqidno:4:m-13.7.40的轻链的氨基酸序列
seqidno:5:m-13.7.40的重链的氨基酸序列
发明详述
定义
在下文详细描述本发明之前,要理解的是此发明不限于本文中描述的特定方法学,方案和试剂,因为这些可以变化。还要理解的是本文中使用的术语学仅仅是出于描述特定实施方案的目的,并非意图限制本发明的范围,它仅仅会受所附权利要求书限制。除非另有定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。
贯穿此说明书的正文引用了数篇文件。无论在上或在下,本文中引用的每一篇文件(包括所有专利,专利申请,科学出版物,制造商的说明书,用法说明书等)据此通过援引完整收录。本文中无一处要解读为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类公开。本文中引用的一些文件表征为“通过援引而收录”。在此类收录的参考文献的定义或教导和本说明书中叙述的定义或教导之间有冲突的情况中,本说明书的正文取得优先。
下面会描述本发明的各要素。这些要素以具体的实施方案列出,然而,应当理解的是它们可以以任何方式和以任何数目组合以创建另外的实施方案。各式各样描述的实施例和优选的实施方案不应解读为将本发明限制于仅仅明确描述的实施方案。这种描述应当理解为支持和涵盖组合明确描述的实施方案与任何数目的公开的和/或优选的要素的实施方案。而且,此申请中所有描述的要素的任何排列和组合应当认为由本申请的说明书公开,除非上下文另有指示。
词语“包含”会理解为暗示包括陈述的一个或一组整数或步骤但不排除任何其它一个或一组整数或步骤。
如此说明书和所附权利要求书中使用的,单数形式“一个/一种”和“该/所述”包括复数所指物,除非内容另外清楚指明。
浓度,量,和其它数值数据在本文中可以以“范围”格式来表述或呈现。要理解的是此类范围格式仅仅是用于方便和简短而使用的且如此应当灵活地解读为不仅包括明确叙述的数值作为该范围的界限,而且还包括该范围内涵盖的所有个体数值或子范围,就像明确叙述每一个数值和子范围。作为例示,数值范围“150mg至600mg”应当解读为不仅包括明确叙述的值150mg至600mg,而且还包括指示范围内的个体值和子范围。如此,这个数值范围中包括个体值,诸如150,160,170,180,190,…,580,590,600mg和子范围,诸如150至200,150至250,250至300,350至600,等。这同一原则适用于仅仅叙述一个数值的范围。而且,此类解读应当不管范围的宽度或描述的特征而适用。
术语“约”在与数值联合使用时意味着涵盖具有比指示的数值要小的5％的下限且具有比指示的数值要大5％的上限的范围内的数值。
术语“表达水平”指在某个时间点时身体或样品中存在的基因产物的量。表达水平可例如依靠自该基因表达的蛋白质或mrna来测量/量化/检测。表达水平可例如通过将样品中存在的感兴趣基因产物(例如mrna或蛋白质)的量针对相同样品或参照样品(例如在相同时间自相同个体采集的样品或相同大小(重量,体积)的相同样品的一部分)中相同范畴的基因产物(总蛋白质或mrna)的总量标准化或通过鉴定每份限定的样品大小(重量,体积,等)中感兴趣基因产物的量来量化。表达水平可依靠本领域知道的任何方法来测量或检测,例如用于直接检测和量化感兴趣基因产物的方法(诸如质谱术)或用于间接检测和测量感兴趣基因产物的方法(通常经由感兴趣基因产物与一种或多种不同分子的结合或对感兴趣基因产物特异性的检测手段(例如引物,探针,抗体,蛋白支架)运转)。感兴趣基因产物的基因拷贝水平的测定,还包含测定一种或多种片段的缺失或存在(例如经由核酸探针或引物,例如定量pcr,多重连接依赖性探针扩增(mlpa)pcr),也在技术人员的知识内。
在本发明的语境中,术语“肽”指通过肽键连接的氨基酸的短聚合物。它具有与蛋白质相同的化学(肽)键,但是通常长度更短。最短的肽是二肽,由通过一个肽键连接的两个氨基酸组成。还可以是三肽,四肽,五肽,等。典型地,肽具有高至8,10,12,15,18或20个氨基酸的长度。肽具有氨基末端和羧基末端,除非它是环状肽。
在本发明的语境中,术语“多肽”指通过肽键成键到一起的一条氨基酸线性链且典型地包含至少约21个氨基酸。多肽可以是由超过一条链构成的蛋白的一条链,或者它可以是蛋白本身,如果该蛋白由一条链构成的话。
在本发明的不同方面的语境中,术语“蛋白”指包含恢复二级和三级结构的一条或多条多肽的分子且另外指由数条多肽,即数个亚基构成的蛋白,形成四级结构。蛋白有时附着有非肽基团,它们可以称作辅基或辅因子。
如本文中使用的,术语“复合物”指包含彼此密切接近并达到共同或相关功能的一些个体成分,部分或模块的整体。复合物的个体模块可以是相同或不同性质的,即它们可以由相同,相似或不同化学实体构成,诸如但不限于核苷酸,氨基酸,核酸,肽,多肽,蛋白,碳水化合物,或脂质。例如,复合物可包含一些相关蛋白,或一种或多种蛋白和一种或多种核酸的混合物或一种或多种蛋白和一种或多种脂质和/或碳水化合物的混合物。理解的是还涵盖相同,相似或不同化学实体的任何其它组合。复合物的个体模块可以是或不是互连的。典型地,复合物的各个体部分经由共价或非共价键而连接。例如,复合物可包含蛋白和它结合的受体,或者,复合物可包含蛋白和结合所述蛋白的表位的抗体。
术语“抗原”指引起免疫系统至生成针对它的抗体的任何物质。抗原可源自身体内(“自身抗原”)或外部环境(“非自身”)。抗原呈递细胞在组织相容性分子上以肽的形式呈递抗原。适应性免疫系统的t细胞识别抗原。取决于抗原和组织相容性分子的类型,不同类型的t细胞受到活化。
“表位”,也称作“抗原决定簇”,是受到免疫系统,具体是抗体,b细胞,或t细胞识别的大分子的区段,特别是抗原的区段。表位典型地是抗原的一部分且能够结合抗体或其抗原结合性片段。在此语境中,术语“结合”优选涉及特异性结合。在本发明的语境中,术语“表位”指受到抗体识别的蛋白的区段。表位通常由分子,诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面聚组组成且通常具有特定的三维结构特征,以及特定的电荷特征。构象和非构象表位区别在于对前者但非后者的结合在变性溶剂存在下丧失。
如本文中使用的,术语“变体”要理解为通过它的长度或序列中的一处或多处变化与衍生它的多肽或多核苷酸相比不同的多肽或多核苷酸。衍生多肽或多核苷酸变体的多肽或多核苷酸也称作亲本多肽或多核苷酸。术语“变体”包含亲本分子的“片段”或“衍生物”。典型地,“片段”在长度或大小上比亲本分子要小,而“衍生物”与亲本分子相比在它们的序列上展现一处或多处差异。还涵盖的是经修饰分子,诸如但不限于翻译后修饰蛋白(例如糖基化,生物素化,磷酸化,泛素化,棕榈酰化,或蛋白水解切割蛋白)和经修饰核酸(诸如甲基化dna)。不同分子的混合物(诸如但不限于rna-dna杂合物)也受术语“变体”涵盖。典型地,变体是人工构建的,优选通过基因技术手段,而亲本蛋白或多核苷酸是野生型蛋白或多核苷酸,或其共有序列。然而,天然发生变体也要理解为受如本文中使用的术语“变体”涵盖。而且,在本发明中可使用的变体还可以衍生自亲本分子的同系物,直系同系物,或旁系同系物或人工构建的变体,前提是该变体展现亲本分子的至少一种生物学活性,即有功能活性的。
特别地,术语“肽变体”,“多肽变体”,“蛋白变体”要理解为通过氨基酸序列上的一处或多处变化与衍生它的肽,多肽,或蛋白相比不同的肽,多肽,或蛋白。衍生肽,多肽,或蛋白变体的肽,多肽,或蛋白也称作亲本肽,多肽,或蛋白。而且,在本发明中可使用的变体还可以衍生自亲本肽,多肽,或蛋白的同系物,直系同系物,或旁系同系物或人工构建的变体,前提是该变体展现亲本肽,多肽,或蛋白的至少一种生物学活性。氨基酸序列上的变化可以是氨基酸交换,插入,删除,n端截短,或c端截短,或这些变化的任何组合,它们可以在一个或数个位点处发生。肽,多肽,或蛋白变体可展现氨基酸序列上总数高至50(高至1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,或50)处变化(即交换,插入,删除,n端截短,和/或c端截短)。氨基酸交换可以是保守的,半保守的和/或非保守的。半保守的和尤其是保守的氨基酸替代是优选的,其中氨基酸用化学相关氨基酸替代。典型的替代是在脂肪族氨基酸之间,在具有脂肪族羟基侧链的氨基酸之间,在具有酸性残基的氨基酸之间,在酰胺衍生物之间,在具有碱性残基的氨基酸之间,或在具有芳香族残基的氨基酸之间。典型的半保守和保守替代是:
a,f,h,i,l,m,p,v,w或y变成c是半保守的,如果新的半胱氨酸保持为游离硫醇的话。而且,技术人员会领会不应当替代空间要求位置处的甘氨酸且不应当在蛋白中具有α螺旋或β片层结构的部分中引入p。
或者/另外,如本文中使用的,“变体”可以通过某种程度的与衍生它的亲本肽,多肽,或蛋白的序列同一性来表征。更加精确地,肽,多肽,或蛋白变体在本发明的语境中与它的亲本肽,多肽,或蛋白展现至少80％序列同一性。特别地,变体可展现至少85％,90％,95％,97％,或99％的序列同一性。肽,多肽,或蛋白变体的序列同一性是在20,30,40,45,50,60,70,80,90,100或更多个氨基酸的连续区段上。
术语“生物标志物”或“指示物”在本文中可互换使用。在本发明的语境中,生物标志物可定义为生物学系统内用作所述系统的生物学状态的指示物的物质。在本领域中,术语“生物标志物”有时还应用于用于检测所述内源物质(例如抗体,核酸探针等,成像系统)的手段。在本发明的语境中,术语“生物标志物”仅仅会应用于物质,而非检测手段。如此,生物标志物可以是活的生物体中存在的任何种类的分子,诸如核酸(dna,mrna,mirna,rrna等),蛋白质(细胞表面受体,胞质蛋白等),代谢物或激素(血糖,胰岛素,雌激素,等),另一种分子的某种修饰特征性的分子(例如蛋白质上的糖模块或磷酰基残基,基因组dna上的甲基残基)或已经受到生物体内在化的物质或此类物质的代谢物。
术语“vegf”指来自人和非人物种诸如小鼠,大鼠或灵长动物的vegf。有时,通过术语指出来自特定物种的vegf,诸如hvegf用于人vegf,mvegf用于鼠vegf,等。
“vegf生物学活性”包括但不限于vegf对任何vegf受体的结合,和vegf信号传导活性,诸如正常和异常血管发生(angiogenesis)和脉管发生(vasculogenesis)二者的调节(ferraraanddavis-smyth(1997)endocrinerev.18:4-25；ferrara(1999)j.mol.med.77:527-543)；促进胚胎脉管发生和血管发生(carmelietetal.(1996)nature380:435-439；ferraraetal.(1996)nature380:439-442)；和调控雌性生殖道中的和用于骨生长和软骨形成的周期性血管增殖(ferraraetal.(1998)naturemed.4:336-340；gerberetal.(1999)naturemed.5:623-628)。在作为血管发生和脉管发生中的血管发生性因子以外,作为多效性生长因子,vegf在其它生理过程中展现多种生物学效应,诸如内皮细胞存活,血管通透性和血管舒张,单核细胞趋化性和钙流入(ferraraanddavis-smyth(1997),见上文和cebe-suarezetal.(2006)cell.mol.lifesci.63:601-615)。而且,最近的研究已经报告vegf对少数非内皮细胞类型的促有丝分裂效应,诸如视网膜色素上皮细胞,胰腺导管细胞,和schwann细胞(guerrinetal.(1995)j.cellphysiol.164:385-394；oberg-welshetal.(1997)mol.cell.endocrinol.126:125-132；sondelletal.(1999)j.neurosci.19:5731-5740)。
在本发明的语境中,“vegf-a”指血管内皮生长因子蛋白a,例如seqidno:1(swissprot登录号p15692,基因id(ncbi):7422)。vegf-a可形成二硫化物连接的同二聚体且作为糖基化丝裂原发挥作用,其特异性作用于内皮细胞且具有各种效应,包括介导升高的血管通透性,诱导血管发生,脉管发生和内皮细胞生长,促进细胞迁移,和抑制凋亡。术语“vegf-a”涵盖具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白以及其同等型,片段和变体。编码游离分泌的或细胞联合的同等型任一的可变剪接转录物已经表征,例如vegf-a的剪接同等型,例如vegf121,vegf145,vegf165,vegf189和vegf206,连同其天然发生等位和加工形式。片段包括但不限于通过纤溶酶切割vegf165生成的110个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子,如描述的(ferrara(2010)mol.biol.cell21:687；leungetal.(1989)science246:1306；和houcketal.(1991)mol.endocrin.5:1806)。术语“vegf-a”如此涉及具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白以及剪接同等型vegf121,vegf145,vegf165,vegf189和vegf206,其110个氨基酸的片段,以及seqidno:1的氨基酸序列的变体,剪接同等型vegf121,vegf145,vegf165,vegf189和vegf206的变体,和其110个氨基酸的片段的变体。
表征最好的两种vegf受体是“vegfr1”(也称作flt-1)和“vegfr2”(鼠同系物也称作kdr和flk-1)。每一种受体关于每一种vegf家族成员的特异性有变化,但是vegf-a结合flt-1和kdr二者。全长flt-1受体包括具有七个ig域的胞外域,跨膜域,和具有酪氨酸激酶活性的胞内域。胞外域牵涉vegf的结合而胞内域牵涉信号转导。可使用特异性结合vegf-a的vegf-a受体分子或其片段作为结合并隔绝vegf-a蛋白,由此阻止它发信号的vegf-a抑制剂。还有,可溶性形式的受体通过结合vegf-a,由此阻止它结合在靶细胞的表面上存在的它的天然受体来发挥对vegf-a蛋白的生物学活性的抑制效果。
术语“疾病”和“病症”在本文中可互换使用,指异常状况,尤其是异常医学状况,诸如病或损害,其中组织,器官或个体不再能够有效达成它的功能。典型地,但非必须的,疾病与指示此类疾病的存在的特定症状或体征有关。此类症状或体征的存在可如此指示组织,器官或个体罹患疾病。这些症状或体征的改变可指示此类疾病的进展。疾病的进展是典型地特征在于此类症状或体征的升高或降低,其可指示疾病“变坏”或“变好”。疾病的“变坏”特征在于组织,器官或生物体有效达成它的功能的能力降低,而疾病的“变好”典型地特征在于组织,器官或个体有效达成它的功能的能力升高。处于疾病“发生风险”的组织,器官或个体处于健康状态但显示疾病显现的潜力。典型地,疾病发生风险与此类疾病的早期或弱体征或症状有关。在此类情况中,仍然可通过治疗来阻止疾病的发作。疾病的例子包括但不限于外伤性疾病,炎症性疾病,感染性疾病,皮肤状况,内分泌疾病,肠疾病,神经学病症,关节疾病,遗传病症,自身免疫疾病,和各种类型的癌症。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一些程度的异常细胞增殖有关的病症。
如本文中使用的,术语“肿瘤”指所有赘生性细胞生长和增殖,无论恶性的或良性的,和所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”,“癌性”,“细胞增殖性病症”,“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到上并不互相排斥。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中典型地特征在于细胞增殖不受调节的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌,淋巴瘤,母细胞瘤,肉瘤,和白血病。此类癌症的更加具体例子包括鳞状细胞癌,肺癌(包括小细胞肺癌,非小细胞肺癌,肺的腺癌,和肺的鳞癌),腹膜癌,肝细胞癌,胃的癌或胃癌(包括例如胃肠癌),胰腺癌(包括例如转移性胰腺癌),成胶质细胞瘤,宫颈癌,卵巢癌,肝癌,膀胱癌,肝瘤,乳腺癌(包括局部晚期,复发性或转移性her-2阴性乳腺癌,结肠癌,结肠直肠癌,子宫内膜或子宫癌,唾液腺癌,肾癌或肾的癌,肝癌,前列腺癌,外阴癌,甲状腺癌,肝的癌和各种类型的头和颈癌,以及b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)；小淋巴细胞性(sl)nhl；中级/滤泡性nhl；中级弥漫性nhl；高级成免疫细胞性nhl；高级成淋巴细胞性nhl；高级小无核裂细胞nhl；贮积病(bulkydisease)nhl；套细胞淋巴瘤；aids相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(cll)；急性成淋巴细胞性白血病(all)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；和移植后淋巴增殖性病症(ptld),以及与瘢痣病,水肿(诸如与脑瘤有关的),和梅格斯氏综合征有关的异常血管增殖。
疾病的“症状”是具有此类疾病的组织,器官或生物体可察觉的疾病的暗示且包括但不限于组织,器官或个体的疼痛,虚弱,敏感(tenderness),紧张(strain),僵硬,和痉挛。疾病的“体征”或“信号”包括但不限于特定指示物,诸如生物标志物或分子标志物的变化或改变,诸如存在,缺失,升高或上升,降低或下降,或症状的发生,存在,或变坏。疼痛的症状包括但不限于可感觉为持久或变化的灼烧,阵痛,瘙痒或刺痛(burning,throbbing,itchingorstingingache)的令人不快的感受。
如本文中使用的,“患者”意味着可受益于本文中公开的诊断或治疗的任何哺乳动物,鱼,爬行动物或鸟。特别地,“患者”选自由实验用动物(例如小鼠,大鼠,家兔,或斑马鱼),驯养的动物(包括例如豚鼠,家兔,马,驴,牛,绵羊,山羊,猪,鸡,骆驼,猫,犬,海龟,陆龟,蛇,蜥蜴或金鱼),或灵长动物(包括黑猩猩,倭黑猩猩,大猩猩和人)组成的组。特别是,“患者”是人。
术语“样品”或“感兴趣样品”在本文中可互换使用,指组织,器官或个体的一部分或一块/片,典型地比此类组织,器官或个体要小,意图代表整个组织,器官或个体。一旦分析,样品提供关于组织状态或器官或个体的健康或患病状态的信息。样品的例子包括但不限于流体样品,诸如血液,血清,血浆,滑液,尿液,唾液,和淋巴液,或实体样品,诸如组织提取物。样品的分析可基于目测或化学来实现。目测分析包括但不限于组织,器官或个体的显微术成像或射线照相术扫描,其容许样品的形态学评估的。化学分析包括但不限于检测特定指示物的存在或缺失或它们的量或水平的改变。
如本文中使用的,术语“参照样品”指以与感兴趣样品实质性相同的方式分析并将其信息与感兴趣样品的信息相比的样品。参照样品由此提供标准而容许评估自感兴趣样品获得的信息。参照样品可衍生自健康或正常组织,器官或个体,由此提供组织,器官或个体的健康状态的标准。正常参照样品的状态和感兴趣样品的状态之间的差异可指示疾病发生的风险或此类疾病或病症的存在或进一步进展。参照样品还可衍生自与感兴趣样品相同的组织,器官,或个体但在更早的时间点采集。更早采集的参照样品的状态和感兴趣样品的状态之间的差异可指示疾病的进展,即疾病随时间变好或变坏。在采集参照样品和采集感兴趣样品之间一段时间流逝的情况中,参照样品是在更早或更晚的时间点采集的。此类时间段可代表若干月(1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12个月),周(例如1,2,3,4,5,6,7,8周),天(例如1,2,3,4,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90,100,150,200,250,300,350天),或小时(1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12个小时)。
术语“下降的”或”降低的”指示物的水平指样品中此类指示物的水平与参照或参照样品相比减少。术语“上升的”或”升高的”指示物的水平指样品中此类指示物的水平与参照或参照样品相比要高。
如本文中使用的术语“激动剂”指在组织,器官或个体中引起作用诸如受体信号传导,基因表达,蛋白质合成,和蛋白质降解的物质。典型地,激动剂通过结合受体分子的活性位点或变构性位点,由此触发特定反应来起作用。激动剂的例子包括但不限于核酸分子,诸如mrna或mirna,或蛋白,诸如激素,细胞因子,生长因子,神经递质,和转录因子。
如本文中使用的术语“拮抗剂”指阻断激动剂的作用的物质。典型地,拮抗剂通过结合受体分子的活性位点或变构性位点,或与在正常情况下不牵涉调节受体的活性的独特结合位点相互作用来起作用。典型地,拮抗剂在结构上限定的结合位点处与激动剂竞争或以如下方式改变激动剂的结合位点,即由于它的结合,激动剂不能够引起它在正常情况下会引起的作用。拮抗剂活性可以是可逆的或不可逆的,取决于拮抗剂–受体复合物的相互作用的寿命。拮抗剂的例子包括但不限于核酸分子,诸如sirna或mirna,或蛋白,诸如激素,细胞因子,生长因子或神经递质,抗体,或转录因子。
术语“拮抗性抗体”指部分或完全降低或完全阻止感兴趣分子(例如感兴趣肽,多肽或蛋白)的至少一种功能活性的抗体。典型地,拮抗性抗体结合受体的活性位点并由此阻止激动剂对受体的结合,或以在空间上阻碍激动剂结合受体的方式在不同位点处结合受体。
如本文中使用的术语“受体”指一种或多种特定信号传导分子结合的分子,诸如蛋白或多核苷酸。信号传导分子可作为激动剂或拮抗剂起作用,包括但不限于核酸分子,诸如sirna或mirna,或蛋白,诸如激素,细胞因子,生长因子或神经递质,抗体或转录因子。受体可定位于细胞的质膜处,胞质内和/或胞内隔室中。
如本文中使用的术语“免疫球蛋白(ig)”指免疫球蛋白超家族的赋予免疫力的糖蛋白。“表面免疫球蛋白”通过它们的跨膜区附着于效应细胞的膜且涵盖诸如但不限于b细胞受体,t细胞受体,i和ii类主要组织相容性复合物(mhc)蛋白,β-2微球蛋白(～2m),cd3,cd4和cds等分子。
典型地,如本文中使用的术语“抗体”指缺乏跨膜区且如此能释放入血流和体腔的分泌型免疫球蛋白。人抗体基于它们拥有的重链而分组入不同同种型。有五种类型的人ig重链定义抗体的类,即定义iga,igd,ige,igg,和igm抗体,每一种实施不同作用,且指引适宜的针对不同类型的抗原的免疫应答。iga是在粘膜区域中,诸如肠,呼吸道和泌尿生殖道,以及在唾液,泪液,和乳液中找到的且阻止病原体建群(underdown&schiff(1986)annu.rev.immunol.4:389-417)。igd主要作为尚未暴露于抗原的b细胞上的抗原受体发挥功能且牵涉活化嗜碱性细胞和肥大细胞以生成抗微生物因子(geisbergeretal.(2006)immunology118:429-437；chenetal.(2009)nat.immunol.10:889-898)。ige牵涉变应性反应,其经由它对变应原的结合,触发自肥大细胞和嗜碱性细胞释放组胺。ige还牵涉针对寄生性蠕虫的保护(pieretal.(2004)immunology,infection,andimmunity,asmpress)。igg提供针对侵入性病原体的基于抗体的免疫力的大部分且是唯一能够穿过胎盘以将被动免疫给予胎儿的抗体同种型(pieretal.(2004)immunology,infection,andimmunity,asmpress)。在人中有四种不同igg亚类(igg1,2,3,和4),以它们在血清中的丰度的次序命名,igg1是最丰富的(～66％),接着是igg2(～23％),igg3(～7％)和igg(～4％)。不同igg类的生物学概况由相应铰链区的结构决定。igm以单体形式在b细胞的表面上表达且以具有很高亲合力的分泌型五聚体形式表达。igm牵涉在足够igg生成之前在b细胞介导的(体液)免疫的早期阶段中消除病原体(geisbergeretal.(2006)immunology118:429-437)。不仅作为单体找到抗体,而且还知道它们形成两个ig单元的二聚体(例如iga),四个ig单元的四聚体(例如硬骨鱼的igm),或五个ig单元的五聚体(例如哺乳动物igm)。
抗体典型地由四条多肽链构成,包含两条相同重链和两条相同轻链,它们经由二硫键连接且类似“y”形大分子。每条链包含一些免疫球蛋白域,其中一些是恒定域且其它是可变域。免疫球蛋白域由以两个β片层排列的7至9个反平行链的一个两层三明治组成。典型地,抗体的重链包含四个ig域,它们中的三个是恒定(ch域:ch1,ch2,ch3)域且一个是可变域(vh)。轻链典型地包含一个恒定ig域(cl)和一个可变ig域(vl)。例如,人igg重链由自n至c端以vl1-ch1-ch2-ch3的次序连接的四个ig域构成,而人igg轻链由自n至c端以vl-cl的次序连接的两个免疫球蛋白域构成,或是卡帕(κ)或是拉姆达(λ)型的(vκ-cκ或vλ-cλ)。例如,人igg的恒定链包含447个氨基酸。
术语“高变区(hvr或hv)”和“互补决定区(cdr)”在本文中可互换使用且指抗体可变域中在序列上高变和/或形成结构上限定的环的区域。一般地,抗体包含六个hvr或cdr；三个在vh中(h1,h2,h3)且三个在vl中(l1,l2,l3)。在天然抗体中,h3和l3展示六个hvr的大部分多样性,而且特别认为h3在赋予抗体以精细特异性中发挥独特作用。见例如xuetal.(2000)immunity13:37-45；johnsonandwu,inmethodsinmolecularbiology248:1-25(lo,ed.,humanpress,totowa,nj,2003)。确实,仅仅由重链组成的天然发生骆驼抗体在轻链缺失下是功能性的且稳定的。见例如hamers-castermanetal.(1993)nature363:446-448和sheriffetal.(1996)naturestruct.biol.3:733-736。在本文中使用和涵盖一些hvr描绘。作为kabat互补决定区(cdr)的hvr基于序列可变性且是最常使用的(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))。chothia改为指结构环的定位(chothiaandlesk(1987)j.mol.biol.196:901-917)。abmhvr代表kabatcdr和chothia结构环之间的妥协,而且得到oxfordmolecular的abm抗体模拟软件的使用。“接触”hvr基于可得复合物晶体结构的分析。下文记录来自这些hvr每一个的残基。
hvr可包含“延伸的hvr”,如下:vl中的24-36或24-34(l1),46-56或50-56(l2),和89-97或89-96(l3),和vh中的26-35(h1),50-65或49-65(h2),和93-102,94-102,或95-102(h3)。对于这些延伸的hvr定义中的每一种,可变域残基依照kabat等人,见上文编号。
“框架区”或“fr”的氨基酸是可变性比如本文中定义的hvr残基要低的残基。典型地,四个fr分开三个hvr且形成β片层结构,它们充当支架将hv区保持于接触抗原的位置。
表达“如kabat中的可变域残基编号方式”或“如kabat中的氨基酸位置编号方式”,和其变型指kabat等人,见上文中用于抗体汇编的重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用这种编号系统,实际的线性氨基酸序列可含有更少的或另外的氨基酸,对应于可变域的fr或hvr的缩短或插入。例如,重链可变域可包括h2的残基52后面的单一氨基酸插入物(依照kabat的残基52a)和重链fr残基82后面插入的残基(例如依照kabat的残基82a,82b,和82c,等)。“如kabat中的eu索引”指人iggleu抗体的残基编号方式。因而,在igg的语境中ch域如下:“chi”指依照如kabat中的eu索引的氨基酸位置118-220；“ch2”指依照如kabat中的eu索引的氨基酸位置237-340；而“ch3”指依照如kabat中的eu索引的氨基酸位置341-447。
术语“结合亲和力”一般指分子(例如抗体)的单一结合位点和它的结合配偶(例如抗原)之间的全部非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子x对它的配偶y的亲和力一般可以用解离常数(kd)来代表。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量,包括但不限于基于表面等离振子共振的测定法(诸如如pct申请公开号wo2005/012359中描述的biacore测定法)；酶联免疫吸附测定法(elisa)；和竞争测定法(例如ria的)。低亲和力抗体一般缓慢结合抗原且趋于容易解离,而高亲和力抗体一般更快结合抗原且趋于更久保持结合。本领域知道多种测量结合亲和力的方法,它们均可用于本发明的目的。下面描述了用于测量结合亲和力的具体的例示性和说明性实施方案。
“kd”或“kd值”可于25℃用固定化的抗原cm5芯片以～10个响应单位(ru)使用
“结合速率”,“结合的速率”,或”kon”也可以如上文所述使用
典型地,抗体以足够的结合亲和力结合它们的靶物,例如以500nm-1pm之间的kd值,即500nm,450nm,400nm,350nm,300nm,250nm,200nm,150nm,100nm,50nm,1nm,900pm,800pm,700pm,600pm,500pm,400pm,300pm,200pm,100pm,50pm,1pm。
“亲和力成熟的”抗体是具有其一个或多个hvr中的一处或多处改变的,它们导致抗体对抗原的亲和力与不拥有那些改变的亲本抗体相比改善。亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域知道的规程来生成。例如,marksetal.(1992)bio/technology10:779-783描述了通过vh和vl域改组的亲和力成熟。例如,barbasetal.(1994)procnat.acad.sci.usa91:3809-3813；schieretal.(1995)gene169:147-155；yeltonetal.(1995)j.immunol.155:1994-2004；jacksonetal.(1995)j.immunol.154(7):3310-9；和hawkinsetal.(1992)j.mol.biol.226:889-896描述了hvr和/或框架残基的随机诱变。
术语抗体还涵盖其“抗原结合性片段”。术语抗体的“抗原结合性片段”指拥有以与抗体相似的方式结合抗原的能力但大小比完整抗体分子要小的分子。例如,通过生成三个片段的木瓜蛋白酶消化获得抗体的三个“抗原结合性片段”,即两个相同的片段,称作“fab片段”(也称作“fab部分”或”fab区”),每一个具有一个抗原结合位点,和剩余的“fc片段”(也称作“fc部分”或”fc区”),其名称反映它容易结晶的能力。在igg,iga和igd同等型中,fc区由两个相同的蛋白质片段构成,它们衍生自抗体的两条重链的ch2和ch3域；在igm和ige同等型中,fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定域(ch2-4)。另外,别的抗原结合性片段天然发生或人工构建。术语“fab'片段”指另外包含ig分子的铰链区的fab片段,而“f(ab')2片段”理解为包含化学连接或经由二硫键连接的两个fab'片段。“单域抗体(sdab)”(desmyteretal.(1996)nat.structurebiol.3:803-811)和“纳米抗体(nanobody)”仅仅包含一个vh域,而“单链fv(scfv)”片段包含经由短接头肽连接的重链可变域和轻链可变域(hustonetal.(1988)proc.natl.acad.sci.usa85,5879-5883)。二价单链可变片段(di-scfv)可通过连接两个scfv来工程化改造(scfva-scfvb)。这可以通过生成具有两个vh和两个vl区的一条肽链来进行,产生“串联scfv”(vha-vla-vhb-vlb)。另一种可能性是创建如下的scfv,其具有对于两个可变区折叠到一起而言太短的接头,迫使scfv二聚化。通常,使用具有5个残基的长度的接头来生成这些二聚体。这种类型称作“双抗体(diabody)”。vh和vl域之间仍然更短的接头(一个或两个氨基酸)导致形成单特异性三聚体,所谓的“三抗体(triabody或tribady)”。双特异性双抗体通过分别表达具有排列vha-vlb和vhb-vla或vla-vhb和vlb-vha的链来形成。单链双抗体(scdb)包含通过12-20个氨基酸,优选14个氨基酸的接头肽(p)连接的vha-vlb和vhb-vla片段(vha-vlb-p-vhb-vla)。“双特异性t细胞啮合剂(bite)”是由不同抗体的两个scfv组成的融合蛋白,其中scfv之一经由cd3受体结合t细胞,且另一经由肿瘤特异性分子结合肿瘤细胞(kuferetal.(2004)trendsbiotechnol.22:238-244)。双重亲和力再靶向分子(“dart”分子)是另外经由c端二硫桥稳定化的双抗体。
术语“抗体”和“其抗原结合性片段”还涵盖抗体的变体或其抗原结合性片段的变体。对于如上文定义的任何蛋白变体,抗体的变体或其抗原结合性片段的变体也要理解为如下的抗体或抗原结合性片段,它与衍生它的抗体或抗原结合性片段相比区别在于它的长度或序列上的一处或多处变化,如上文关于蛋白变体详细定义的。另外,抗体变体或其抗原结合性片段的变体可以在抗体或抗原结合性片段的不同部分中展现不同程度的序列同一性。关于框架区,本文中涵盖某种程度的变异性,即个别fr可包含或组成为具体叙述的氨基酸序列或至少80％,至少85％,至少90％,至少92.5％,至少95％,至少98％,至少99％或至少99.5％同一的氨基酸序列。会领会的是对于不同fr,不同程度的序列同一性可能是可容许的,取决于实际的序列和例如相应fr序列的长度,以及它在相应可变链域内的定位。然而,在抗体变体或其抗原结合性片段的变体中,cdr可具有所述cdr的具体叙述的序列,或者可与其区别在于至多一处氨基酸替代。照此,每一个cdr中的一个氨基酸可以用不同氨基酸替换。会领会的是氨基酸替代可存在于一个抗体的一条链的一些但非所有cdr。
抗体或其抗原结合性片段,或它们的变体可以是“可检测标记的”。术语“可检测标记的”涵盖能直接或间接检测的标记物。合适的标记物包括但不限于通过光谱学,光化学,生物化学,免疫化学,化学,或其它物理手段可检测的分子。合适的标记物包括但不限于荧光染料(例如gft和它的变体,fitc,tritc,荧光素和罗丹明,等等),电子致密试剂(例如金),酶(例如如elisa中通常使用的),含有放射性核素的分子(即放射性同位素),化学发光分子,电化学发光分子,生物素,洋地黄毒苷/地高辛配基,或半抗原和是或能成为可检测的其它实体。例如,抗体可以是生物素化或钌化的。用于标记抗体的方法是本领域技术人员公知的且有丰富描述,例如haugland(2003)molecularprobeshandbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,inc.；brinkley(1992)bioconjugatechem.3:2；garman(1997)non-radioactivelabeling:apracticalapproach,academicpress,london；means(1990)bioconjugatechem.1:2；glazeretal.,chemicalmodificationofproteins.laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology(t.s.workande.work,eds.)americanelsevierpublishingco.,newyork；lundblad,r.l.andnoyes,c.m.(1984)chemicalreagentsforproteinmodification,vols.iandii,crcpress,newyork；pfleiderer,g.(1985)"chemicalmodificationofproteins",modernmethodsinproteinchemistry,h.tschesche,ed.,walterdegruyter,berlinandnewyork；andwong(1991)chemistryofproteinconjugationandcross-linking,crcpress,bocaraton,fla.)；deleon-rodriguezetal.(2004)chem.eur.j.10:1149-1155；lewisetal.(2001)bioconjugatechem.12:320-324；lietal.(2002)bioconjugatechem.13:110-115；mieretal.(2005)bioconjugatechem.16:240-237。
抗体靶向其存在,缺失,或水平可经由各种测量方法,特别是免疫测定法技术来检测的潜在生物标志物。这些包括但不限于western印迹(有或没有免疫沉淀),二维sds-page,免疫沉淀,荧光活化的细胞分选(facs),流式细胞术,和免疫测定法规程。所述方法容许测定极其多种组织和样品,包括血浆或血清。宽范围的使用此类测定法格式的免疫测定法技术是可得的,见例如美国专利no.4,016,043,4,424,279,和4,018,653。这些包括非竞争性类型的单位点和两位点或“三明治”测定法,以及传统的竞争性结合测定法二者。这些测定法还包括经标记抗体对靶生物标志物的直接结合。
“三明治测定法”是最有用且常用的测定法之一,涵盖三明治式测定法技术的多种变型。简言之,在一种典型的测定法中,在固体基片上固定化未标记的抗体,并使要测试的样品与结合的分子接触。在合适的一段温育之后,足以容许抗体-抗原复合物形成的时间段,然后添加用能够产生可检测信号的报告分子标记的第二抗体并温育,容许时间足够另一种复合物(抗体-抗原-经标记抗体)形成。可清洗掉任何未反应的材料,并通过观察由报告分子产生的信号来测定分析物的存在。结果可以是定性的(通过简单观察可见信号),或者可以通过与含有已知量的生物标志物的对照样品比较来量化。
三明治式测定法的变型包括一种同步测定法,其中将要分析的样品和经标记的抗体二者同时添加至固定化的抗体。这些技术是本领域技术人员公知的,包括会是显而易见的任何微小变异。在一种典型的三明治式测定法中,将针对生物标志物上的第一表位的第一抗体共价或被动结合至固相。固相典型地是玻璃或聚合物,最常用的聚合物是纤维素,聚丙烯酰胺,尼龙,聚苯乙烯,聚氯乙烯,或聚丙烯。固相可以是管,珠,微量板的盘,或适合于进行免疫测定法的任何其它表面的形式。结合过程是本领域公知的且一般由交联共价结合或物理吸附组成,清洗聚合物-抗体复合物,为测试样品准备。然后将要分析的样品的小样添加至固相复合物并在合适的条件下(例如室温至40℃,诸如25℃和32℃之间)温育足够时间段(例如2-40分钟或过夜,如果更加方便的话)以容许抗体中存在的任何亚基的结合。在温育段后,清洗抗体亚基固相并与对生物标志物上的不同表位特异性的第二抗体一起温育。第二抗体连接用来指示第二抗体对分析物的结合的报告分子。
一种备选的竞争性方法牵涉在固相上固定化分析物,然后将固定化的靶物与要分析的样品一起暴露于对分析物特异性的抗体,它可以是或不是用报告分子标记的。取决于样品中靶分子的量和报告分子信号的强度,靶分子的竞争可以是经由此类经标记抗体直接可检测的。或者,将对第一抗体特异性的第二经标记抗体暴露于靶-第一抗体复合物以形成靶-第一抗体-第二抗体三元复合物。通过由报告分子发射的信号来检测复合物。
如本说明书中使用的,术语“报告分子”或“直接可检测的标记物”指通过它的化学本性提供分析上可鉴定的信号,从而容许检测抗原结合的抗体的分子。这种类型的测定法中最常用的报告分子是酶,荧光团或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光或电化学发光分子。
在“酶免疫测定法(eia)”的情况中,将酶缀合至第二抗体,典型地依靠戊二醛或高碘酸盐。然而,正如会容易认识的,存在极其多种不同缀合技术,它们是技术人员容易得到的。常用的酶包括但不限于辣根过氧化物酶,葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶,和碱性磷酸酶,等等。要与特定酶一起使用的底物一般选择成一旦受到相应的酶水解,产生可检测的颜色变化。合适的酶的例子包括但不限于碱性磷酸酶和过氧化物酶。也可能的是采用产生荧光产物的荧光底物,而非上文记录的发色底物。在所有情况中,将酶标记的抗体添加至第一抗体-分子标志物复合物,容许结合,然后清洗掉过量的试剂。然后将含有适宜的底物的溶液添加至抗体-抗原-抗体的复合物。底物会与连接至第二抗体的酶反应,给出定性可见信号,它可以进一步量化,通常但非必须通过分光光度法,以给出样品中存在的分析物的量的指示。或者,可以在不改变它们的结合能力的情况下将荧光化合物(诸如荧光素和罗丹明)化学偶联至抗体。当通过用特定波长的光照射而活化时,荧光染料标记的抗体吸收光能,在分子中诱导激发性的状态,接着以用光学显微镜目测可检测的特征性颜色发射光。如在eia中,容许荧光标记的抗体结合第一抗体-分子标志物复合物。在清洗掉未结合的试剂之后,然后将剩余的三元复合物暴露于适宜波长的光,观察到的荧光指示分析物的存在,缺失,或水平。免疫荧光和eia技术均是本领域很好建立的。然而,还可以采用其它报告分子,诸如放射性同位素,化学发光,电化学发光,或生物发光分子。用于检测vegf的免疫测定法描述于例如美国专利no.6,855,508和7,541,160和美国专利公开文本no.2010/0255515。用于检测vegf的合适平台描述于例如ep0939319和ep1610129。
而且,感兴趣分析物的mrna或dna可通过选自由使用northern,点印迹,或聚合酶链式反应(pcr)分析,阵列杂交,rna酶保护测定法,或使用dna微阵列组成的组的方法来检测,它们是可购得的,包括dna微阵列快照。例如,实时pcr(rt-pcr)测定法诸如定量pcr测定法是本领域公知的。检测生物学样品中感兴趣分析物的mrna的方法包括但不限于使用至少一种引物通过逆转录自样品生成cdna；扩增如此生成的cdna；并检测所扩增的cdna的存在。另外,此类方法可包括容许测定生物学样品中mrna的水平的一个或多个步骤(例如通过同时检查“持家”基因诸如肌动蛋白家族成员的比较性对照mrna序列的水平)。另外/或者,可测定所扩增的cdna的序列。northern印迹分析是本领域公知的常规技术且描述于例如molecularcloning,alaboratorymanual,secondedition,1989,sambrook,fritch,maniatis,coldspringharborpress,10skylinedrive,plainview,ny11803-2500。用于评估基因和基因产物的状态的典型方案可见于例如ausubeletal.eds.,1995,currentprotocolsinmolecularbiology,units2(northernblotting),4(southernblotting),15(immunoblotting)and18(pcranalysis)。
如本文中使用的“颗粒”意味着小的,局限的物体,对其可归属诸如体积,质量或平均大小的物理特性。微粒因而可以是对称,球状,本质上球状或球形形状的,或者是不规则,不对称形状或形式的。本发明涵盖的颗粒的大小可变化。典型地,微粒具有纳米和微米范围中的直径。微粒可具有50纳米至50微米的直径,即50nm,100nm,200nm,300nm,400nm,500nm,600nm,700nm,800nm,900nm,1000nm(即1μm),2μm,3μm,4μm,5μm,6μm,7μm,8μm,9μm,10μm,15μm,20μm,25μm,30μm,35μm,40μm,45μm,和50μm。特别地,微粒具有100nm和10μm之间的直径,特别是200nm至5μm或750nm至5μm。微粒包含或组成为本领域技术人员知道的任何合适材料,例如它们包含或组成为或本质上组成为无机或有机材料。典型地,它们包含或组成为或本质上组成为金属或金属合金,或有机材料,或包含或组成为或本质上组成为碳水化合物要素。用于微粒的材料的例子包括但不限于琼脂糖,聚苯乙烯,胶乳,聚乙烯醇,硅石和铁磁性金属,合金或复合材料。微粒还可包含或组成为磁性或铁磁性金属,合金或组合物。材料可具有特定特性,诸如例如是疏水性的或亲水性的。典型地,微粒分散在水溶液中且保留小负表面电荷,保持微粒分开且避免非特异性聚簇。磁性或顺磁微粒可通过磁力分出。应用磁力来将顺磁性或磁性颗粒拉出溶液/悬浮液及在期望时在能去除溶液/悬浮液的液体并能例如清洗颗粒的同时保留它们。
术语“缓冲液/缓冲剂”或“缓冲溶液”指包含弱酸和它的共轭碱(或反之亦然)的混合物的水溶液。当将小或中等量的强酸或碱添加至它时它的ph变化很小,因此使用它来阻止溶液的ph的变化。使用缓冲溶液作为在极其多种化学应用中将ph保持于接近恒定值的手段。所使用的常见缓冲剂化合物包括但不限于taps,bicine,tris,tricine,tapso,hepes,tes,mops,pipes,卡可酸盐,和mes。
“试剂盒”是任何制造物(例如包装或容器),其包含至少一种试剂,例如用于治疗病症的药物,或用于特异性检测本发明的生物标志物基因或蛋白的探针。制造物优选作为用于实施本发明的方法的单元来推销,分发,或销售。典型地,试剂盒可进一步包含载体手段,它被隔室化以接受处于紧密限制的一个或多个容器手段,诸如管形瓶,管,等等。特别地,每一个容器手段包含要在第一个方面的方法中使用的分开的要素之一。试剂盒可进一步包含一个或多个其它容器,其包含别的材料,包括但不限于缓冲剂,稀释剂,滤器,针,注射器,和带有使用说明书的包装插页。标签可以存在于容器上以指示组合物用于特定应用,而且还可以指示关于体内或体外使用的用法说明书。
“包装插页”用来指治疗性产物或药物的商业性包装中通常包括的用法说明书,它们含有有关关于此类治疗性产物或药物的使用的适应证,用法,剂量,施用,禁忌症,要与所包装的产物组合的其它治疗性产物,和/或警告,等的信息。
实施方案
在第一个方面,本发明涉及一种用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的方法。所述方法包含在第一步中将样品与第一和第二抗体或第一和第二抗体的片段一起温育。该第一和该第二抗体均能够在该vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a或其变体。特别地,该第一和该第二抗体在该vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a。
在各实施方案中,该第一抗体的结合和该第二抗体的结合彼此不干扰。在特定实施方案中,该第一或该第二抗体之一能够结合固相。在特定实施方案中,所述第一或第二抗体之另一是可检测标记的。一旦所述样品与所述第一和所述第二抗体一起温育,可检测标记的包含该第一抗体,vegf-a或其变体,和该第二抗体的复合物形成。
在该用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的方法的第二步中,检测在第一步中形成的复合物。此检测容许在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平。
因而,第一个方面涉及一种用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的方法,该方法包含:将样品与第一和第二抗体一起温育,其中所述第一和所述第二抗体均能够在该vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a且其中所述第一和所述第二抗体的结合彼此不干扰,其中所述抗体之一结合或能够结合固相且其中所述抗体之另一是可检测标记的,由此形成可检测标记的包含该第一抗体,vegf-a,和该第二抗体的复合物,并检测形成的复合物,由此在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平。
在特定实施方案中,该vegf-a是人vegf-a或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a包含依照seqidno:1的氨基酸序列或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a由依照seqidno:1的氨基酸序列或其变体组成。在特定实施方案中,该vegf-a的变体具有与vegf-a相同的功能性,即该变体是功能性变体。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现至少85％,90％,95％,98％或99％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现至少85％或至少95％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。在本发明的各实施方案中,vegf-a作为单体或二聚体,特别是同二聚体存在。
在特定实施方案中,该vegf-a是人vegf-a同等型或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a同等型是人vegf-a同等型vegf121,vegf145,vegf165,vegf189和/或vegf206,或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体具有与相应vegf-a同等型相同的功能性,即该同等型变体是功能性同等型变体。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体与该相应人vegf-a同等型的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体与该人vegf-a同等型的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体与该相应人vegf-a同等型的氨基酸序列展现至少85％,90％,95％,98％或99％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体与该相应人vegf-a同等型的氨基酸序列展现至少85％或至少95％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体与该相应人vegf-a同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。如此,在特定实施方案中,该vegf-a的vegf121同等型的变体与该人vegf121同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性；该vegf-a的vegf145同等型的变体与该人vegf145同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性；该vegf-a的vegf165同等型的变体与该人vegf165同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性；该vegf-a的vegf189同等型的变体与该人vegf189同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性；而该vegf-a的vegf206同等型的变体与该人vegf206同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。
在特定实施方案中,该vegf-a是人vegf-a片段或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a片段是人vegf-a110个氨基酸的片段或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体具有与相应vegf-a片段相同的功能性,即该片段变体是功能性片段变体。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体与该相应人vegf-a同等型的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体与人vegf-a片段的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体与该相应人vegf-a片段的氨基酸序列展现至少85％,90％,95％,98％或99％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体与该相应人vegf-a片段的氨基酸序列展现至少85％或至少95％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体与该相应人vegf-a片段的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。如此,在特定实施方案中,该vegf-a110个氨基酸的片段的变体与该人vegf-a110个氨基酸的片段的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。
在各实施方案中,该vegf-a拮抗剂阻止vegf-a和一种或多种vegf受体之间的相互作用。特别地,该vegf-a拮抗剂在该受体的结合位点处与vegf-a竞争或以如下方式改变vegf-a上针对它的受体的结合位点,即它不再能够结合它的受体或不再能够触发在正常情况下由它的结合引起的功能性作用。因而,该vegf-a拮抗剂可结合vegf-a的表位并由此阻碍vegf-a对它的受体的结合,或该vegf-a拮抗剂可结合该受体的表位并由此阻止vegf-a对该受体的结合。在特定实施方案中,该vegf-a拮抗剂结合vegf-a上的表位并由此阻止它对vegf受体的结合。在特定实施方案中,该vegf-a受体是vegfa-r1和/或vegfa-r2。
在本发明的第一个方面的又一些实施方案中,该vegf-a拮抗剂选自由多肽,蛋白,肽体(peptibody),免疫粘附素,小分子和适体(aptamer)组成的组。
在其中该拮抗剂是蛋白的特定实施方案中,所述蛋白是抗体。在一个特定实施方案中,该抗体是抗vegf-a抗体。特别地,该抗vegf抗体是以足够亲和力和特异性结合vegf-a的抗体。在各实施方案中,该抗体具有足够的对vegf-a的结合亲和力。特别地,该抗体或其抗原结合性片段以100nm-1pm之间的kd值,即以100nm,50nm,1nm,900pm,800pm,700pm,600pm,500pm,400pm,300pm,200pm,100pm,50pm,或1pm的kd值结合hvegf-a。在特定实施方案中,该抗体或其抗原结合性片段以50nm-50pm,1nm-100pm,或700pm-300pm之间的kd值结合人vegf-a(hvegf-a)。
在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是单克隆或多克隆的。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是重组生成的。在又一些实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是嵌合抗体,特别是人源化抗vegf-a抗体。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体包含突变的人igg1框架区。该拮抗性vegf-a抗体进一步包含来自阻断人vegf对它的受体的结合的鼠抗hvegf单克隆抗体a.4.6.1的抗原结合性互补决定区(cdr)。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体的氨基酸序列的93％,包括大部分框架区,衍生自人igg1,而且该序列的约7％衍生自鼠抗体a4.6.1
在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是抗体片段。该抗体片段选自由fab片段,fab'片段,f(ab')2片段,单域抗体(sdab),纳米抗体(nanobody),单链fv(scfv),二价单链可变片段(di-scfv),串联scfv,双抗体(diabody),双特异性双抗体,单链双抗体(scdb),双特异性t细胞啮合剂(bite),和dart分子组成的组。在特定实施方案中,该拮抗性抗体片段是fab片段或f(ab’)2片段,特别是人源化fab片段或人源化f(ab’)2片段。
在又一些实施方案中,该vegf-a拮抗剂选自由vegf-陷阱,mucagen,ptk787,su11248,ag-013736,bay439006(索拉非尼),zd-6474,cp632,cp-547632,azd-2171,cdp-171,su-14813,chir-258,aee-788,sb786034,bay579352,cdp-791,eg-3306,gw-786034,rwj-417975/ct6758和krn-633组成的组。
在第一个方面的特定实施方案中,使用针对vegf-a的第一抗体和针对vegf-a的第二抗体,其中所述第一抗体和所述第二抗体在相同或不同表位处结合vegf-a。在特定实施方案中,所述第一抗体和所述第二抗体在不同表位处结合vegf-a。
在特定实施方案中,该第一和该第二抗体彼此不干扰。因而,这些抗体之一的结合不阻止或减少相应的另一抗体的结合。在本发明的各实施方案中,该第一和第二抗体结合同一单体上的两个不同表位和/或二聚体的每一个单体上的两个不同表位。或者,该第一和该第二抗体结合同二聚体的不同单体上的相同或实质性相同表位。在特定实施方案中,所述第一抗体和所述第二抗体在不同表位处结合vegf-a。
在特定实施方案中,该第一抗体和该第二抗体彼此分别结合受到vegf受体,特别是vegf-a受体vegfa-r1和/或vegfa-r2覆盖或结合的表位。如此,所述第一抗体和所述第二抗体彼此分别与vegf-a受体,特别是vegfa-r1或vegfa-r2结合相同表位。或者,所述第一抗体和所述第二抗体彼此分别结合没有受到该vegf-a受体,诸如例如vegfa-r1或vegfa-r2直接结合但受到该受体覆盖的表位,使得该第一和/或第二抗体的结合阻止该vegf-a受体的结合。因而,在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体竞争vegfa-r1和/或vegfa-r2的结合。
在特定实施方案中,该第一和该第二抗体彼此分别与该vegf-a拮抗剂结合相同或不同表位,特别是与该拮抗性抗体结合不同表位。在该第一或该第二抗体与该拮抗剂,特别是该拮抗性抗体结合相同表位的情况中,涵盖的是该第一或第二抗体以比该拮抗剂更低的kd值结合该表位。在特定实施方案中,该第一或第二抗体以1.5nm以下,特别是1nm以下,0.75nm以下,特别是0.5nm以下的kd值结合该表位。
在第一个方面的各实施方案中,该第一抗体或该第二抗体任一结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,seqidno:3的氨基酸115-125,seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的组的cdr。
在第一个方面的各实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,和seqidno:3的氨基酸115-125组成的组的cdr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,和seqidno:3的氨基酸115-125组成的cdr。
在第一个方面的各实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的组的cdr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的cdr。
在第一个方面的各实施方案中,该第一和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:2的氨基酸20-45,seqidno:2的氨基酸52-68,seqidno:2的氨基酸72-107,seqidno:2的氨基酸117-126,seqidno:3的氨基酸19-43,seqidno:3的氨基酸53-69,seqidno:3的氨基酸77-114,和seqidno:3的氨基酸126-136组成的组的fr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:2的氨基酸20-45,seqidno:2的氨基酸51-68,seqidno:2的氨基酸72-107,seqidno:2的氨基酸117-126,seqidno:3的氨基酸19-43,seqidno:3的氨基酸51-69,seqidno:3的氨基酸77-114,和seqidno:3的氨基酸126-136组成的fr。
在第一个方面的各实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:4的氨基酸21-46,seqidno:4的氨基酸53-69,seqidno:4的氨基酸73-108,seqidno:4的氨基酸118-127,seqidno:5的氨基酸20-44,seqidno:5的氨基酸53-69,seqidno:5的氨基酸78-115,和seqidno:5的氨基酸127-137组成的组的fr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:4的氨基酸21-46,seqidno:4的氨基酸53-69,seqidno:4的氨基酸73-108,seqidno:4的氨基酸118-127,seqidno:5的氨基酸20-44,seqidno:5的氨基酸53-69,seqidno:5的氨基酸78-115,和seqidno:5的氨基酸127-137组成的fr。
在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,和seqidno:3的氨基酸115-125组成的cdr；且包含由seqidno:2的氨基酸20-45,seqidno:2的氨基酸52-68,seqidno:2的氨基酸72-107,seqidno:2的氨基酸117-126,seqidno:3的氨基酸19-43,seqidno:3的氨基酸53-69,seqidno:3的氨基酸77-114,和seqidno:3的氨基酸126-136组成的fr。
在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的cdr,且包含由seqidno:4的氨基酸21-46,seqidno:4的氨基酸53-69,seqidno:4的氨基酸73-108,seqidno:4的氨基酸118-127,seqidno:5的氨基酸20-44,seqidno:5的氨基酸53-69,seqidno:5的氨基酸78-115,和seqidno:5的氨基酸127-137组成的fr。
在第一个方面的各实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体包含选自由seqidno:2,3,4和5组成的组的氨基酸序列。
在第一个方面的各实施方案中,该第一和/或该第二抗体包含具有选自由seqidno:2和4组成的组的氨基酸序列的轻链。
在第一个方面的各实施方案中,该第一和/或该第二抗体包含具有选自由seqidno:3和5组成的组的氨基酸序列的重链。
在第一个方面的各实施方案中,该第一或该第二抗体包含具有seqidno:2的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:3的氨基酸序列的重链。
在第一个方面的各实施方案中,该第一或第二抗体包含具有seqidno:4的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:5的氨基酸序列的重链。
在第一个方面的各实施方案中,该第一抗体或该第二抗体之一是可检测标记的。所述标记物可以是通过光谱学,光化学,生物化学,免疫化学,化学,或其它物理手段可检测的分子。在特定实施方案中,该第一或该第二抗体可以用荧光染料,电子致密试剂,酶(例如如elisa中通常使用的),生物素,洋地黄毒苷/地高辛配基,或半抗原和其它是或能成为可检测的实体标记。在特定实施方案中,该第一或第二抗体是生物素化的或钌化。用于标记抗体的方法是本领域技术人员公知的且有丰富描述,例如haugland(2003)molecularprobeshandbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,inc.；brinkley(1992)bioconjugatechem.3:2；garman(1997)non-radioactivelabeling:apracticalapproach,academicpress,london；means(1990)bioconjugatechem.1:2；glazeretal.,chemicalmodificationofproteins.laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology(t.s.workande.work,eds.)americanelsevierpublishingco.,newyork；lundblad,r.l.andnoyes,c.m.(1984)chemicalreagentsforproteinmodification,vols.iandii,crcpress,newyork；pfleiderer,g.(1985)"chemicalmodificationofproteins",modernmethodsinproteinchemistry,h.tschesche,ed.,walterdegruyter,berlinandnewyork；wong(1991)chemistryofproteinconjugationandcross-linking,crcpress,bocaraton,fla.)；deleon-rodriguezetal.,chem.eur.j.10(2004)1149-1155；lewisetal.,bioconjugatechem.12(2001)320-324；lietal.,bioconjugatechem.13(2002)110-115；和mieretal.,bioconjugatechem.16(2005)240-237。
在特定实施方案中,该第一抗体或该第二抗体之一能够结合固相或结合至固相。
在特定实施方案中,该第一抗体能够结合固相或结合至固相,且该第二抗体或其抗原结合性片段是可检测标记的。
在第一个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链。
在第一个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链。
在第一个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链。
在第一个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链。
在第一个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链。
在第一个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链。
在又一些实施方案中,该固相处于选自由珠,管,微量板的盘,和任何其它合适表面(特别是适合于进行免疫测定法的)组成的组的形式。在特定实施方案中,该珠是微珠。微珠是具有纳米和微米范围中的直径的微粒。在各实施方案中,该微粒可具有50纳米至50微米的直径。特别地,该微粒具有100nm和10μm之间的直径,特别是200nm至5μm,或750nm至5μm。微粒包含或组成为本领域技术人员知道的任何合适材料,例如它们包含或组成为或本质上组成为无机或有机材料。特别地,它们包含或组成为或本质上组成为金属或金属合金,或有机材料,或包含或组成为或本质上组成为碳水化合物要素。在特定实施方案中,该微粒的材料选自由琼脂糖,聚苯乙烯,胶乳,聚乙烯醇,硅石和铁磁性金属,合金或复合材料组成的组。微粒还可包含或组成为磁性或铁磁性金属,合金或组合物。该材料可具有特定特性,诸如例如是疏水性的或亲水性的。在特定实施方案中,该微粒分散在水溶液中且保留小负表面电荷,保持微粒分开及避免非特异性聚簇。
在特定实施方案中,该磁性或顺磁性微粒通过磁力分出。应用磁力来将顺磁性或磁性颗粒拉出溶液/悬浮液及在期望时在能去除溶液/悬浮液的液体并能例如清洗颗粒的同时保留它们。
在特定实施方案中,该第一或该第二抗体是igg抗体。在特定实施方案中,该第一或该第二抗体是igg2抗体。在特定实施方案中,该第一或该第二抗体是igg2b抗体,或其抗原结合性片段,特别是igg2b-f(ab’)2片段。
在第一个方面的各实施方案中,该样品衍生自或是体液,特别是选自由全血,血清,血浆,尿液,唾液和痰组成的组。在特定实施方案中,该样品衍生自或是全血样品,血清,或血浆。
在各实施方案中,该样品衍生自健康个体或患者。在特定实施方案中,该患者罹患增殖性病症,特别是癌症,特别是来自转移性癌症。在特定实施方案中,该患者罹患癌症,特别是转移性癌症,且用vegf-a拮抗剂治疗。在特定实施方案中,该患者罹患癌症,特别是转移性癌症,且用贝伐单抗治疗。
在特定实施方案中,该癌症选自由癌,淋巴瘤,母细胞瘤,肉瘤,和白血病组成的组。此类癌症的更加具体例子包括鳞状细胞癌,肺癌(包括小细胞肺癌,非小细胞肺癌,肺的腺癌,和肺的鳞癌),腹膜癌,肝细胞癌,胃的癌或胃癌(包括例如胃肠癌),胰腺癌(包括例如转移性胰腺癌),成胶质细胞瘤,宫颈癌,卵巢癌,肝癌,膀胱癌,肝瘤,乳腺癌(包括局部晚期,复发性或转移性her-2阴性乳腺癌,结肠癌,结肠直肠癌,子宫内膜或子宫癌,唾液腺癌,肾癌或肾的癌,肝癌,前列腺癌,外阴癌,甲状腺癌,肝的癌和各种类型的头和颈癌,以及b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)；小淋巴细胞性(sl)nhl；中级/滤泡性nhl；中级弥漫性nhl；高级成免疫细胞性nhl；高级成淋巴细胞性nhl；高级小无核裂细胞nhl；贮积病(bulkydisease)nhl；套细胞淋巴瘤；aids相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(cll)；急性成淋巴细胞性白血病(all)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；和移植后淋巴增殖性病症(ptld),以及与瘢痣病,水肿(诸如与脑瘤有关的),和梅格斯氏综合征有关的异常血管增殖。特别地,该患者罹患选自由结肠癌,肺癌,肾癌,卵巢癌,和脑的多形性成胶质细胞瘤组成的组的癌症。
在特定实施方案中,该患者是哺乳类,爬行类,鸟类或鱼类。在特定实施方案中,该患者是选自由小鼠,大鼠,家兔,或斑马鱼豚鼠,家兔,马,驴,牛,绵羊,山羊,猪,鸡,骆驼,猫,犬,海龟,陆龟,蛇,蜥蜴,金鱼和灵长动物组成的组的哺乳动物。特别地,该患者是人。
在第一个方面的又一些实施方案中,该用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的方法是免疫测定法,特别是其中形成抗体–抗原–抗体复合物(也称作三明治)的三明治式免疫测定法。技术人员会领会在用于检测vegf-a的三明治式测定法中,该第一抗体可作为捕捉抗体起作用且该第二抗体可作为示踪抗体起作用。或者,该第二抗体可作为捕捉抗体起作用且该第一抗体可作为示踪抗体起作用。
在测量样品中vegf-a的水平的特定实施方案中,将该第一和第二抗体与要分析的样品混合。
在其中在没有清洗步骤的情况下实施三明治式测定法的一个实施方案中,此类混合/温育是在一个反应器皿中实施的。添加和混合三种组分(例如分别是用第一抗体或其抗原结合性片段包被的微粒,样品,第二可检测标记的抗体或其抗原结合性片段)的顺序不是至关紧要的。将此混合物温育足够该第一抗体(特别是包被到该微粒上的该第一抗体)和该可检测标记的第二抗体结合vegf-a的时间段。
在其中在有清洗步骤的情况下实施三明治式测定法的另一个实施方案中,在一个反应器皿中顺序实施该第一抗体(特别是包被到微粒上的该第一抗体),样品和可检测标记的第二抗体或其抗原结合性片段的添加和混合。在第一个步骤(分析物捕捉步骤)中,将用该第一抗体包被的微粒与要分析的样品一起温育足够分析物,即vegf-a受到结合的时间段。在清洗步骤后,添加该可检测标记的第二抗体并温育足够该第二抗体结合分析物,即vegf-a的时间段。在各实施方案中,以竞争性测定法格式实施第一个方面的方法。
在各实施方案中,将该混合物温育少于60分钟,即少于60,55,50,45,40,35,30,25,20,15,10,或5分钟。在特定实施方案中,将该混合物温育4分钟至1小时(即4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,或60分钟)。在特定实施方案中,将该混合物温育5分钟至45分钟,即5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,或45分钟)。在特定实施方案中,将该混合物温育5分钟至30分钟,即5,6,7,8,9,10,15,20,25,或30分钟。在特定实施方案中,将该混合物温育少于9或18分钟。在各实施方案中,将该混合物温育1-12小时(即1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,或12小时)。在特定实施方案中,将该混合物温育1-4小时或8-12小时。
在又一些实施方案中,于3-40℃(即3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,或40℃)的温度温育该混合物。特别是于3℃至8℃(即3,4,5,6,7或8),特别是于4-5℃,或于20℃至25℃(即于20,21,22,23,24,或25℃),特别是于20-22℃,或于35-37℃温育该混合物。
本领域技术人员公知温育温度和温育时间取决于彼此。因而,在特定实施方案中,将该混合物于20-25℃温育10分钟至1小时,即将该混合物于20,21,22,23,24,或25℃温育10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,或60分钟。在特定实施方案中,将该混合物于22℃温育少于10分钟或少于20分钟。在各施方案中,将该混合物于3-8℃温育1-12小时。特别地,将该混合物于3-8℃,特别是于4-5℃温育1-4小时或8-12小时。
将该第一和/或该第二抗体温育足够该第一抗体包被到该微粒上和该可检测标记的第二抗体结合该样品中的vegf-a的时间段。
在特定实施方案中,该第一和/或该第二抗体包含在生理溶液中,特别是在生理缓冲液中和/或在其中温育。在特定实施方案中,该缓冲液选自taps,bicine,tris,tricine,tapso,hepes,tes,mops,pipes,卡可酸盐,和mes的组。在特定实施方案中,该缓冲液是mes缓冲液。在特定实施方案中,该mes缓冲液包含下面的成分:50mmmes,150mmnacl,2mmedta-na2(二水合物),0.1％n-methylisothiazolon-hcl,0.1％oxypyrion,0.1％polydocanol(thesit),1.0％清蛋白rpla4测定法质量,0.2％pak<->r-igg(det),millipore水,用2nnaoh将ph调节至6.30。
在特定实施方案中,经由本领域公知的任何方法检测形成的抗体–抗原–抗体复合物,特别是包含该第一抗体,vegf-a和该第二抗体的形成的复合物。在特定实施方案中,经由电化学发光,化学发光,或荧光检测形成的复合物。
在第二个方面,本发明涉及一种用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的试剂盒。所述试剂盒包含用于在vegf-a拮抗剂存在下检测vegf-a的手段。
在特定实施方案中,所述试剂盒包含第一和第二抗体。该第一和该第二抗体能够在该vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a。特别地,所述第一和所述第二抗体的结合彼此不干扰。而且,所述抗体之一结合或能够结合固相且其中所述抗体之另一是可检测标记的。因而,在第二个方面,本发明涉及一种用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的试剂盒,该试剂盒包含:第一和第二抗体,其中所述第一和所述第二抗体能够在该vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a,且其中所述第一和所述第二抗体的结合彼此不干扰,且其中所述抗体之一结合或能够结合固相且其中所述抗体之另一是可检测标记的。
在各实施方案中,该试剂盒进一步包含载体手段,它被分隔以接受处于紧密限制的一个或多个选自由管形瓶和管组成的组的容器手段。在特定实施方案中,该容器手段进一步包含要使用的数种分开的要素之一,特别是那些选自由缓冲剂,稀释剂,滤器,针,注射器,和带有使用说明书的包装插页组成的组的。该容器上可存在标签以指示该组合物用于特定应用,且还可指示关于体内或体外使用任一的说明书。
在特定实施方案中,该试剂盒包含至少一个容器,所述至少一个容器上的标签,和所述至少一个容器内含有的组合物,其中该组合物包括至少一种结合vegf-a的抗体。
特别地,该试剂盒包含至少一个容器,其包含该第一和该第二抗体,或该试剂盒包含至少两个容器,其中一个容器包含该第一抗体且第二容器包含该第二抗体。
特别地,所述容器上的标签指示该组合物可用于评估样品中vegf-a的存在。特别地,该试剂盒包括关于使用该抗体来评估特定样品类型中vegf-a的存在的说明书。该试剂盒可进一步包含用于制备样品并将抗体应用于该样品的一套说明书和材料。
在各实施方案中,该试剂盒进一步包含vegf-a拮抗剂。
在特定实施方案中,该试剂盒包含一个容器,其包含该第一抗体,该第二抗体,和该vegf-a拮抗剂,如上文在第一个方面的语境中描述的或如下文在别的方面的语境中描述的。
在特定实施方案中,该试剂盒包含两个容器,其中第一容器包含该第一抗体和该第二抗体,且其中第二容器包含该vegf-a拮抗剂,如上文在第一个方面的语境中描述的或如下文在别的方面的语境中描述的。
在特定实施方案中,该试剂盒包含三个容器,其中第一容器包含该第一抗体,第二容器包含该第二抗体,且第三容器包含该vegf-a拮抗剂,如上文在第一个方面的语境中描述的或如下文在第三个方面的语境中描述的。
在又一些实施方案中,该试剂盒还包含选自由一种或多种缓冲液(例如封闭缓冲液,清洗缓冲液,底物缓冲液,等),其它试剂诸如受到酶标签化学改变的底物(例如色原体),表位修补溶液,对照样品(阳性和/或阴性对照),对照载片,等组成的组的成分。试剂盒还可包括关于解读使用该试剂盒获得的结果的说明书。
在特定实施方案中,该第一抗体,该一个或多个容器中包含的该第二抗体,和/或该vegf-a拮抗剂以冻干形式或以溶解形式存在。在特定实施方案中,该一个或多个容器中包含的该第一抗体,该第二抗体,和/或该vegf-a拮抗剂包含在溶液中,特别是在生理溶液中。在特定实施方案中,该一个或多个容器中包含的该第一抗体,该第二抗体,和/或该vegf-a拮抗剂包含在生理缓冲液中,特别是在选自taps,bicine,tris,tricine,tapso,hepes,tes,mops,pipes,卡可酸盐,和mes的组的缓冲液中。在特定实施方案中,该一个或多个容器中包含的该第一抗体,该第二抗体,和/或该vegf-a拮抗剂包含在mes缓冲液中。在特定实施方案中,该mes缓冲液包含下面的成分:50mmmes,150mmnacl,2mmedta-na2(二水合物),0.1％n-methylisothiazolon-hcl,0.1％oxypyrion,0.1％polydocanol(thesit),1.0％清蛋白rpla4测定法质量,0.2％pak<->r-igg(det),millipore水,用2nnaoh将ph调节至6.30。
在第二个方面的各实施方案中,该试剂盒包含如上文关于第一个方面描述的和/或如下文关于别的方面描述的抗体。
在各实施方案中,该vegf-a拮抗剂阻止vegf-a和一种或多种vegf受体之间的相互作用。特别地,该vegf-a拮抗剂在该受体的结合位点处与vegf-a竞争或以如下方式改变vegf-a上针对它的受体的结合位点,即它不再能够结合它的受体或不再能够触发在正常情况下由它的结合引起的功能性作用。因而,该vegf-a拮抗剂可结合vegf-a的表位并由此阻碍vegf-a对它的受体的结合,或该vegf-a拮抗剂可结合该受体的表位并由此阻止vegf-a对该受体的结合。在特定实施方案中,该vegf-a拮抗剂结合vegf-a上的表位并由此阻止它对vegf受体的结合。在特定实施方案中,该vegf-a受体是vegfa-r1和/或vegfa-r2。
在本发明的第二个方面的又一些实施方案中,该vegf-a拮抗剂选自由多肽,肽体(peptibody),免疫粘附素,小分子和适体(aptamer)组成的组。
在其中该拮抗剂是多肽的特定实施方案中,所述多肽是抗体。在一个特定实施方案中,该抗体是抗vegf-a抗体。特别地,该抗vegf抗体是以足够亲和力和特异性结合vegf-a的抗体。在各实施方案中,该抗体具有足够的对vegf-a的结合亲和力。特别地,该抗体以100nm-1pm之间的kd值,即以100nm,50nm,1nm,900pm,800pm,700pm,600pm,500pm,400pm,300pm,200pm,100pm,50pm,或1pm的kd值结合hvegf-a。在特定实施方案中,该抗体以50nm-50pm,1nm-100pm,或700pm-300pm之间的kd值结合人vegf-a(hvegf-a)。
在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是单克隆或多克隆的。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是重组生成的。在又一些实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是嵌合抗体,特别是人源化抗vegf-a抗体。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体包含突变的人igg1框架区。该拮抗性vegf-a抗体进一步包含来自阻断人vegf对它的受体的结合的鼠抗hvegf单克隆抗体a.4.6.1的抗原结合性互补决定区(cdr)。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体的氨基酸序列的93％,包括大部分框架区,衍生自人igg1,而且该序列的约7％衍生自鼠抗体a4.6.1
在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是抗原结合性抗体片段。该抗体片段选自由fab片段,fab'片段,f(ab')2片段,单域抗体(sdab),纳米抗体(nanobody),单链fv(scfv),二价单链可变片段(di-scfv),串联scfv,双抗体(diabody),双特异性双抗体,单链双抗体(scdb),双特异性t细胞啮合剂(bite),和dart分子组成的组。在特定实施方案中,该拮抗性抗体片段是fab片段或f(ab’)2片段,特别是人源化fab片段或人源化f(ab’)2片段。
在又一些实施方案中,该vegf-a拮抗剂选自由vegf-陷阱,mucagen,ptk787,su11248,ag-013736,bay439006(索拉非尼),zd-6474,cp632,cp-547632,azd-2171,cdp-171,su-14813,chir-258,aee-788,sb786034,bay579352,cdp-791,eg-3306,gw-786034,rwj-417975/ct6758和krn-633组成的组。
在第二个方面的特定实施方案中,该试剂盒包含针对vegf-a的第一抗体和针对vegf-a的第二抗体,其中所述第一抗体和所述第二抗体在相同或不同表位处结合vegf-a。在特定实施方案中,所述第一抗体和所述第二抗体在不同表位处结合vegf-a。
vegf-a作为单体或二聚体,特别是同二聚体存在。在特定实施方案中,该第一和该第二抗体彼此不干扰。因而,这些抗体之一的结合不阻止或减少相应的另一抗体的结合。在第二个方面的各实施方案中,该第一和第二抗体结合同一单体上的两个不同表位和/或该二聚体的每一个单体上的两个不同表位。或者,该第一和该第二抗体结合该同二聚体的不同单体上的相同或实质性相同表位。在特定实施方案中,所述第一抗体和所述第二抗体在不同表位处结合vegf-a。
在特定实施方案中,该第一和该第二抗体彼此分别与该vegf-a拮抗剂结合相同或不同表位,特别是与该拮抗性抗体结合不同表位。在该第一或该第二抗体与该拮抗剂,特别是该拮抗性抗体结合相同表位的情况中,涵盖的是该第一或第二抗体以比该拮抗剂更低的kd值结合该表位。在特定实施方案中,该第一或第二抗体以1.5nm以下,特别是1nm以下,0.75nm以下,特别是0.5nm以下的kd值结合该表位。
在特定实施方案中,该第一抗体和该第二抗体彼此分别结合受到vegf受体,特别是vegf-a受体vegfa-r1和/或vegfa-r2覆盖或结合的表位。如此,所述第一抗体和所述第二抗体彼此分别与vegf-a受体,特别是vegfa-r1或vegfa-r2结合相同表位。或者,所述第一抗体和所述第二抗体彼此分别结合没有受到该vegf-a受体,诸如例如vegfa-r1或vegfa-r2直接结合但受到该受体覆盖的表位,使得该第一和/或第二抗体的结合阻止该vegf-a受体的结合。因而,在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体竞争vegfa-r1和/或vegfa-r2的结合。
在第二个方面的各实施方案中,该第一抗体或该第二抗体任一结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,seqidno:3的氨基酸115-125,seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的组的cdr。
在第二个方面的各实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,和seqidno:3的氨基酸115-125组成的组的cdr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,和seqidno:3的氨基酸115-125组成的cdr。
在第二个方面的各实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的组的cdr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的cdr。
在第二个方面的各实施方案中,该第一和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:2的氨基酸20-45,seqidno:2的氨基酸52-68,seqidno:2的氨基酸72-107,seqidno:2的氨基酸117-126,seqidno:3的氨基酸19-43,seqidno:3的氨基酸53-69,seqidno:3的氨基酸77-114,和seqidno:3的氨基酸126-136组成的组的fr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:2的氨基酸20-45,seqidno:2的氨基酸51-68,seqidno:2的氨基酸72-107,seqidno:2的氨基酸117-126,seqidno:3的氨基酸19-43,seqidno:3的氨基酸51-69,seqidno:3的氨基酸77-114,和seqidno:3的氨基酸126-136组成的fr。
在第二个方面的各实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:4的氨基酸21-46,seqidno:4的氨基酸53-69,seqidno:4的氨基酸73-108,seqidno:4的氨基酸118-127,seqidno:5的氨基酸20-44,seqidno:5的氨基酸53-69,seqidno:5的氨基酸78-115,和seqidno:5的氨基酸127-137组成的组的fr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:4的氨基酸21-46,seqidno:4的氨基酸53-69,seqidno:4的氨基酸73-108,seqidno:4的氨基酸118-127,seqidno:5的氨基酸20-44,seqidno:5的氨基酸53-69,seqidno:5的氨基酸78-115,和seqidno:5的氨基酸127-137组成的fr。
在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,和seqidno:3的氨基酸115-125组成的cdr；且包含由seqidno:2的氨基酸20-45,seqidno:2的氨基酸52-68,seqidno:2的氨基酸72-107,seqidno:2的氨基酸117-126,seqidno:3的氨基酸19-43,seqidno:3的氨基酸53-69,seqidno:3的氨基酸77-114,和seqidno:3的氨基酸126-136组成的fr。
在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的cdr,且包含由seqidno:4的氨基酸21-46,seqidno:4的氨基酸53-69,seqidno:4的氨基酸73-108,seqidno:4的氨基酸118-127,seqidno:5的氨基酸20-44,seqidno:5的氨基酸53-69,seqidno:5的氨基酸78-115,和seqidno:5的氨基酸127-137组成的fr。
在第二个方面的各实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体包含选自由seqidno:2,3,4和5组成的组的氨基酸序列。
在第二个方面的各实施方案中,该第一和/或该第二抗体包含具有选自由seqidno:2和4组成的组的氨基酸序列的轻链。
在第二个方面的各实施方案中,该第一和/或该第二抗体包含具有选自由seqidno:3和5组成的组的氨基酸序列的重链。
在第二个方面的各实施方案中,该第一或该第二抗体包含具有seqidno:2的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:3的氨基酸序列的重链。
在第二个方面的各实施方案中,该第一或第二抗体包含具有seqidno:4的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:5的氨基酸序列的重链。
在第二个方面的各实施方案中,该第一抗体或该第二抗体之一是可检测标记的。所述标记物可以是通过光谱学,光化学,生物化学,免疫化学,化学,或其它物理手段可检测的分子。在特定实施方案中,该第一或该第二抗体可以用荧光染料,电子致密试剂,酶(例如如elisa中通常使用的),生物素,洋地黄毒苷/地高辛配基,或半抗原和其它是或能成为可检测的实体标记。在特定实施方案中,该第一或第二抗体是生物素化的或钌化。用于标记抗体的方法是本领域技术人员公知的且有丰富描述,例如haugland(2003)molecularprobeshandbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,inc.；brinkley(1992)bioconjugatechem.3:2；garman(1997)non-radioactivelabeling:apracticalapproach,academicpress,london；means(1990)bioconjugatechem.1:2；glazeretal.,chemicalmodificationofproteins.laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology(t.s.workande.work,eds.)americanelsevierpublishingco.,newyork；lundblad,r.l.andnoyes,c.m.(1984)chemicalreagentsforproteinmodification,vols.iandii,crcpress,newyork；pfleiderer,g.(1985)"chemicalmodificationofproteins",modernmethodsinproteinchemistry,h.tschesche,ed.,walterdegruyter,berlinandnewyork；wong(1991)chemistryofproteinconjugationandcross-linking,crcpress,bocaraton,fla.)；deleon-rodriguezetal.,chem.eur.j.10(2004)1149-1155；lewisetal.,bioconjugatechem.12(2001)320-324；lietal.,bioconjugatechem.13(2002)110-115；和mieretal.,bioconjugatechem.16(2005)240-237。
在特定实施方案中,该第一抗体或该第二抗体之一能够结合固相或结合至固相。
在特定实施方案中,该第一抗体能够结合固相或结合至固相,且该第二抗体或其抗原结合性片段是可检测标记的。
在第二个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链。
在第二个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链。
在第二个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链。
在第二个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链。
在第二个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链。
在第二个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链。
在又一些实施方案中,该固相处于选自由珠,管,微量板的盘,和任何其它合适表面(特别是适合于进行免疫测定法的)组成的组的形式。在特定实施方案中,该珠是微珠。微珠是具有纳米和微米范围中的直径的微粒。在各实施方案中,该微粒可具有50纳米至50微米的直径。特别地,该微粒具有100nm和10μm之间的直径,特别是200nm至5μm,或750nm至5μm。微粒包含或组成为本领域技术人员知道的任何合适材料,例如它们包含或组成为或本质上组成为无机或有机材料。特别地,它们包含或组成为或本质上组成为金属或金属合金,或有机材料,或包含或组成为或本质上组成为碳水化合物要素。在特定实施方案中,该微粒的材料选自由琼脂糖,聚苯乙烯,胶乳,聚乙烯醇,硅石和铁磁性金属,合金或复合材料组成的组。微粒还可包含或组成为磁性或铁磁性金属,合金或组合物。该材料可具有特定特性,诸如例如是疏水性的或亲水性的。在特定实施方案中,该微粒分散在水溶液中且保留小负表面电荷,保持微粒分开及避免非特异性聚簇。
在特定实施方案中,该磁性或顺磁性微粒通过磁力分开。应用磁力来将顺磁性或磁性颗粒拉出溶液/悬浮液及在期望时在能去除溶液/悬浮液的液体并能例如清洗颗粒的同时保留它们。
在特定实施方案中,该第一或该第二抗体是igg抗体。在特定实施方案中,该第一或该第二抗体或其抗原结合性片段是igg2抗体。在特定实施方案中,该第一或该第二抗体是igg2b抗体,或其抗原结合性片段,特别是igg2b-f(ab’)2片段。
在特定实施方案中,该第一和/或该第二抗体包含在生理溶液中,特别是在生理缓冲液中。在特定实施方案中,该缓冲液选自taps,bicine,tris,tricine,tapso,hepes,tes,mops,pipes,卡可酸盐,和mes的组。在特定实施方案中,该缓冲液是mes缓冲液。在特定实施方案中,该mes缓冲液包含下面的成分:50mmmes,150mmnacl,2mmedta-na2(二水合物),0.1％n-methylisothiazolon-hcl,0.1％oxypyrion,0.1％polydocanol(thesit),1.0％清蛋白rpla4测定法质量,0.2％pak<->r-igg(det),millipore水,用2nnaoh将ph调节至6.30。
在特定实施方案中,如上文公开的第二个方面的试剂盒供如上文关于第一个方面公开的一种在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的方法中使用。因而,在特定实施方案中,如上文公开的第二个方面的试剂盒供一种用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的方法中使用,该方法包含:将样品与所述第一和所述第二抗体一起温育,其中所述第一和所述第二抗体均能够在该vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a且其中所述第一和所述第二抗体的结合彼此不干扰,其中所述抗体之一结合或能够结合固相且其中所述抗体之另一是可检测标记的,由此形成可检测标记的包含该第一抗体,vegf-a,和该第二抗体的复合物,并检测形成的复合物,由此在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平。
在特定实施方案中,该vegf-a是人vegf-a或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a包含依照seqidno:1的氨基酸序列或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a由依照seqidno:1的氨基酸序列或其变体组成。在特定实施方案中,该vegf-a的变体具有与vegf-a相同的功能性,即该变体是功能性变体。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现至少85％,90％,95％,98％或99％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现至少85％或至少95％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。在本发明的各实施方案中,vegf-a作为单体或二聚体,特别是同二聚体存在。
在特定实施方案中,该vegf-a是人vegf-a同等型或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a同等型是人vegf-a同等型vegf121,vegf145,vegf165,vegf189和/或vegf206,或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体具有与相应vegf-a同等型相同的功能性,即该同等型变体是功能性同等型变体。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体与该相应人vegf-a同等型的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体与该人vegf-a同等型的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体与该相应人vegf-a同等型的氨基酸序列展现至少85％,90％,95％,98％或99％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体与该相应人vegf-a同等型的氨基酸序列展现至少85％或至少95％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体与该相应人vegf-a同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。如此,在特定实施方案中,该vegf-a的vegf121同等型的变体与该人vegf121同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性；该vegf-a的vegf145同等型的变体与该人vegf145同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性；该vegf-a的vegf165同等型的变体与该人vegf165同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性；该vegf-a的vegf189同等型的变体与该人vegf189同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性；而该vegf-a的vegf206同等型的变体与该人vegf206同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。
在特定实施方案中,该vegf-a是人vegf-a片段或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a片段是人vegf-a110个氨基酸的片段或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体具有与相应vegf-a片段相同的功能性,即该片段变体是功能性片段变体。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体与该相应人vegf-a同等型的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体与人vegf-a片段的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体与该相应人vegf-a片段的氨基酸序列展现至少85％,90％,95％,98％或99％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体与该相应人vegf-a片段的氨基酸序列展现至少85％或至少95％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体与该相应人vegf-a片段的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。如此,在特定实施方案中,该vegf-a110个氨基酸的片段的变体与该人vegf-a110个氨基酸的片段的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。
在各实施方案中,该vegf-a拮抗剂阻止vegf-a和一种或多种vegf受体之间的相互作用。特别地,该vegf-a拮抗剂在该受体的结合位点处与vegf-a竞争或以如下方式改变vegf-a上针对它的受体的结合位点,即它不再能够结合它的受体或不再能够触发在正常情况下由它的结合引起的功能性作用。因而,该vegf-a拮抗剂可结合vegf-a的表位并由此阻碍vegf-a对它的受体的结合,或该vegf-a拮抗剂可结合该受体的表位并由此阻止vegf-a对该受体的结合。在特定实施方案中,该vegf-a拮抗剂结合vegf-a上的表位并由此阻止它对vegf受体的结合。在特定实施方案中,该vegf-a受体是vegfa-r1和/或vegfa-r2。
在本发明的第二个方面的又一些实施方案中,该vegf-a拮抗剂选自由多肽,肽体(peptibody),免疫粘附素,小分子和适体(aptamer)组成的组。
在其中该拮抗剂是多肽的特定实施方案中,所述多肽是抗体。在一个特定实施方案中,该抗体是抗vegf-a抗体。特别地,该抗vegf抗体是以足够亲和力和特异性结合vegf-a的抗体。在各实施方案中,该抗体具有足够的对vegf-a的结合亲和力。特别地,该抗体或其抗原结合性片段以100nm-1pm之间的kd值,即以100nm,50nm,1nm,900pm,800pm,700pm,600pm,500pm,400pm,300pm,200pm,100pm,50pm,或1pm的kd值结合hvegf-a。在特定实施方案中,该抗体或其抗原结合性片段以50nm-50pm,1nm-100pm,或700pm-300pm之间的kd值结合人vegf-a(hvegf-a)。
在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是单克隆或多克隆的。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是重组生成的。在又一些实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是嵌合抗体,特别是人源化抗vegf-a抗体。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体包含突变的人igg1框架区。该拮抗性vegf-a抗体进一步包含来自阻断人vegf对它的受体的结合的鼠抗hvegf单克隆抗体a.4.6.1的抗原结合性互补决定区(cdr)。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体的氨基酸序列的93％,包括大部分框架区,衍生自人igg1,而且该序列的约7％衍生自鼠抗体a4.6.1
在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是抗体片段。该抗体片段选自由fab片段,fab'片段,f(ab')2片段,单域抗体(sdab),纳米抗体(nanobody),单链fv(scfv),二价单链可变片段(di-scfv),串联scfv,双抗体(diabody),双特异性双抗体,单链双抗体(scdb),双特异性t细胞啮合剂(bite),和dart分子组成的组。在特定实施方案中,该拮抗性抗体片段是fab片段或f(ab’)2片段,特别是人源化fab片段或人源化f(ab’)2片段。
在又一些实施方案中,该vegf-a拮抗剂选自由vegf-陷阱,mucagen,ptk787,su11248,ag-013736,bay439006(索拉非尼),zd-6474,cp632,cp-547632,azd-2171,cdp-171,su-14813,chir-258,aee-788,sb786034,bay579352,cdp-791,eg-3306,gw-786034,rwj-417975/ct6758和krn-633组成的组。
在第二个方面的各实施方案中,该样品衍生自或是体液,特别是选自由全血,血清,血浆,尿液,唾液和痰组成的组。在特定实施方案中,该样品衍生自或是全血样品,血清,或血浆。
在各实施方案中,该样品衍生自健康个体或患者。在特定实施方案中,该患者罹患增殖性病症,特别是癌症,特别是来自转移性癌症。在特定实施方案中,该患者罹患癌症,特别是转移性癌症,且用vegf-a拮抗剂治疗。在特定实施方案中,该患者罹患癌症,特别是转移性癌症,且用贝伐单抗治疗。
在特定实施方案中,该癌症选自由癌,淋巴瘤,母细胞瘤,肉瘤,和白血病组成的组。此类癌症的更加具体例子包括鳞状细胞癌,肺癌(包括小细胞肺癌,非小细胞肺癌,肺的腺癌,和肺的鳞癌),腹膜癌,肝细胞癌,胃的癌或胃癌(包括例如胃肠癌),胰腺癌(包括例如转移性胰腺癌),成胶质细胞瘤,宫颈癌,卵巢癌,肝癌,膀胱癌,肝瘤,乳腺癌(包括局部晚期,复发性或转移性her-2阴性乳腺癌,结肠癌,结肠直肠癌,子宫内膜或子宫癌,唾液腺癌,肾癌或肾的癌,肝癌,前列腺癌,外阴癌,甲状腺癌,肝的癌和各种类型的头和颈癌,以及b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)；小淋巴细胞性(sl)nhl；中级/滤泡性nhl；中级弥漫性nhl；高级成免疫细胞性nhl；高级成淋巴细胞性nhl；高级小无核裂细胞nhl；贮积病(bulkydisease)nhl；套细胞淋巴瘤；aids相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(cll)；急性成淋巴细胞性白血病(all)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；和移植后淋巴增殖性病症(ptld),以及与瘢痣病,水肿(诸如与脑瘤有关的),和梅格斯氏综合征有关的异常血管增殖。特别地,该患者罹患选自由结肠癌,肺癌,肾癌,卵巢癌,和脑的多形性成胶质细胞瘤组成的组的癌症。
在特定实施方案中,该患者是哺乳类,爬行类,鸟类或鱼类。在特定实施方案中,该患者是选自由小鼠,大鼠,家兔,或斑马鱼豚鼠,家兔,马,驴,牛,绵羊,山羊,猪,鸡,骆驼,猫,犬,海龟,陆龟,蛇,蜥蜴,金鱼和灵长动物组成的组的哺乳动物。特别地,该患者是人。
在又一些实施方案中,使用第二个方面的试剂盒的该用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的方法是免疫测定法,特别是其中形成抗体–抗原–抗体复合物(也称作三明治)的三明治式免疫测定法。技术人员会领会在用于检测vegf-a的三明治式测定法中,该第一抗体可作为捕捉抗体起作用且该第二抗体可作为示踪抗体起作用。或者,该第二抗体可作为捕捉抗体起作用且该第一抗体可作为示踪抗体起作用。
在测量样品中vegf-a的水平的特定实施方案中,将该第一和第二抗体与要分析的样品混合。
在其中在没有清洗步骤的情况下实施三明治式测定法的一个实施方案中,此类混合/温育是在一个反应器皿中实施的。添加和混合三种组分(例如分别是用第一抗体或其抗原结合性片段包被的微粒,样品,第二可检测标记的抗体或其抗原结合性片段)的顺序不是至关紧要的。将此混合物温育足够该第一抗体(特别是包被到该微粒上的该第一抗体)和该可检测标记的第二抗体结合vegf-a的时间段。
在其中在有清洗步骤的情况下实施三明治式测定法的另一个实施方案中,在一个反应器皿中顺序实施该第一抗体(特别是包被到微粒上的该第一抗体),样品和可检测标记的第二抗体或其抗原结合性片段的添加和混合。在第一个步骤(分析物捕捉步骤)中,将用该第一抗体包被的微粒与要分析的样品一起温育足够分析物,即vegf-a受到结合的时间段。在清洗步骤后,添加该可检测标记的第二抗体并温育足够该第二抗体结合分析物,即vegf-a的时间段。在各实施方案中,以竞争性测定法格式实施第一个方面的方法。
在各实施方案中,将该混合物温育少于60分钟,即少于60,55,50,45,40,35,30,25,20,15,10,或5分钟。在特定实施方案中,将该混合物温育4分钟至1小时(即4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,或60分钟)。在特定实施方案中,将该混合物温育5分钟至45分钟,即5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,或45分钟)。在特定实施方案中,将该混合物温育5分钟至30分钟,即5,6,7,8,9,10,15,20,25,或30分钟。在特定实施方案中,将该混合物温育9或18分钟。在各实施方案中,将该混合物温育1-12小时(即1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,或12小时)。在特定实施方案中,将该混合物温育1-4小时或8-12小时。
在又一些实施方案中,于3-40℃(即3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,或40℃)的温度温育该混合物。特别是于3℃至8℃(即3,4,5,6,7或8),特别是于4-5℃,或于20℃至25℃(即于20,21,22,23,24,或25℃),特别是于20-22℃,或于35-37℃温育该混合物。
本领域技术人员公知温育温度和温育时间取决于彼此。因而,在特定实施方案中,将该混合物于20-25℃温育10分钟至1小时,即将该混合物于20,21,22,23,24,或25℃温育10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,或60分钟。在特定实施方案中,将该混合物于22℃温育少于10分钟或少于20分钟。在各施方案中,将该混合物于3-8℃温育1-12小时。特别地,将该混合物于3-8℃,特别是于4-5℃温育1-4小时或8-12小时。
将该第一和/或该第二抗体温育足够该第一抗体包被到该微粒上和该可检测标记的第二抗体结合该样品中的vegf-a的时间段。
在特定实施方案中,该第一和/或该第二抗体包含在生理溶液中,特别是在生理缓冲液中和/或在其中温育。在特定实施方案中,该缓冲液选自taps,bicine,tris,tricine,tapso,hepes,tes,mops,pipes,卡可酸盐,和mes的组。在特定实施方案中,该缓冲液是mes缓冲液。在特定实施方案中,该mes缓冲液包含下面的成分:50mmmes,150mmnacl,2mmedta-na2(二水合物),0.1％n-methylisothiazolon-hcl,0.1％oxypyrion,0.1％polydocanol(thesit),1.0％清蛋白rpla4测定法质量,0.2％pak<->r-igg(det),millipore水,用2nnaoh将ph调节至6.30。
在特定实施方案中,经由本领域公知的任何方法检测形成的抗体–抗原–抗体复合物,特别是包含该第一抗体,vegf-a和该第二抗体的形成的复合物。在特定实施方案中,经由电化学发光,化学发光,或荧光检测形成的复合物。
在第三个方面,本发明涉及一种包含第一和第二抗体的物质组合物。特别地,所述第一和所述第二抗体能够在vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a。特别地,所述第一和所述第二抗体的结合彼此不干扰。特别地,所述抗体之一结合或能够结合固相且其中所述抗体之另一是可检测标记的。因而,在第三个方面,本发明涉及一种包含第一抗体和第二抗体的物质组合物,其中所述第一和所述第二抗体能够在vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a,其中所述第一和所述第二抗体的结合彼此不干扰,且其中所述抗体之一结合或能够结合固相且其中所述抗体之另一是可检测标记的。
在特定实施方案中,该第一和该第二抗体彼此不干扰。因而,这些抗体之一的结合不阻止或减少相应的另一抗体的结合。在第三个方面的特定实施方案中,该物质组合物包含针对vegf-a的第一抗体和针对vegf-a的第二抗体,其中所述第一抗体和所述第二抗体在相同或不同表位处结合vegf-a。在本发明的各实施方案中,该第一和第二抗体结合同一单体上的两个不同表位和/或至二聚体的每一个单体上的两个不同表位。或者,该第一和该第二抗体结合同二聚体的不同单体上的相同或实质性相同表位。在特定实施方案中,所述第一抗体和所述第二抗体在不同表位处结合vegf-a。
在特定实施方案中,该第一和该第二抗体彼此分别与该vegf-a拮抗剂结合相同或不同表位,特别是与该拮抗性抗体结合不同表位。在该第一或该第二抗体与该拮抗剂,特别是该拮抗性抗体结合相同表位的情况中,涵盖的是该第一或第二抗体以比该拮抗剂更低的kd值结合该表位。在特定实施方案中,该第一或第二抗体以1.5nm以下,特别是1nm以下,0.75nm以下,特别是0.5nm以下的kd值结合该表位。
在特定实施方案中,该第一抗体和该第二抗体彼此分别结合受到vegf受体,特别是vegf-a受体vegfa-r1和/或vegfa-r2覆盖或结合的表位。如此,所述第一抗体和所述第二抗体彼此分别与vegf-a受体,特别是vegfa-r1或vegfa-r2结合相同表位。或者,所述第一抗体和所述第二抗体彼此分别结合没有受到该vegf-a受体,诸如例如vegfa-r1或vegfa-r2直接结合但受到该受体覆盖的表位,使得该第一和/或第二抗体的结合阻止该vegf-a受体的结合。因而,在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体竞争vegfa-r1和/或vegfa-r2的结合。
vegf-a作为单体或二聚体,特别是同二聚体存在。因而,在第三个方面的各实施方案中,该第一抗体和该第二抗体结合同一单体上的两个不同表位和/或二聚体的每一个单体上的两个不同表位。或者,该第一和该第二抗体结合同二聚体的不同单体上的相同或实质性相同表位。
在第三个方面的各实施方案中,该第一抗体或该第二抗体任一结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,seqidno:3的氨基酸115-125,seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的组的cdr。
在第三个方面的各实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,和seqidno:3的氨基酸115-125组成的组的cdr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,和seqidno:3的氨基酸115-125组成的cdr。
在第三个方面的各实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的组的cdr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的cdr。
在第三个方面的各实施方案中,该第一和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:2的氨基酸20-45,seqidno:2的氨基酸52-68,seqidno:2的氨基酸72-107,seqidno:2的氨基酸117-126,seqidno:3的氨基酸19-43,seqidno:3的氨基酸53-69,seqidno:3的氨基酸77-114,和seqidno:3的氨基酸126-136组成的组的fr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:2的氨基酸20-45,seqidno:2的氨基酸51-68,seqidno:2的氨基酸72-107,seqidno:2的氨基酸117-126,seqidno:3的氨基酸19-43,seqidno:3的氨基酸51-69,seqidno:3的氨基酸77-114,和seqidno:3的氨基酸126-136组成的fr。
在第三个方面的各实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:4的氨基酸21-46,seqidno:4的氨基酸53-69,seqidno:4的氨基酸73-108,seqidno:4的氨基酸118-127,seqidno:5的氨基酸20-44,seqidno:5的氨基酸53-69,seqidno:5的氨基酸78-115,和seqidno:5的氨基酸127-137组成的组的fr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:4的氨基酸21-46,seqidno:4的氨基酸53-69,seqidno:4的氨基酸73-108,seqidno:4的氨基酸118-127,seqidno:5的氨基酸20-44,seqidno:5的氨基酸53-69,seqidno:5的氨基酸78-115,和seqidno:5的氨基酸127-137组成的fr。
在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,和seqidno:3的氨基酸115-125组成的cdr；且包含由seqidno:2的氨基酸20-45,seqidno:2的氨基酸52-68,seqidno:2的氨基酸72-107,seqidno:2的氨基酸117-126,seqidno:3的氨基酸19-43,seqidno:3的氨基酸53-69,seqidno:3的氨基酸77-114,和seqidno:3的氨基酸126-136组成的fr。
在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的cdr,且包含由seqidno:4的氨基酸21-46,seqidno:4的氨基酸53-69,seqidno:4的氨基酸73-108,seqidno:4的氨基酸118-127,seqidno:5的氨基酸20-44,seqidno:5的氨基酸53-69,seqidno:5的氨基酸78-115,和seqidno:5的氨基酸127-137组成的fr。
在第三个方面的各实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体包含选自由seqidno:2,3,4和5组成的组的氨基酸序列。
在第三个方面的各实施方案中,该第一和/或该第二抗体包含具有选自由seqidno:2和4组成的组的氨基酸序列的轻链。
在第三个方面的各实施方案中,该第一和/或该第二抗体包含具有选自由seqidno:3和5组成的组的氨基酸序列的重链。
在第三个方面的各实施方案中,该第一或该第二抗体包含具有seqidno:2的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:3的氨基酸序列的重链。
在第三个方面的各实施方案中,该第一或第二抗体包含具有seqidno:4的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:5的氨基酸序列的重链。
在第三个方面的各实施方案中,该第一抗体或该第二抗体之一是可检测标记的。所述标记物可以是通过光谱学,光化学,生物化学,免疫化学,化学,或其它物理手段可检测的分子。在特定实施方案中,该第一或该第二抗体可以用荧光染料,电子致密试剂,酶(例如如elisa中通常使用的),生物素,洋地黄毒苷/地高辛配基,或半抗原和其它是或能成为可检测的实体标记。在特定实施方案中,该第一或第二抗体是生物素化的或钌化。用于标记抗体的方法是本领域技术人员公知的且有丰富描述,例如haugland(2003)molecularprobeshandbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,inc.；brinkley(1992)bioconjugatechem.3:2；garman(1997)non-radioactivelabeling:apracticalapproach,academicpress,london；means(1990)bioconjugatechem.1:2；glazeretal.,chemicalmodificationofproteins.laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology(t.s.workande.work,eds.)americanelsevierpublishingco.,newyork；lundblad,r.l.andnoyes,c.m.(1984)chemicalreagentsforproteinmodification,vols.iandii,crcpress,newyork；pfleiderer,g.(1985)"chemicalmodificationofproteins",modernmethodsinproteinchemistry,h.tschesche,ed.,walterdegruyter,berlinandnewyork；wong(1991)chemistryofproteinconjugationandcross-linking,crcpress,bocaraton,fla.)；deleon-rodriguezetal.,chem.eur.j.10(2004)1149-1155；lewisetal.,bioconjugatechem.12(2001)320-324；lietal.,bioconjugatechem.13(2002)110-115；和mieretal.,bioconjugatechem.16(2005)240-237。
在特定实施方案中,该第一抗体或该第二抗体之一能够结合固相或结合至固相。
在特定实施方案中,该第一抗体能够结合固相或结合至固相,且该第二抗体是可检测标记的。
在第三个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链。
在第三个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链。
在第三个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链。
在第三个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链。
在第三个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链。
在第三个方面的又一些实施方案中,该第一抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链,且该第二抗体是可检测标记的且具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链。
在又一些实施方案中,该固相处于选自由珠,管,微量板的盘,和任何其它合适表面(特别是适合于进行免疫测定法的)组成的组的形式。在特定实施方案中,该珠是微珠。微珠是具有纳米和微米范围中的直径的微粒。在各实施方案中,该微粒可具有50纳米至50微米的直径。特别地,该微粒具有100nm和10μm之间的直径,特别是200nm至5μm,或750nm至5μm。微粒包含或组成为本领域技术人员知道的任何合适材料,例如它们包含或组成为或本质上组成为无机或有机材料。特别地,它们包含或组成为或本质上组成为金属或金属合金,或有机材料,或包含或组成为或本质上组成为碳水化合物要素。在特定实施方案中,该微粒的材料选自由琼脂糖,聚苯乙烯,胶乳,聚乙烯醇,硅石和铁磁性金属,合金或复合材料组成的组。微粒还可包含或组成为磁性或铁磁性金属,合金或组合物。该材料可具有特定特性,诸如例如是疏水性的或亲水性的。在特定实施方案中,该微粒分散在水溶液中且保留小负表面电荷,保持微粒分开及避免非特异性聚簇。
在特定实施方案中,该磁性或顺磁性微粒通过磁力分开。应用磁力来将顺磁性或磁性颗粒拉出溶液/悬浮液及在期望时在能去除溶液/悬浮液的液体并能例如清洗颗粒的同时保留它们。
在特定实施方案中,该第一或该第二抗体是igg抗体。在特定实施方案中,该第一或该第二抗体是igg2抗体。在特定实施方案中,该第一或该第二抗体是igg2b抗体,或其抗原结合性片段,特别是igg2b-f(ab’)2片段。
在特定实施方案中,该物质组合物进一步包含vegf-a拮抗剂。
在各实施方案中,该vegf-a拮抗剂阻止vegf-a和一种或多种vegf受体之间的相互作用。特别地,该vegf-a拮抗剂在该受体的结合位点处与vegf-a竞争或以如下方式改变vegf-a上针对它的受体的结合位点,即它不再能够结合它的受体或不再能够触发在正常情况下由它的结合引起的功能性作用。因而,该vegf-a拮抗剂可结合vegf-a的表位并由此阻碍vegf-a对它的受体的结合,或该vegf-a拮抗剂可结合该受体的表位并由此阻止vegf-a对该受体的结合。在特定实施方案中,该vegf-a拮抗剂结合vegf-a上的表位并由此阻止它对vegf受体的结合。在特定实施方案中,该vegf-a受体是vegfa-r1和/或vegfa-r2。
在本发明的第三个方面的又一些实施方案中,该vegf-a拮抗剂选自由多肽,肽体(peptibody),免疫粘附素,小分子和适体(aptamer)组成的组。
在其中该拮抗剂是多肽的特定实施方案中,所述多肽是抗体。在一个特定实施方案中,该抗体是抗vegf-a抗体。特别地,该抗vegf抗体是以足够亲和力和特异性结合vegf-a的抗体或其抗原结合性片段。在各实施方案中,该抗体或其抗原结合性片段具有足够的对vegf-a的结合亲和力。特别地,该抗体或其抗原结合性片段以100nm-1pm之间的kd值,即以100nm,50nm,1nm,900pm,800pm,700pm,600pm,500pm,400pm,300pm,200pm,100pm,50pm,或1pm的kd值结合hvegf-a。在特定实施方案中,该抗体或其抗原结合性片段以50nm-50pm,1nm-100pm,或700pm-300pm之间的kd值结合人vegf-a(hvegf-a)。
在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是单克隆或多克隆的。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体或其抗原结合性片段是重组生成的。在又一些实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是嵌合抗体,特别是人源化抗vegf-a抗体。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体包含突变的人igg1框架区。该拮抗性vegf-a抗体进一步包含来自阻断人vegf对它的受体的结合的鼠抗hvegf单克隆抗体a.4.6.1的抗原结合性互补决定区(cdr)。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体的氨基酸序列的93％,包括大部分框架区,衍生自人igg1,而且该序列的约7％衍生自鼠抗体a4.6.1
在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是抗体片段。该抗体片段选自由fab片段,fab'片段,f(ab')2片段,单域抗体(sdab),纳米抗体(nanobody),单链fv(scfv),二价单链可变片段(di-scfv),串联scfv,双抗体(diabody),双特异性双抗体,单链双抗体(scdb),双特异性t细胞啮合剂(bite),和dart分子组成的组。在特定实施方案中,该拮抗性抗体片段是fab片段或f(ab’)2片段,特别是人源化fab片段或人源化f(ab’)2片段。
在又一些实施方案中,该vegf-a拮抗剂选自由vegf-陷阱,mucagen,ptk787,su11248,ag-013736,bay439006(索拉非尼),zd-6474,cp632,cp-547632,azd-2171,cdp-171,su-14813,chir-258,aee-788,sb786034,bay579352,cdp-791,eg-3306,gw-786034,rwj-417975/ct6758和krn-633组成的组。
在特定实施方案中,该第一和/或该第二抗体和/或该vegf-a拮抗剂包含在生理溶液中,特别是在生理缓冲液中。在特定实施方案中,该缓冲液选自taps,bicine,tris,tricine,tapso,hepes,tes,mops,pipes,卡可酸盐,和mes的组。在特定实施方案中,该缓冲液是mes缓冲液。在特定实施方案中,该mes缓冲液包含下面的成分:50mmmes,150mmnacl,2mmedta-na2(二水合物),0.1％n-methylisothiazolon-hcl,0.1％oxypyrion,0.1％polydocanol(thesit),1.0％清蛋白rpla4测定法质量,0.2％pak<->r-igg(det),millipore水,用2nnaoh将ph调节至6.30。
在特定实施方案中,如上文公开的物质组合物供如上文关于第一个方面公开的一种在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的方法中使用。因而,在特定实施方案中,如上文公开的物质组合物供一种用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的方法中使用,该方法包含:将样品与所述第一和所述第二抗体一起温育,其中所述第一和所述第二抗体均能够在该vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a且其中所述第一和所述第二抗体的结合彼此不干扰,其中所述抗体之一结合或能够结合固相且其中所述抗体之另一是可检测标记的,由此形成可检测标记的包含该第一抗体,vegf-a,和该第二抗体的复合物,并检测形成的复合物,由此在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平。
在特定实施方案中,该vegf-a是人vegf-a或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a包含依照seqidno:1的氨基酸序列或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a由依照seqidno:1的氨基酸序列或其变体组成。在特定实施方案中,该vegf-a的变体具有与vegf-a相同的功能性,即该变体是功能性变体。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现至少85％,90％,95％,98％或99％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现至少85％或至少95％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。在本发明的各实施方案中,vegf-a作为单体或二聚体,特别是同二聚体存在。
在特定实施方案中,该vegf-a是人vegf-a同等型或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a同等型是人vegf-a同等型vegf121,vegf145,vegf165,vegf189和/或vegf206,或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体具有与相应vegf-a同等型相同的功能性,即该同等型变体是功能性同等型变体。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体与该相应人vegf-a同等型的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体与该人vegf-a同等型的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体与该相应人vegf-a同等型的氨基酸序列展现至少85％,90％,95％,98％或99％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体与该相应人vegf-a同等型的氨基酸序列展现至少85％或至少95％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a同等型的变体与该相应人vegf-a同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。如此,在特定实施方案中,该vegf-a的vegf121同等型的变体与该人vegf121同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性；该vegf-a的vegf145同等型的变体与该人vegf145同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性；该vegf-a的vegf165同等型的变体与该人vegf165同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性；该vegf-a的vegf189同等型的变体与该人vegf189同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性；而该vegf-a的vegf206同等型的变体与该人vegf206同等型的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。
在特定实施方案中,该vegf-a是人vegf-a片段或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a片段是人vegf-a110个氨基酸的片段或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体具有与相应vegf-a片段相同的功能性,即该片段变体是功能性片段变体。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体与该相应人vegf-a同等型的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体与人vegf-a片段的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体与该相应人vegf-a片段的氨基酸序列展现至少85％,90％,95％,98％或99％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体与该相应人vegf-a片段的氨基酸序列展现至少85％或至少95％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a片段的变体与该相应人vegf-a片段的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。如此,在特定实施方案中,该vegf-a110个氨基酸的片段的变体与该人vegf-a110个氨基酸的片段的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。
在各实施方案中,该vegf-a拮抗剂阻止vegf-a和一种或多种vegf受体之间的相互作用。特别地,该vegf-a拮抗剂在该受体的结合位点处与vegf-a竞争或以如下方式改变vegf-a上针对它的受体的结合位点,即它不再能够结合它的受体或不再能够触发在正常情况下由它的结合引起的功能性作用。因而,该vegf-a拮抗剂可结合vegf-a的表位并由此阻碍vegf-a对它的受体的结合,或该vegf-a拮抗剂可结合该受体的表位并由此阻止vegf-a对该受体的结合。在特定实施方案中,该vegf-a拮抗剂结合vegf-a上的表位并由此阻止它对vegf受体的结合。在特定实施方案中,该vegf-a受体是vegfa-r1和/或vegfa-r2。
在本发明的第三个方面的又一些实施方案中,该vegf-a拮抗剂选自由多肽,肽体(peptibody),免疫粘附素,小分子和适体(aptamer)组成的组。
在其中该拮抗剂是多肽的特定实施方案中,所述多肽是抗体。在一个特定实施方案中,该抗体是抗vegf-a抗体。特别地,该抗vegf抗体是以足够亲和力和特异性结合vegf-a的抗体。在各实施方案中,该抗体具有足够的对vegf-a的结合亲和力。特别地,该抗体或其抗原结合性片段以100nm-1pm之间的kd值,即以100nm,50nm,1nm,900pm,800pm,700pm,600pm,500pm,400pm,300pm,200pm,100pm,50pm,或1pm的kd值结合hvegf-a。在特定实施方案中,该抗体或其抗原结合性片段以50nm-50pm,1nm-100pm,或700pm-300pm之间的kd值结合人vegf-a(hvegf-a)。
在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是单克隆或多克隆的。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是重组生成的。在又一些实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是嵌合抗体,特别是人源化抗vegf-a抗体。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体包含突变的人igg1框架区。该拮抗性vegf-a抗体进一步包含来自阻断人vegf对它的受体的结合的鼠抗hvegf单克隆抗体a.4.6.1的抗原结合性互补决定区(cdr)。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体的氨基酸序列的93％,包括大部分框架区,衍生自人igg1,而且该序列的约7％衍生自鼠抗体a4.6.1
在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是抗体片段。该抗体片段选自由fab片段,fab'片段,f(ab')2片段,单域抗体(sdab),纳米抗体(nanobody),单链fv(scfv),二价单链可变片段(di-scfv),串联scfv,双抗体(diabody),双特异性双抗体,单链双抗体(scdb),双特异性t细胞啮合剂(bite),和dart分子组成的组。在特定实施方案中,该拮抗性抗体片段是fab片段或f(ab’)2片段,特别是人源化fab片段或人源化f(ab’)2片段。
在又一些实施方案中,该vegf-a拮抗剂选自由vegf-陷阱,mucagen,ptk787,su11248,ag-013736,bay439006(索拉非尼),zd-6474,cp632,cp-547632,azd-2171,cdp-171,su-14813,chir-258,aee-788,sb786034,bay579352,cdp-791,eg-3306,gw-786034,rwj-417975/ct6758和krn-633组成的组。
在第三个方面的各实施方案中,该样品衍生自或是体液,特别是选自由全血,血清,血浆,尿液,唾液和痰组成的组。在特定实施方案中,该样品衍生自或是全血样品,血清,或血浆。
在各实施方案中,该样品衍生自健康个体或患者。在特定实施方案中,该患者罹患增殖性病症,特别是癌症,特别是来自转移性癌症。在特定实施方案中,该患者罹患癌症,特别是转移性癌症,且用vegf-a拮抗剂治疗。在特定实施方案中,该患者罹患癌症,特别是转移性癌症,且用贝伐单抗治疗。
在特定实施方案中,该癌症选自由癌,淋巴瘤,母细胞瘤,肉瘤,和白血病组成的组。此类癌症的更加具体例子包括鳞状细胞癌,肺癌(包括小细胞肺癌,非小细胞肺癌,肺的腺癌,和肺的鳞癌),腹膜癌,肝细胞癌,胃的癌或胃癌(包括例如胃肠癌),胰腺癌(包括例如转移性胰腺癌),成胶质细胞瘤,宫颈癌,卵巢癌,肝癌,膀胱癌,肝瘤,乳腺癌(包括局部晚期,复发性或转移性her-2阴性乳腺癌,结肠癌,结肠直肠癌,子宫内膜或子宫癌,唾液腺癌,肾癌或肾的癌,肝癌,前列腺癌,外阴癌,甲状腺癌,肝的癌和各种类型的头和颈癌,以及b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)；小淋巴细胞性(sl)nhl；中级/滤泡性nhl；中级弥漫性nhl；高级成免疫细胞性nhl；高级成淋巴细胞性nhl；高级小无核裂细胞nhl；贮积病(bulkydisease)nhl；套细胞淋巴瘤；aids相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(cll)；急性成淋巴细胞性白血病(all)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；和移植后淋巴增殖性病症(ptld),以及与瘢痣病,水肿(诸如与脑瘤有关的),和梅格斯氏综合征有关的异常血管增殖。特别地,该患者罹患选自由结肠癌,肺癌,肾癌,卵巢癌,和脑的多形性成胶质细胞瘤组成的组的癌症。
在特定实施方案中,该患者是哺乳类,爬行类,鸟类或鱼类。在特定实施方案中,该患者是选自由小鼠,大鼠,家兔,或斑马鱼豚鼠,家兔,马,驴,牛,绵羊,山羊,猪,鸡,骆驼,猫,犬,海龟,陆龟,蛇,蜥蜴,金鱼和灵长动物组成的组的哺乳动物。特别地,该患者是人。
在又一些实施方案中,使用如上文公开的物质组合物的该用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的方法是免疫测定法,特别是其中形成抗体–抗原–抗体复合物(也称作三明治)的三明治式免疫测定法。技术人员会领会在用于检测vegf-a的三明治式测定法中,该第一抗体可作为捕捉抗体起作用且该第二抗体可作为示踪抗体起作用。或者,该第二抗体可作为捕捉抗体起作用且该第一抗体可作为示踪抗体起作用。
在测量样品中vegf-a的水平的特定实施方案中,将该第一和第二抗体与要分析的样品混合。
在其中在没有清洗步骤的情况下实施三明治式测定法的一个实施方案中,此类混合/温育是在一个反应器皿中实施的。添加和混合三种组分(例如分别是用第一抗体或其抗原结合性片段包被的微粒,样品,第二可检测标记的抗体或其抗原结合性片段)的顺序不是至关紧要的。将此混合物温育足够该第一抗体(特别是包被到该微粒上的该第一抗体)和该可检测标记的第二抗体结合vegf-a的时间段。
在其中在有清洗步骤的情况下实施三明治式测定法的另一个实施方案中,在一个反应器皿中顺序实施该第一抗体(特别是包被到微粒上的该第一抗体),样品和可检测标记的第二抗体或其抗原结合性片段的添加和混合。在第一个步骤(分析物捕捉步骤)中,将用该第一抗体包被的微粒与要分析的样品一起温育足够分析物,即vegf-a受到结合的时间段。在清洗步骤后,添加该可检测标记的第二抗体并温育足够该第二抗体结合分析物,即vegf-a的时间段。在各实施方案中,以竞争性测定法格式实施第一个方面的方法。
在各实施方案中,将该混合物温育少于60分钟,即少于60,55,50,45,40,35,30,25,20,15,10,或5分钟。在特定实施方案中,将该混合物温育4分钟至1小时(即4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,或60分钟)。在特定实施方案中,将该混合物温育5分钟至45分钟,即5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,或45分钟)。在特定实施方案中,将该混合物温育5分钟至30分钟,即5,6,7,8,9,10,15,20,25,或30分钟。在特定实施方案中,将该混合物温育9或18分钟。在各实施方案中,将该混合物温育1-12小时(即1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,或12小时)。在特定实施方案中,将该混合物温育1-4小时或8-12小时。
在又一些实施方案中,于3-40℃(即3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,或40℃)的温度温育该混合物。特别是于3℃至8℃(即3,4,5,6,7或8),特别是于4-5℃,或于20℃至25℃(即于20,21,22,23,24,或25℃),特别是于20-22℃,或于35-37℃温育该混合物。
本领域技术人员公知温育温度和温育时间取决于彼此。因而,在特定实施方案中,将该混合物于20-25℃温育10分钟至1小时,即将该混合物于20,21,22,23,24,或25℃温育10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,或60分钟。在特定实施方案中,将该混合物于22℃温育少于10分钟或少于20分钟。在各施方案中,将该混合物于3-8℃温育1-12小时。特别地,将该混合物于3-8℃,特别是于4-5℃温育1-4小时或8-12小时。
将该第一和/或该第二抗体温育足够该第一抗体包被到该微粒上和该可检测标记的第二抗体结合该样品中的vegf-a的时间段。
在特定实施方案中,该第一和/或该第二抗体包含在生理溶液中,特别是在生理缓冲液中和/或在其中温育。在特定实施方案中,该缓冲液选自taps,bicine,tris,tricine,tapso,hepes,tes,mops,pipes,卡可酸盐,和mes的组。在特定实施方案中,该缓冲液是mes缓冲液。在特定实施方案中,该mes缓冲液包含下面的成分:50mmmes,150mmnacl,2mmedta-na2(二水合物),0.1％n-methylisothiazolon-hcl,0.1％oxypyrion,0.1％polydocanol(thesit),1.0％清蛋白rpla4测定法质量,0.2％pak<->r-igg(det),millipore水,用2nnaoh将ph调节至6.30。
在特定实施方案中,经由本领域公知的任何方法检测形成的抗体–抗原–抗体复合物,特别是包含该第一抗体,vegf-a和该第二抗体的形成的复合物。在特定实施方案中,经由电化学发光,化学发光,或荧光检测形成的复合物。
在第四个方面,本发明涉及一种检测包含人vegf-a作为第一蛋白和非人或嵌合蛋白作为第二蛋白的蛋白质复合物的方法,其包含如下步骤:
(a)将包含所述复合物的样品与可检测标记的结合或能够结合所述复合物的vegf-a和/或第二非人或嵌合蛋白的抗体一起温育,并
(b)检测结合至该复合物的该可检测标记的抗体。
在特定实施方案中,该vegf-a是人vegf-a或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a包含依照seqidno:1的氨基酸序列或其变体。在特定实施方案中,该vegf-a由依照seqidno:1的氨基酸序列或其变体组成。在特定实施方案中,该vegf-a的变体具有与vegf-a相同的功能性,即该变体是功能性变体。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现至少80％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现至少85％,90％,95％,98％或99％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现至少85％或至少95％序列同一性。在特定实施方案中,该vegf-a的变体与人vegf-a,特别是依照seqidno:1的氨基酸序列展现85％,95％,或98％序列同一性。
在第四个方面的特定实施方案中,该非人或嵌合蛋白是结合vegf-a的抗体。
因而,在特定实施方案中,要检测的复合物包含人vegf-a或其变体和结合vegf-a的非人或嵌合抗体。
在特定实施方案中,该可检测标记的抗体或其抗原结合性片段结合vegf-a。
在其中该可检测标记的抗体结合vegf-a的各实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体在相同或不同表位处结合vegf-a。在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体在不同表位处结合vegf-a。
在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体彼此不干扰。因而,这些抗体之一的结合不阻止或减少相应的另一抗体的结合。在本发明的各实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体结合同一单体上的两个不同表位和/或二聚体的每一个单体上的两个不同表位。或者,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体结合同二聚体的不同单体上的相同或实质性相同表位。在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体在不同表位处结合vegf-a。
在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体彼此分别与该vegf-a拮抗剂结合相同或不同表位,特别是与该拮抗性抗体结合不同表位。在该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体与该拮抗剂,特别是该拮抗性抗体结合相同表位的情况中,涵盖的是该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体以比该拮抗剂更低的kd值结合该表位。在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体以1.5nm以下,特别是1nm以下,0.75nm以下,特别是0.5nm以下的kd值结合该表位。
在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体彼此分别结合受到vegf受体,特别是vegf-a受体vegfa-r1和/或vegfa-r2覆盖或结合的表位。如此,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体与vegf-a受体,特别是vegfa-r1或vegfa-r2结合相同表位。或者,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体结合没有受到该vegf-a受体,诸如例如vegfa-r1或vegfa-r2直接结合但受到该受体覆盖的表位,使得该第一和/或第二抗体的结合阻止该vegf-a受体的结合。因而,在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体竞争vegfa-r1和/或vegfa-r2的结合。
vegf-a作为单体或二聚体,特别是同二聚体存在。因而,在第四个方面的各实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体结合同一单体上的两个不同表位和/或二聚体的每一个单体上的两个不同表位。或者,该第一和该第二抗体结合同二聚体的不同单体上的相同或实质性相同表位。
在第四个方面的各实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体任一结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,seqidno:3的氨基酸115-125,seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的组的cdr。
在第四个方面的各实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,和seqidno:3的氨基酸115-125组成的组的cdr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,和seqidno:3的氨基酸115-125组成的cdr。
在第四个方面的各实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的组的cdr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的cdr。
在第四个方面的各实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:2的氨基酸20-45,seqidno:2的氨基酸52-68,seqidno:2的氨基酸72-107,seqidno:2的氨基酸117-126,seqidno:3的氨基酸19-43,seqidno:3的氨基酸53-69,seqidno:3的氨基酸77-114,和seqidno:3的氨基酸126-136组成的组的fr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:2的氨基酸20-45,seqidno:2的氨基酸51-68,seqidno:2的氨基酸72-107,seqidno:2的氨基酸117-126,seqidno:3的氨基酸19-43,seqidno:3的氨基酸51-69,seqidno:3的氨基酸77-114,和seqidno:3的氨基酸126-136组成的fr。
在第四个方面的各实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含选自由seqidno:4的氨基酸21-46,seqidno:4的氨基酸53-69,seqidno:4的氨基酸73-108,seqidno:4的氨基酸118-127,seqidno:5的氨基酸20-44,seqidno:5的氨基酸53-69,seqidno:5的氨基酸78-115,和seqidno:5的氨基酸127-137组成的组的fr。在特定实施方案中,该第一抗体和/或该第二抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:4的氨基酸21-46,seqidno:4的氨基酸53-69,seqidno:4的氨基酸73-108,seqidno:4的氨基酸118-127,seqidno:5的氨基酸20-44,seqidno:5的氨基酸53-69,seqidno:5的氨基酸78-115,和seqidno:5的氨基酸127-137组成的fr。
在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,和seqidno:3的氨基酸115-125组成的cdr；且包含由seqidno:2的氨基酸20-45,seqidno:2的氨基酸52-68,seqidno:2的氨基酸72-107,seqidno:2的氨基酸117-126,seqidno:3的氨基酸19-43,seqidno:3的氨基酸53-69,seqidno:3的氨基酸77-114,和seqidno:3的氨基酸126-136组成的fr。
在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的cdr,且包含由seqidno:4的氨基酸21-46,seqidno:4的氨基酸53-69,seqidno:4的氨基酸73-108,seqidno:4的氨基酸118-127,seqidno:5的氨基酸20-44,seqidno:5的氨基酸53-69,seqidno:5的氨基酸78-115,和seqidno:5的氨基酸127-137组成的fr。
在第四个方面的各实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体包含选自由seqidno:2,3,4和5组成的组的氨基酸序列。
在第四个方面的各实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体包含具有seqidno:2的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:3的氨基酸序列的重链。
在第四个方面的各实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体包含具有seqidno:4的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:5的氨基酸序列的重链。
在第四个方面的各实施方案中,该非人或嵌合抗体和/或该可检测标记的抗体是用通过光谱学,光化学,生物化学,免疫化学,化学,或其它物理手段可检测的分子标记的。在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体和/或该可检测标记的抗体是用荧光染料,电子致密试剂,酶(例如如elisa中通常使用的),生物素,洋地黄毒苷/地高辛配基,或半抗原和其它是或能成为可检测的实体标记的。在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体和/或该可检测标记的抗体是生物素化的或钌化。用于标记抗体的方法是本领域技术人员公知的且有丰富描述,例如haugland(2003)molecularprobeshandbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,inc.；brinkley(1992)bioconjugatechem.3:2；garman(1997)non-radioactivelabeling:apracticalapproach,academicpress,london；means(1990)bioconjugatechem.1:2；glazeretal.,chemicalmodificationofproteins.laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology(t.s.workande.work,eds.)americanelsevierpublishingco.,newyork；lundblad,r.l.andnoyes,c.m.(1984)chemicalreagentsforproteinmodification,vols.iandii,crcpress,newyork；pfleiderer,g.(1985)"chemicalmodificationofproteins",modernmethodsinproteinchemistry,h.tschesche,ed.,walterdegruyter,berlinandnewyork；wong(1991)chemistryofproteinconjugationandcross-linking,crcpress,bocaraton,fla.)；deleon-rodriguezetal.,chem.eur.j.10(2004)1149-1155；lewisetal.,bioconjugatechem.12(2001)320-324；lietal.,bioconjugatechem.13(2002)110-115；和mieretal.,bioconjugatechem.16(2005)240-237。
在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体和该可检测标记的抗体能够结合固相或结合至固相。
在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体是能够结合固相或结合至固相。
在第四个方面的又一些实施方案中,该非人或嵌合抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链,且该可检测抗体具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链。
在第四个方面的又一些实施方案中,该非人或嵌合抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链,且该可检测标记的抗体具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链。
在第四个方面的又一些实施方案中,该非人或嵌合抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链,且该可检测标记的抗体具有包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链。
在第四个方面的又一些实施方案中,该非人或嵌合抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链,且该可检测标记的抗体具有包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链。
在第四个方面的又一些实施方案中,该非人或嵌合抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链,且该可检测标记的抗体具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链。
在第四个方面的又一些实施方案中,该非人或嵌合抗体结合至固相或能够结合固相且具有包含或组成为依照seqidno:4的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:5的序列的重链,且该可检测标记的抗体具有包含或组成为依照seqidno:2的序列的轻链和包含或组成为依照seqidno:3的序列的重链。
在又一些实施方案中,该固相处于选自由珠,管,微量板的盘,和任何其它合适表面(特别是适合于进行免疫测定法的)组成的组的形式。在特定实施方案中,该珠是微珠。微珠是具有纳米和微米范围中的直径的微粒。在各实施方案中,该微粒可具有50纳米至50微米的直径。特别地,该微粒具有100nm和10μm之间的直径,特别是200nm至5μm,或750nm至5μm。微粒包含或组成为本领域技术人员知道的任何合适材料,例如它们包含或组成为或本质上组成为无机或有机材料。特别地,它们包含或组成为或本质上组成为金属或金属合金,或有机材料,或包含或组成为或本质上组成为碳水化合物要素。在特定实施方案中,该微粒的材料选自由琼脂糖,聚苯乙烯,胶乳,聚乙烯醇,硅石和铁磁性金属,合金或复合材料组成的组。微粒还可包含或组成为磁性或铁磁性金属,合金或组合物。该材料可具有特定特性,诸如例如是疏水性的或亲水性的。在特定实施方案中,该微粒分散在水溶液中且保留小负表面电荷,保持微粒分开及避免非特异性聚簇。
在特定实施方案中,该磁性或顺磁性微粒通过磁力分开。应用磁力来将顺磁性或磁性颗粒拉出溶液/悬浮液及在期望时在能去除溶液/悬浮液的液体并能例如清洗颗粒的同时保留它们。
在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体和/或该可检测标记的抗体是igg抗体。在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体和/或该可检测标记的抗体是igg2抗体。在特定实施方案中,该非人或嵌合抗体和/或该可检测标记的抗体是igg2b抗体,或其抗原结合性片段,特别是igg2b-f(ab’)2片段。
在第四个方面的特定实施方案中,在步骤(a)中温育的该包含所述复合物的样品还与vegf-a拮抗剂一起温育。在特定实施方案中,该包含所述复合物的样品与vegf-a拮抗剂一起的温育在与该可检测标记的抗体或其抗原结合性片段一起的温育之前,同时或之后实施。
在各实施方案中,该vegf-a拮抗剂阻止vegf-a和一种或多种vegf受体之间的相互作用。特别地,该vegf-a拮抗剂在该受体的结合位点处与vegf-a竞争或以如下方式改变vegf-a上针对它的受体的结合位点,即它不再能够结合它的受体或不再能够触发在正常情况下由它的结合引起的功能性作用。因而,该vegf-a拮抗剂可结合vegf-a的表位并由此阻碍vegf-a对它的受体的结合,或该vegf-a拮抗剂可结合该受体的表位并由此阻止vegf-a对该受体的结合。在特定实施方案中,该vegf-a拮抗剂结合vegf-a上的表位并由此阻止它对vegf受体的结合。在特定实施方案中,该vegf-a受体是vegfa-r1和/或vegfa-r2。
在第四个方面的又一些实施方案中,该vegf-a拮抗剂选自由多肽,肽体(peptibody),免疫粘附素,小分子和适体(aptamer)组成的组。
在其中该拮抗剂是多肽的特定实施方案中,所述多肽是抗体。在一个特定实施方案中,该抗体是抗vegf-a抗体。特别地,该抗vegf抗体是以足够亲和力和特异性结合vegf-a的抗体或其抗原结合性片段。在各实施方案中,该抗体或其抗原结合性片段具有足够的对vegf-a的结合亲和力。特别地,该抗体或其抗原结合性片段以100nm-1pm之间的kd值,即以100nm,50nm,1nm,900pm,800pm,700pm,600pm,500pm,400pm,300pm,200pm,100pm,50pm,或1pm的kd值结合hvegf-a。在特定实施方案中,该抗体或其抗原结合性片段以50nm-50pm,1nm-100pm,或700pm-300pm之间的kd值结合人vegf-a(hvegf-a)。
在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是单克隆或多克隆的。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是重组生成的。在又一些实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是嵌合抗体,特别是人源化抗vegf-a抗体。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体包含突变的人igg1框架区。该拮抗性vegf-a抗体进一步包含来自阻断人vegf对它的受体的结合的鼠抗hvegf单克隆抗体a.4.6.1的抗原结合性互补决定区(cdr)。在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体的氨基酸序列的93％,包括大部分框架区,衍生自人igg1,而且该序列的约7％衍生自鼠抗体a4.6.1
在特定实施方案中,该拮抗性vegf-a抗体是抗体片段。该抗体片段选自由fab片段,fab'片段,f(ab')2片段,单域抗体(sdab),纳米抗体(nanobody),单链fv(scfv),二价单链可变片段(di-scfv),串联scfv,双抗体(diabody),双特异性双抗体,单链双抗体(scdb),双特异性t细胞啮合剂(bite),和dart分子组成的组。在特定实施方案中,该拮抗性抗体片段是fab片段或f(ab’)2片段,特别是人源化fab片段或人源化f(ab’)2片段。
在又一些实施方案中,该vegf-a拮抗剂选自由vegf-陷阱,mucagen,ptk787,su11248,ag-013736,bay439006(索拉非尼),zd-6474,cp632,cp-547632,azd-2171,cdp-171,su-14813,chir-258,aee-788,sb786034,bay579352,cdp-791,eg-3306,gw-786034,rwj-417975/ct6758和krn-633组成的组。
在特定实施方案中,该复合物,该可检测标记的抗体和/或该vegf-a拮抗剂包含在生理溶液中,特别是在生理缓冲液中。在特定实施方案中,该缓冲液选自taps,bicine,tris,tricine,tapso,hepes,tes,mops,pipes,卡可酸盐,和mes的组。在特定实施方案中,该缓冲液是mes缓冲液。在特定实施方案中,该mes缓冲液包含下面的成分:50mmmes,150mmnacl,2mmedta-na2(二水合物),0.1％n-methylisothiazolon-hcl,0.1％oxypyrion,0.1％polydocanol(thesit),1.0％清蛋白rpla4测定法质量,0.2％pak<->r-igg(det),millipore水,用2nnaoh将ph调节至6.30。
在步骤(a)的特定实施方案中,将该可检测标记的抗体与该包含所述复合物的样品混合。将此混合物温育足够该可检测标记的抗体结合该复合物的时间段。
在各实施方案中,将该混合物温育少于60分钟,即少于60,55,50,45,40,35,30,25,20,15,10,或5分钟。在特定实施方案中,将该混合物温育4分钟至1小时(即4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,或60分钟)。在特定实施方案中,将该混合物温育5分钟至45分钟,即5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,或45分钟)。在特定实施方案中,将该混合物温育5分钟至30分钟,即5,6,7,8,9,10,15,20,25,或30分钟。在特定实施方案中,将该混合物温育少于20分钟或少于10分钟。在特定实施方案中,将该混合物温育18或9分钟。
在各实施方案中,将该混合物温育1-12小时(即1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,或12小时)。在特定实施方案中,将该混合物温育1-4小时或8-12小时。
在又一些实施方案中,于3-40℃(即3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,或40℃)的温度温育该混合物。特别是于3℃至8℃(即3,4,5,6,7或8),特别是于4-5℃,或于20℃至25℃(即于20,21,22,23,24,或25℃),特别是于20-22℃,或于35-37℃温育该混合物。
本领域技术人员公知温育温度和温育时间取决于彼此。因而,在特定实施方案中,将该混合物于20-25℃温育10分钟至1小时,即将该混合物于20,21,22,23,24,或25℃温育10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,或60分钟。在特定实施方案中,将该混合物于22℃温育少于10分钟或少于20分钟。在又一些实施方案中,将该混合物于3-8℃温育8-12小时,即将该混合物于3,4,5,6,7,或8℃温育8,9,10,11,或12小时。在特定实施方案中,将该混合物于4℃温育12小时。特别地,将该混合物于3-8℃,特别是于4-5℃温育1-4小时或8-12小时。
在特定实施方案中,该复合物和/或该可检测标记的抗体包含在生理溶液中,特别是在生理缓冲液中和/或在其中温育。在特定实施方案中,该缓冲液选自taps,bicine,tris,tricine,tapso,hepes,tes,mops,pipes,卡可酸盐,和mes的组。在特定实施方案中,该缓冲液是mes缓冲液。在特定实施方案中,该mes缓冲液包含下面的成分:50mmmes,150mmnacl,2mmedta-na2(二水合物),0.1％n-methylisothiazolon-hcl,0.1％oxypyrion,0.1％polydocanol(thesit),1.0％清蛋白rpla4测定法质量,0.2％pak<->r-igg(det),millipore水,用2nnaoh将ph调节至6.30。
在特定实施方案中,经由本领域公知的任何方法在步骤(b)中检测形成的抗体–抗原–抗体复合物,特别是包含人vegf-a和该非人或嵌合抗体,和该可检测标记的抗体或其抗原结合性片段的复合物的形成的复合物。在特定实施方案中,经由电化学发光,化学发光,或荧光检测形成的复合物。
特别地,本发明涉及下面的项:
1.一种用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的方法,该方法包含:
将样品与第一和第二抗体一起温育,
其中所述第一和所述第二抗体能够在该vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a或其变体,且其中所述第一和所述第二抗体的结合彼此不干扰,
其中所述抗体之一是可检测标记的,由此形成可检测标记的包含该第一抗体,vegf-a或其变体,和该第二抗体的复合物,并
检测形成的复合物,由此在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平。
2.项1的方法,其中该vegf-a拮抗剂是vegf-a结合性多肽,特别是vegf-a结合性抗体。
3.项1或2的方法,其中该vegf-a拮抗剂是抗体贝伐单抗。
4.项1至3任一项的方法,其中该第一和/或该第二抗体任一结合受到vegf受体覆盖或结合的表位。
5.项1至4任一项的方法,其中该第一或该第二抗体任一包含由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,seqidno:3的氨基酸115-125组成的cdr,或
包含由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的cdr。
6.项1至5任一项的方法,其中该第一抗体和/或该第二抗体任一结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,seqidno:3的氨基酸115-125组成的cdr,且包含由seqidno:2的氨基酸20-45,seqidno:2的氨基酸52-68,seqidno:2的氨基酸72-107,seqidno:2的氨基酸117-126,seqidno:3的氨基酸19-43,seqidno:3的氨基酸53-69,seqidno:3的氨基酸77-114,和seqidno:3的氨基酸126-136组成的fr,或
包含由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的cdr,且包含由seqidno:4的氨基酸21-46,seqidno:4的氨基酸53-69,seqidno:4的氨基酸73-108,seqidno:4的氨基酸118-127,seqidno:5的氨基酸20-44,seqidno:5的氨基酸53-69,seqidno:5的氨基酸
78-115,和seqidno:5的氨基酸127-137组成的fr。
7.项1至6任一项的方法,其中该第一或该第二抗体任一包含具有seqidno:2的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:3的氨基酸序列的重链。
8.项1至6任一项的方法,其中该第一或该第二抗体任一包含具有seqidno:4的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:5的氨基酸序列的重链。
9.依照项1至8任一项的方法,其中该第一或该第二抗体结合或能够结合固相。
10.依照项1至9任一项的方法,其中该第一抗体结合或能够结合固相且包含具有seqidno:2的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:3的氨基酸序列的重链,且其中该第二抗体是可检测标记的且包含具有seqidno:4的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:5的氨基酸序列的重链。
11.依照项1至10任一项的方法,其中该第一抗体或该第二抗体之一是生物素化的。
12.依照项1至10任一项的方法,其中该第一抗体或该第二抗体之一是钌化的。
13.依照项1至12任一项的方法,其中该样品衍生自用vegf-a拮抗剂治疗的患者。
14.依照项1至13任一项的方法,其中该样品是体液,特别是全血,血清或血浆。
15.项1至14任一项的方法,其中该用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平或其变体的方法是三明治式免疫测定法。
16.项1至15任一项的方法,其中该用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的方法包含经由电化学发光检测形成的复合物。
17.一种用于在vegf-a拮抗剂存在下测量vegf-a的水平的试剂盒,该试剂盒包含:第一和第二抗体,
其中所述第一和所述第二抗体均能够在该vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a,且其中所述第一和所述第二抗体的结合彼此不干扰,
其中所述抗体之一是可检测标记的。
18.依照项17的试剂盒,其中所述试剂盒包含如项4至12任一项中限定的抗体。
19.一种包含第一和第二抗体的物质组合物,
其中所述第一和所述第二抗体均能够在vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a或其变体,
其中所述第一和所述第二抗体的结合彼此不干扰,且
其中所述抗体之一是可检测标记的。
20.项19的物质组合物,其中该第一和/或该第二抗体任一结合受到vegf受体覆盖或结合的表位。
21.项19或20任一项的物质组合物,其中该第一或该第二抗体任一包含由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,seqidno:3的氨基酸115-125组成的cdr,或
包含由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的cdr。
22.项19至21任一项的物质组合物,其中该第一抗体和/或该第二抗体任一结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,seqidno:3的氨基酸115-125组成的cdr,且包含由seqidno:2的氨基酸20-45,seqidno:2的氨基酸52-68,seqidno:2的氨基酸72-107,seqidno:2的氨基酸117-126,seqidno:3的氨基酸19-43,seqidno:3的氨基酸53-69,seqidno:3的氨基酸77-114,和seqidno:3的氨基酸126-136组成的fr,或
包含由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的cdr,且包含由seqidno:4的氨基酸21-46,seqidno:4的氨基酸53-69,seqidno:4的氨基酸73-108,seqidno:4的氨基酸118-127,seqidno:5的氨基酸20-44,seqidno:5的氨基酸53-69,seqidno:5的氨基酸78-115,和seqidno:5的氨基酸127-137组成的fr。
23.项19至22任一项的物质组合物,其中该第一或该第二抗体任一包含具有seqidno:2的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:3的氨基酸序列的重链。
24.项19至23任一项的物质组合物,其中该第一或该第二抗体任一包含具有seqidno:4的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:5的氨基酸序列的重链。
25.依照项19至24任一项的物质组合物,其中该第一或该第二抗体结合或能够结合固相。
26.项19至25任一项的物质组合物,其中该第一抗体或其片段结合或能够结合固相且包含具有seqidno:2的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:3的氨基酸序列的重链,且其中该第二抗体是可检测标记的且包含具有seqidno:4的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:5的氨基酸序列的重链。
27.依照项19至26任一项的物质组合物,其中该第一抗体或该第二抗体之一是生物素化的。
28.依照项19至27任一项的物质组合物,其中该第一抗体或该第二抗体之一是钌化的。
29.依照项19至28任一项的物质组合物,其中所述组合物进一步包含vegf-a拮抗剂。
30.依照项29的物质组合物,其中该vegf-a拮抗剂是抗体贝伐单抗。
31.一种检测包含人vegf-a和非人或嵌合蛋白的复合物的方法,其包含如下步骤:
(a)将包含所述复合物的样品与可检测标记的结合或能够结合人vegf-a或该其变体和/或该非人或嵌合蛋白的抗体一起温育,并
(b)检测所述抗原结合性蛋白。
32.项31的方法,其中该复合物包含人vegf-a和结合vegf-a的非人或嵌合抗体或其抗原结合性片段。
33.项31或32的方法,其中该非人或嵌合蛋白和该可检测标记的抗体均能够在vegf-a拮抗剂存在下结合vegf-a。
34.项31至33任一项的方法,其中该非人或嵌合蛋白或该可检测标记的抗体任一结合受到如下抗体结合的表位,该抗体包含由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,seqidno:3的氨基酸115-125组成的cdr,或
包含由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的cdr。
35.项31至34任一项的方法,其中该非人或嵌合蛋白或该可检测标记的抗体任一包含由seqidno:2的氨基酸46-51,seqidno:2的氨基酸69-71,seqidno:2的氨基酸108-116,seqidno:3的氨基酸44-52,seqidno:3的氨基酸70-76,seqidno:3的氨基酸115-125组成的cdr,且包含由seqidno:2的氨基酸20-45,seqidno:2的氨基酸52-68,seqidno:2的氨基酸72-107,seqidno:2的氨基酸117-126,seqidno:3的氨基酸19-43,seqidno:3的氨基酸53-69,seqidno:3的氨基酸77-114,和seqidno:3的氨基酸126-136组成的fr,或
包含由seqidno:4的氨基酸47-52,seqidno:4的氨基酸70-72,seqidno:4的氨基酸109-117,seqidno:5的氨基酸45-52,seqidno:5的氨基酸70-77,和seqidno:5的氨基酸116-126组成的cdr,且包含由seqidno:4的氨基酸21-46,seqidno:4的氨基酸53-69,seqidno:4的氨基酸73-108,seqidno:4的氨基酸118-127,seqidno:5的氨基酸20-44,seqidno:5的氨基酸53-69,seqidno:5的氨基酸78-115,和seqidno:5的氨基酸127-137组成的fr。
36.项31至35任一项的方法,其中该非人或嵌合蛋白或该可检测标记的抗体任一包含具有seqidno:2的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:3的氨基酸序列的重链。
37.项31至36任一项的方法,其中该非人或嵌合蛋白或该可检测标记的抗体任一包含具有seqidno:4的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:5的氨基酸序列的重链。
38.项31至37任一项的方法,其中该非人或嵌合蛋白或该可检测标记的抗体任一结合或能够结合固相。
39.项31至38任一项的方法,其中该非人或嵌合蛋白结合或能够结合固相且包含具有seqidno:2的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:3的氨基酸序列的重链,且其中该第二抗体是可检测标记的且包含具有seqidno:4的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:5的氨基酸序列的重链。
40.项31至39任一项的方法,其中该非人或嵌合蛋白或该可检测标记的抗体是生物素化的或钌化的。
41.项31至40任一项的方法,其中在步骤(a)之前,同时或之后将该包含所述复合物的样品进一步与vegf-a拮抗剂一起温育。
42.项41的方法,其中该vegf-a拮抗剂是抗体贝伐单抗。
实施例
提供了下面的实施例以例示,但是并非限制当前请求保护的发明。
实施例1:biacore表位分仓
使用biacoret200仪器(gehealthcare)进行三元表位分仓实验以评估3种单克隆抗体或抗体片段缀合物在二聚体vegf-a121上的表位可及性(见图1)。这里描述的具有针对vegf-a的亲和力的抗体是rh-4.6.1-igg(avastin),13.2.5-f(ab‘)2-bi,和13.7.40-ru。依照制造商的用法说明书将sc1传感器安置入biacore系统并用hbsn缓冲液(10mmhepesph7.4,150mmnacl)规格化。将系统缓冲液换成含5％dmso和0.05％tween20的pbs缓冲液ph7.4。样品缓冲液是补充有1mg/mlcmd(羧基甲基右旋糖苷,sigma#86524)的系统缓冲液。于25℃运转系统。在安置的sc1传感器上固定化抗体捕捉系统。如供应商描述的,通过常规edc/nhs化学在所有传感器流动室上固定化1600ru单克隆鼠抗人fc伽马-泛捕捉抗体(mahfcg-pan,roche)。通过以20μl/min注射10mmnaoh达15秒,接着以20μl/min注射10mm甘氨酸缓冲液ph2.5两次各1分钟来再生捕捉系统。
在流动室1和流动室2上,75nm一抗rh-4.6.1-igg以30μl/min注射1分钟以5μl/min。在两个流动室上均通过使用2μm人正常igg(roche)与1μmm-33(roche)在样品缓冲液中的混合物以30μl/min注射3分钟来饱和捕捉系统。在准备的这个阶段,在流动室1上设置的测定法充当无抗原参照。以30μl/min将150nmvegf-a(vegf-a121,peprotech)注射入流动室2达3分钟以在传感器上通过rh-4.6.1-igg展示。为了饱和潜在可及的所展示的二聚体vegf121上的第二抗体结合稳定性,再次以20μl/min将75nmrh-4.6.1-igg注射入流动室1和2达3分钟结合时间。以20μl/min将75nm生物素化抗体片段13.2.5-f(ab‘)2-bi注射入流动室1和2达3分钟,接着以30μl/min序贯注射75nm13.7.40-ru达3分钟。图像中的黑线(图2)显示在如上文描述准备传感器表面之后第一,13.2.5-f(ab‘)2-bi缀合物和第二,13.7.40-ru缀合物进入流动室2的序贯注射。黑色点线显示作为参照在流动室1上在没有存在vegf-a121下13.2.5-f(ab‘)2-bi和13.7.40-ru的两次序贯注射的信号水平。在流动室2上,13.7.40-ru显示升高的结合信号,它比在前的13.2.5-f(ab‘)2-bi注射的预期信号饱和水平更高。这指示vegf-a121表位对这两种缀合物的可及性。在省略vegf-a抗原的流动室1上,没有可检测的相互作用。或是不存在vegf-a(图2b),或是还存在vegfa-r1(图2c)或vegfa-r2(图2d)的对照实验证明测试抗体的结合是vegf-a特异性的且抗体结合vegf-a受体结合或受到vegf-a受体的结合覆盖的vegf-a表位。
实施例2:elecsys竞争测定法
以三明治式测定法格式进行测量。
如下进行实验性vegf-a抗原测定法。对抗原阳性样品掺入至少50倍摩尔过量的vegf-a拮抗剂并温育30分钟以容许对vegf-a的平衡结合。在
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<400>1
metasnpheleuleusertrpvalhistrpserleualaleuleuleu
151015
tyrleuhishisalalystrpserglnalaalaprometalaglugly
202530
glyglyglnasnhishisgluvalvallysphemetaspvaltyrgln
354045
argsertyrcyshisproilegluthrleuvalaspilepheglnglu
505560
tyrproaspgluileglutyrilephelysprosercysvalproleu
65707580
metargcysglyglycyscysasnaspgluglyleuglucysvalpro
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thrglugluserasnilethrmetglnilemetargilelysprohis
100105110
glnglyglnhisileglyglumetserpheleuglnhisasnlyscys
115120125
glucysargprolyslysaspargalaargglnglulyslysserval
130135140
argglylysglylysglyglnlysarglysarglyslysserargtyr
145150155160
lyssertrpservaltyrvalglyalaargcyscysleumetprotrp
165170175
serleuproglyprohisprocysglyprocyssergluargarglys
180185190
hisleuphevalglnaspproglnthrcyslyscyssercyslysasn
195200205
thraspserargcyslysalaargglnleugluleuasngluargthr
210215220
cysargcysasplysproargarg
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