电子显微镜的制作方法

本发明涉及电子显微镜样品制备设备；和一种制备电子显微镜样品的方法。

背景技术：

显微镜技术可以用于成像标本。显微镜技术包括电子显微镜。根据这些技术，电子束用于“照射”标本。电子束中存在的样品导致电子束变化。可以检查由样品引起的电子束变化，以产生标本的放大图像。

为了成功成像，必须充分地制备用于成像的标本。成功且可再现地制备样品或标本可能是从显微镜技术获得有用结果的关键。应当理解，不正确或不成功地制备用于检查的标本可能导致标本损坏、差的和/或不可再现的结果。

希望提供一种用于制备显微镜样品的设备和方法，其可以解决已知制备技术的一些特征。

技术实现要素：

第一方面提供了电子显微镜样品制备设备；该设备包括：载体保持器，其构造成接收电子显微镜样品载体，该电子显微镜样品载体构造成接收流体样品；和气体出口，其构造成将气体的流动导向电子显微镜样品载体的表面，以调节由电子显微镜样品载体支承的流体。

所描述的装置和方法可以用于各种显微镜样品制备方法，但是可以与电子显微镜特别相关，特别是低温显微镜，也称为低温电子显微镜或cryo-em，其中，使用透射电子显微镜在低温下研究标本。电子低温显微镜技术在玻璃化水合生物标本的研究中特别有用。可再现且可靠的制备技术的重要性对于低温电子显微镜的用户可能特别重要，因为可以在预定的位置之前几周制备样品，以使用电子显微镜，并且如果制备的样品不可用，则可能花费时间来制备其它样品(也可能无法使用)，并等待其它预定的位置来使用电子显微镜。

第一方面可以提供电子显微镜样品制备设备。电子显微镜样品制备设备可以包括低温电子显微镜样品制备设备。所述设备可以包括独立设备，或可以构成较大的制备机器的一部分。

第一方面的设备可以包括：载体保持器，其构造成接收电子显微镜样品载体。电子显微镜样品载体可以构造成接收流体样品。流体样品可以包含含有生物标本的溶液。样品载体可以包括电子显微镜样品载体栅格。

该设备可以包括气体出口，该气体出口构造成将气体的流动导向电子显微镜样品载体的表面，以调节由电子显微镜样品载体支承的流体。气体可以包括加压空气、氮气或其它类似的不能与流体中的标本进行不利的相互作用的惰性气体。在一些实施例中，可以根据所得到的可导向气体流动的所需性质来选择气体出口的构型。在一些实施例中，气体流速可以是可调节的，气流可以根据情况启动和停止。在一些实施例中，可以在气体流动期间(也就是说，在气体从出口流出时)调节气体流速。气流可以基本上是层流。出口可以布置或构造成使得当样品载体就位在样品载体保持器中时，所得到的气流在样品载体的宽度上基本均匀。

第一方面认识到使用气体的流动来调节放置在样品载体上的流体样品可以允许可再现的样品制备。此外，使用气体的流动来调节放置在样品载体上的流体样品可以允许对气流参数的精细调节，以及由此对设置在样品载体上的样品的各种性质的精细调节。

在一些实施例中，气体出口构造成使得可以将气体的流动导向表面，使得气体的流动基本上平行于表面。在一些实施例中，气体出口构造成使得可以将气体的流动以选定的入射角导向表面，入射角被选定为使得气体的流动可操作以去除在电子显微镜样品载体上接收的多余流体样品。可以理解，气体的流动可以起到从样品载体“推开”多余流体的作用。样品载体上的多余流体可能导致样品太厚而不能有效成像。

基本上平行于载体表面的气流可以用于在载体表面上的流体中产生梯度。在一些实施例中，气体出口构造成使得可以将气体的流动以选定的入射角导向表面，所述入射角被选择为使得气体的流动可操作以在载体表面上的流体中产生梯度。梯度的产生可以允许在载体表面上的某处出现用于电子显微镜成像的最佳流体厚度。该最佳厚度可能出现在载体表面上的多个位置。如果载体例如是栅格，则最佳厚度可能出现在载体样品表面上出现的多个栅格方格处。最佳厚度可能取决于待通过电子显微镜成像并且悬浮在放置在样品载体上的流体中的标本。

在一些实施例中，气体出口构造成使得能够将气体的流动导向表面，这导致基本上垂直于表面的气体流动。在一些实施例中，气体出口构造成使得将所产生的气体流动以一入射角导向表面，所述入射角被选择为使得气体流动的横截面构造成基本上均匀地通过电子显微镜样品载体表面的表面区域。这种气流可能导致在样品载体的表面区域上实现均匀的蒸发。一些实施例认识到，如果气流的方向基本上垂直于样品载体表面，则可以避免在样品载体上产生流体梯度，并且为随后的成像实现更均匀的样品。

例如，在一些实施例中，基本上垂直的气流也可以用于将样品流体的“液滴”散布在样品载体上。在一些实施例中，气体出口构造成使得可以将气体的流动以一入射角导向表面，所述入射角被选择为使得气流可操作以将样品流体的“液滴”散布在样品载体上。

应当理解，可以使用具有适当选择的入射角、横截面积和/或流速的适当选择的垂直、平行和/或横向气流，以及适当的气体，以实现与制备样品相关的各种活动。特别地，气流可以用于调节设置在样品载体上的流体。该调节可以包括以下内容中的一个或多个：去除多余的流体、散布流体、从样品载体蒸发流体、冷却样品流体和/或玻璃化样品流体。在一些实施例中，相同的气流可以用于执行不止一个活动或调节。在一些实施例中，可以改变气流的一个或多个物理特性，以实现各种活动。例如，可以适当地改变气流的流速、气体、湿度、温度、入射角和/或类似特性。

在一些实施例中，气流可以用于冷却、低温冷却或玻璃化样品载体上的流体样品。在一些实施例中，低温冷却可以包括将流体样品和样品载体冷却至约-175摄氏度。如果气流的“流动前沿”构造成均匀且一致地冲击样品载体表面，则冷却或玻璃化可以构造成使得在样品载体上实现均匀的冷却、低温冷却或玻璃化。在该上下文下，“均匀冷却”意味着冷却过程可以使得在载体上的流体区域之间施加气流不会引起显著的温度差异。温度差异可能对载体上的流体样品造成物理损害，并且在随后的电子显微镜成像中产生问题。

在一些实施例中，气体出口可以构造成可移动的，使得气流相对于朝向表面的气体流动具有可调节的入射角。因此，一些设备布置可以包括位置固定的气体出口，其它布置可以提供可移动的气体出口。如果是可移动的，则气流相对于样品载体表面的入射角可以是可调节的。在一些实施例中，在向样品载体施加气流期间，气流的入射角可以是可调节的。在一些实施例中，一个入射角可以用于执行多余流体的去除，以及样品流体从样品载体的蒸发。换句话说，可以使用相同的气流入射角来执行两种活动。气流的其它物理性质可以被调节，或保持相同。在一些实施例中，一个入射角可以用于执行多余流体的去除，另一入射角可以用于实现样品载体上的流体的蒸发。在一些实施例中，气流的入射角可以在向样品载体施加气流之间是可调节的。

如上所述，根据各种实施例，可以使用气流来实现对放置在样品载体上的流体的一系列调节。在一些实施例中，所实现的调节可取决于气流的性质。例如，气流的施加方向、气流的横截面积、用于气流的气体、气流的湿度、气流的温度和气流的其它类似的物理性质和特性。气流的性质可以取决于气体出口的构型。气体出口可以包括喷嘴，该喷嘴的形状确定成产生具有特定的物理特性的气流。在一些实施例中，调节由电子显微镜样品载体支承的流体包括去除由电子显微镜样品载体支承的多余流体。在一些实施例中，调节由电子显微镜样品载体支承的流体包括引起由电子显微镜样品载体支承的流体的不均匀蒸发，以在样品载体上获得流体厚度梯度。在一些实施例中，调节由电子显微镜样品载体支承的流体包括导致由电子显微镜样品载体支承的流体均匀蒸发，以在样品载体上获得均匀的流体厚度。在一些实施例中，调节由电子显微镜样品载体支承的流体包括导致由电子显微镜样品载体支承的流体的冷却。在一些实施例中，调节由电子显微镜样品载体支承的流体包括导致由电子显微镜样品载体支承的流体低温冷却。在一些实施例中，调节由电子显微镜样品载体支承的流体包括使由电子显微镜样品载体支承的流体玻璃化。

在一些实施例中，该设备包括：单个气体出口，其构造成将气体的流动基本上对称地导向电子显微镜样品载体的相对的表面，以调节由电子显微镜样品载体支承的流体。这种布置可以保证在向样品载体施加气流时，样品载体不会翘曲或以其它方式物理损坏。在一些实施例中，单个气体出口可以用于产生仅导向样品载体的一个表面的气流，并且仅从其一侧或一个表面调节样品载体上的流体。

在一些实施例中，该设备包括：至少一个气体出口，其构造成将气体的流动基本上对称地导向电子显微镜样品载体的相对的表面，以调节由电子显微镜样品载体支承的流体。在一些实施例中，该设备包括：至少两个气体出口，其构造成将气体的流动基本上对称地且同时地导向电子显微镜样品载体的相对的表面，以调节由电子显微镜样品载体支承的流体。在一些实施例中，该设备包括：两个气体出口，其构造成将气体的流动基本上对称地且同时地导向电子显微镜样品载体的相对的表面，以调节由电子显微镜样品载体支承的流体。

如上所述的各种对称布置可以有助于保证在向样品载体施加气流时，样品载体不会翘曲或以其它方式物理损坏。

在一些实施例中，该设备包括：气体加湿器，其构造成调节气流的湿度。因此，气流的湿度可能对由样品载体支承的流体上的气流引起的蒸发速率产生影响。在一些实施例中，该设备可以包括气流温度调节装置，其构造成控制或调节气流的温度。在一些实施例中，该设备还可以包括壳体。可以监测和控制所述壳体中的温度，以控制来自样品载体的流体的蒸发。

在一些实施例中，该设备包括：流体源，其构造成将流体样品引入样品载体。在一些实施例中，可以将流体手动引入保持在设备样品载体保持器中的样品载体上。在其它实施例中，可以设置分配器，例如机器人分配器臂，其构造成使得可操作以将流体引入保持在设备样品载体保持器中的样品载体上。设置流体分配器可以允许电子显微镜样品制备的更完全自动化，并且可以导致更加可再现的电子显微镜样品，和/或使用更少的样品流体。在样品可能受限的情况下，在制备电子显微镜样品时使用较少的样品流体可能是有益的。

在一些实施例中，该设备包括：冷却、低温冷却和/或玻璃化装置。该装置可以构造成冷却、低温冷却和/或玻璃化样品载体上的样品流体。该装置可以构造成接收样品载体和样品流体，并且冷却、低温冷却和/或玻璃化样品载体上的流体。因此，该装置可以包括在最终成像之前存储样品载体之前玻璃化样品流体的装置。在一些实施例中，冷却装置包括：液态乙烷浴，其构造成接收样品载体。在一些实施例中，冷却装置包括：气体出口，其构造成将冷却、低温冷却或玻璃化气流导向电子显微镜样品载体的表面，以冷却、低温冷却和/或玻璃化由电子显微镜样品载体支承的流体。因此，例如，液氮或类似物可以用于产生冷却氮气流。在一些实施例中，气体出口和冷却气体出口包括相同的气体出口。因此，气源可以在产生用于调节样品载体上的流体位置的气流和产生用于冷却或玻璃化样品载体上的流体的气流之间改变。

在一些实施例中，该设备包括：定时单元，其构造成在将流体引入样品载体和来自气体出口的气流的启动之间实现等待时段。因此，实施的等待时间可以允许流体液滴“润湿”样品载体。

在一些实施例中，该设备包括：定时单元，其构造成在来自出口的气流的启动和停止之间实现活动时段。因此，可以通过调节样品载体上的流体暴露于气流的时间(活动时段)来调节通过多余样品去除和/或通过从样品载体中蒸发流体而去除的流体量。

在一些实施例中，该设备包括：定时单元，其构造成实现来自出口的气流停止和进行与放置在保持在样品保持器中的样品载体上的样品流体相关的其它活动(例如冷却、低温冷却或玻璃化)之间的松弛时段。因此，可以通过调节松弛时段来调节支承在样品载体上的样品流体的均匀性，以在进行其它活动之前允许流体样品在样品载体上松弛更长或更短的时间段。

在一些实施例中，定时单元可以构造成调节等待时段、活动时段或松弛时段中的一个或多个。因此，可以控制样品载体上的样品流体和得到的电子显微镜样品的性质。

在一些实施例中，该设备包括：成像设备，其构造成对样品保持器中的电子显微镜样品载体成像。该成像设备可以包括视觉的实时成像设备。设置这种成像设备可以允许实时监测和调节样品制备过程。

在一个实施例中，流体样品包括悬浮在流体中的多个标本。因此，流体样品可以具有一个或多个单独的标本或样品，例如悬浮或包含在流体中的一个或多个大分子。

在一个实施例中，多个标本在流体中具有每单位体积的标本浓度。因此，可以在流体中以特定的浓度或密度提供标本。例如，每单位体积的流体可以提供特定数量的标本。

在一个实施例中，标本浓度在样品载体的每个成像孔中提供选定数量的标本。因此，可以选择流体中的标本的密度或浓度，以在样品载体上的每个孔中给出多个标本。例如，可以选择密度，以在每个成像孔中提供少于五个标本。

在一个实施例中，气体出口构造成引导气体的流动，以分割接收在样品载体上的流体样品。因此，来自气体出口的气体流动可以分割、分离、分裂、分隔或分开在样品载体上的样品。

在一个实施例中，气体出口构造成引导气体的流动，以将接收在样品载体上的流体样品分割成保留在样品载体上的保留流体样品部分和从样品载体中去除的去除流体样品部分。因此，气体的流动可以将流体样品分割、分离、分开、分隔或分裂成保留部分和去除部分。保留部分可以保留在样品载体上，而去除部分可以从样品载体上分离。

在一个实施例中，气体出口构造成引导气体的流动，以分割接收在样品载体上的流体样品，其中，保留部分具有标本浓度。因此，保留部分可以保持相同的标本浓度或密度。也就是说，在去除部分被去除期间，标本浓度或密度可能不增加。

在一个实施例中，去除部分包括标本。因此，去除部分可以包含标本和流体。

在一个实施例中，去除部分具有标本浓度。因此，去除部分也可以保持与原始流体样品相同的标本浓度。

在一个实施例中，该设备包括流体样品沉积器，其可操作以将流体样品沉积在样品载体上。因此，可以设置一种机构，以在样品载体上沉积或提供流体样品。

在一个实施例中，该设备包括控制单元，其可操作成控制流体样品沉积器、气体出口和冷却装置，以在处理时段中沉积流体样品、分割流体样品和使保留部分玻璃化。因此，控制单元可以控制样品的沉积、样品的分割和保留部分的玻璃化，使得所有这些在选定的处理时段内发生。

在一个实施例中，处理时段包括一个时间段，在该时间段内，防止保留部分中的大于选定或显著比例的标本的分解和重新定向到对齐取向中的至少一个。因此，从沉积流体样品到其玻璃化的时间段可以选择成发生在少于可以发生选定量的标本的分解的时间。同样地，可以选择该时间段，使其小于选定量的标本在沉积在样品载体上时可以自行重新定向的时间。这有助于保证标本保持完整，并且保持其在流体中大体上的随机分布。

在一个实施例中，该时间段使流体的蒸发最小化。因此，该时间段可以使流体的蒸发最小化或基本上消除。

在一个实施例中，该时间段小于约1s。

在一个实施例中，该时间段小于约100ms。

在一个实施例中，该时间段包括样品沉积时段、分割时段和玻璃化时段。

在一个实施例中，样品沉积时段在大约10ms和30ms之间。

在一个实施例中，分割时段在大约10ms和20ms之间。

在一个实施例中，玻璃化时段小于约50ms。

第二方面提供了一种制备电子显微镜样品制备的方法；该方法包括：将电子显微镜样品载体插入载体保持器中；向电子显微镜样品载体提供流体样品；和将气体的流动从气体出口导向电子显微镜样品载体的表面，以调节由电子显微镜样品载体支承的流体。

在一些实施例中，该方法包括：将气体的流动导向表面，使得气流基本上平行于该表面。

在一些实施例中，该方法包括：将气体的流动以一入射角导向表面，该入射角被选择为使得气流可操作以去除在电子显微镜样品载体上接收的多余流体样品。

在一些实施例中，该方法包括：将气体的流动导向表面，使得气流基本上垂直于表面。

在一些实施例中，该方法包括：将气体的流动以一入射角导向表面，该入射角被选择为使得气体的流动构造成均匀地影响电子显微镜样品载体表面。

在一些实施例中，该方法包括：调节气体出口，以调节气流朝向表面的入射角。

在一些实施例中，调节由电子显微镜样品载体支承的流体包括去除由电子显微镜样品载体支承的多余流体。

在一些实施例中，调节由电子显微镜样品载体支承的流体包括导致由电子显微镜样品载体支承的流体不均匀蒸发，以在样品载体上获得流体厚度梯度。

在一些实施例中，调节由电子显微镜样品载体支承的流体包括导致由电子显微镜样品载体支承的流体均匀蒸发，以在样品载体上获得均匀的流体厚度。

在一些实施例中，调节由电子显微镜样品载体支承的流体包括导致由电子显微镜样品载体支承的流体的冷却，以使样品载体上的流体玻璃化。

在一些实施例中，该方法包括：构造单个气体出口，以将气体的流动基本上对称地导向电子显微镜样品载体的相对的表面，以调节由电子显微镜样品载体支承的流体。

在一些实施例中，该方法包括：构造至少一个气体出口，以将气体的流动基本上对称地导向电子显微镜样品载体的相对的表面，以调节由电子显微镜样品载体支承的流体。

在一些实施例中，该方法包括：构造气体加湿器，以调节气流的湿度。

在一些实施例中，提供流体包括构造流体源，以将流体样品引入样品载体。

在一些实施例中，该方法包括：构造冷却装置，以接收样品载体和流体，并且冷却、低温冷却和/或玻璃化样品载体上的流体。

在一些实施例中，该方法包括：构造液态乙烷浴，以接收样品载体并冷却、低温冷却和/或玻璃化样品载体上的流体。

在一些实施例中，该方法包括：提供冷却气体出口并构造冷却气体出口，以将冷却气体流导向电子显微镜样品载体的表面，以冷却、低温冷却和/或玻璃化由电子显微镜样品载体支承的流体。

在一些实施例中，该方法包括：实现在将流体引入样品载体和启动来自气体出口的气流之间的等待时段。

在一些实施例中，该方法包括：实现在来自出口的气流的启动和停止之间的活动时段。

在一些实施例中，该方法包括：实现在来自出口的气流停止和关于保持在样品保持器中的样品载体采取其它活动之间的松弛时段。

在一些实施例中，该方法包括：调节等待时段、活动时段或松弛时段中的一个或多个。

在一些实施例中，该方法包括：对样品保持器中的电子显微镜样品载体成像。

在一个实施例中，该方法包括提供具有悬浮在流体中的多个标本的流体样品。

在一个实施例中，该方法包括在流体中提供具有每单位体积的标本浓度的多个标本。

在一个实施例中，该方法包括选择标本浓度，以在样品载体的每个成像孔中提供选定数量的标本。

在一个实施例中，该方法包括使用由气体出口提供的气体流动分割接收在样品载体上的流体样品。

在一个实施例中，该方法包括将接收在样品载体上的流体样品分割成流体样品的保留在样品载体上的保留部分和流体样品的从样品载体去除的去除部分。

在一个实施例中，该方法包括分割接收在样品载体上的包括具有标本浓度的保留部分流体样品。

在一个实施例中，去除部分包括标本。

在一个实施例中，去除部分具有标本浓度。

在一个实施例中，该方法包括用流体样品沉积器将流体样品沉积在样品载体上。

在一个实施例中，该方法包括在选定的处理时段内，控制流体样品沉积器以沉积流体样品，控制气体出口以分割流体样品，和控制冷却装置以使保留部分玻璃化。

在一个实施例中，处理时段包括一个选定的时间段，在该时间段内，防止保留部分中的少于选定比例的标本的分解和重新定向到对齐取向中的至少一个。

在一个实施例中，选择时间段，以使流体的蒸发最小化。

在一个实施例中，该时间段小于约1s。

在一个实施例中，该时间段小于约100ms。

在一个实施例中，该时间段包括样品沉积时段、分割时段和玻璃化时段。

在一个实施例中，样品沉积时段在大约10ms和30ms之间。

在一个实施例中，分割时段在大约10ms和20ms之间。

在一个实施例中，玻璃化时段小于约50ms。

在随附独立和从属权利要求中阐述了其它具体的和优选的方面。从属权利要求的特征可以适当地与独立权利要求的特征组合，并且可以与权利要求中明确阐述的特征之外的特征组合。

在设备特征被描述为可操作成提供功能的情况下，应当理解，这包括提供该功能的设备特征或者适配或构造成提供该功能的设备特征。

附图说明

现在将参考附图进一步描述本发明的实施例，图中：

图1a和图1b示意性地示出了显微镜样品载体；

图2a至2e示出了在诸如图1所示的样品载体上制备的标本在不同的放大倍数下的成像；

图3示出了根据一种布置的装置的主要部件；

图4a至4c示意性地示出了图3的装置的主要部件在制备显微镜样品时的操作；

图5示出了将样品或标本流体引入由诸如图3所示的装置接收的样品载体；

图6是由包括在诸如图3所示的装置中的成像设备记录的样品载体的视图；

图7a至7c示出样品在诸如图3所示的装置中使用的样品载体上的行为；

图8a和8b示意性地示出了栅格载体上的流体样品的行为；

图9示出了诸如图3中所示的装置的部件；和

图10是根据一个实施例的时序图。

具体实施方式

在详细描述一种可能的布置之前，提供一般概述。

显微镜技术可以用于成像标本。显微镜技术包括电子显微镜。根据这些技术，电子束用于“照射”标本。电子束中存在的样品导致电子束变化。可以检查由样品引起的电子束变化，以产生标本的放大图像。

用于低温电子显微镜(cryo-em)的直接电子探测器的最新发展在过去的5年中已经导致通过该方法确定的结构数量激增：从2009年的130个到2014年的521个，对于高分辨率结构(分辨率优于9埃)甚至更多：2009年是40个，2015年(1月至10月)是229个。随着该技术随着更好的显微镜、探测器和软件进一步发展，已经认识到结构确定过程中的限制因素可能是样品的制备。此外，已经认识到正在成像更具挑战性的样品，这些样品越来越需要耗时的条件优化。然而，目前制备样品的方法难以再现，并且通常对大分子复合物有害。因此，认为迫切需要更好的方法来制备用于cryo-em的样品。

各方面和实施例认识到，为了成功成像，必须充分地制备用于成像的标本。成功且可再现地制备样品或标本可能是从显微镜技术获得有用结果的关键。应当理解，不正确或不成功地制备用于检查的标本可能导致标本损坏、差的和/或不可再现的结果。

图1a和图1b示意性地示出了一种典型的显微镜样品载体。如图所示，应当理解，对于cryo-em应用，样品载体可以典型地包括具有例如几十微米的栅格间距的金属栅格。栅格可以包括具有方形栅格孔的栅格。载体还可以包括悬置跨过方形栅格孔上的多孔膜，例如多孔碳膜，其具有直径介于0.5和10微米之间的孔。可以将包括待成像的蛋白质的流体放置在多孔膜和栅格上(多孔膜和栅格一起构成样品载体)。包括蛋白质标本的流体进入多孔碳的孔。图1b更详细地示出了一种典型的样品载体的结构。可以看到多个栅格构件，多孔碳膜别布置成横跨该栅格构件。

图2a至2e示出了在诸如图1所示的样品载体上制备的标本在不同的放大倍数下的成像。图2a示出了构成样品载体一部分的栅格的宏观结构。从图2a中可以看出，栅格中可能存在一些损坏或不一致。如可以看出的那样，有一些黑暗的栅格方格。图2b是图2a的样品载体的一些栅格方格的图像，其中，可以开始看到多孔膜的结构。图2c示出了单个栅格方格中的多孔碳的结构。图2d示出了多孔碳的多个孔。图2e示出了多孔碳的单个孔中的蛋白质的图像。

根据传统的样品制备技术，以下列方式制备用于成像的电子显微镜样品或标本：例如通过移液器将包括待成像的样品或标本的流体手动地放置在金属栅格样品载体上。流体使栅格润湿并饱和，填充栅格方格，更具体地，填充栅格孔中的多孔碳中的孔。去除多余的流体并冷却样品载体，使得含有样品的流体玻璃化。然后储存包括样品液的样品载体，直到在电子显微镜下可获得成像位置。

目前，所有用于制备例如用于cryo-em的样品的方法都使用滤纸来“吸除”来自保持样品的cryo-em栅格的多余液体。通过将适当的吸墨纸压在样品载体栅格的一个或两个表面上来实现该吸除过程。吸除过程可能对样品栅格或支承在栅格上的样品造成物理损坏。吸除过程导致与样品载体上留下的样品流体相关的可变结果。一些栅格方格可能完全是空的，一些可能包括大量流体。相邻的栅格方格可能在孔中提供非常不同的流体厚度。样品载体栅格之间的这种变化可能导致可变的图像质量。根据吸除法制备的“良好”栅格(即可以使样品清楚成像的栅格)的典型成功率是每10个制备的栅格中有1-2个。此外，应当理解，根据用于去除多余样品流体的吸除技术的样品制备的最终结果只可以在电子显微镜中评估，该电子显微镜是不适合高通量分析的仪器。换句话说，在栅格到达电子显微镜以进行实际成像之前，不能对制备的栅格进行质量控制。因此，样品栅格制备目前是cryo-em结构确定中最重要的瓶颈之一。

认识到迫切需要一种制备样品栅格的方法，该方法产生更加一致且可再现的样品栅格。还认识到，可能希望提供一种方法，该方法允许在样品达到完全成像之前确定样品栅格的质量的指示，即不需要低温电子显微镜。

概述

认识到可以创造一种装置，该装置可以实施更加可再现的方法来制备样品。这些样品例如可以包括用于单个颗粒或单个蛋白质cryo-em的样品。装置可以实施使用受控的气体流动(可能是短时间爆发或“喷射”)来从例如样品栅格去除多余液体的方法。与使用滤纸吸除的方法相比，使用气体的流动可以提供多个优点。特别地：由于可以精确地确定气流的物理特性，例如喷射气体的压力和时间，因此可以从样品制备中获得更加可再现的结果。此外，已经发现，气流的方向性可能在栅格的宽度上产生样品层厚度的精细梯度，因此增加了在制备的各栅格上的一些位置获得支承样品的液体的正确厚度的机会。由于使用受控的气体流动的方法不使用使样品栅格模糊的滤纸，因此在一些布置中，可以在制备过程中使用高分辨率相机来监测和记录栅格和样品。这种监测可以使用户能够将栅格在制备期间的可见属性与在低温电子显微镜中观察到的栅格的最终质量进行联系。这样，如果发现在样品栅格的制备期间使用次优条件，则可以更清楚将改变哪些制备参数。这样的选择可以使栅格制备方法不再是“碰巧的”过程，而是提供精确限定的技术，该技术从用于显微镜技术(包括cryo-em技术)的标本制备中去除了不确定性。

气流样品制备技术还具有多个其它优点，包括需要较小的样品体积的可能性、在一些实施例中使用可选择的冷冻/玻璃化技术(不依赖于插入液态乙烷中)的可能性和将制备装置并入显微镜中，使得样品制备和样品成像成为同一个过程。最终，用户将只需要提供样品，之后可以在没有用户干预的情况下执行后续步骤。

采用整体方法进行样品制备，在一种实现中，气流样品制备技术可以包括一部分样品制备装置，该样品制备装置利用插入-冷冻/玻璃化布置来使用于cryo-em的样品栅格玻璃化。

样品制备装置可以构造成使用加压气体的短时间爆发或“喷射”来从样品栅格去除多余的样品流体，仅留下适合用于cryo-em成像的薄层。

传统的样品制备装置使用滤纸来通过吸除法去除多余样品，并且众所周知是不可再现的。已经认识到，使用与样品制备相关的气流可以更好地控制可能影响样品质量的各种因素，继而可以提供更可靠的显微镜结果。

装置的一些实现可以包括成像设备，例如摄像机，其构造成在制备过程期间监测和记录样品栅格。这种记录可以向用户提供关于样品的可能质量的即时反馈。使用滤纸“吸除”的传统方法不能类似地被直接监测，因为滤纸阻挡了样品栅格的任何视图，因此只有在制备样品栅格后的数小时或几天，在安装到低温电子显微镜中时才能正确地监测得到的样品栅格的质量。

示例装置

图3示出了根据一种布置的装置的主要部件。所示装置包括电子显微镜样品制备设备1。该设备包括：构造成接收电子显微镜样品载体的载体保持器10。电子显微镜样品载体(图3未示出)可以包括诸如图1和2所示的样品载体。特别地，样品载体可以构造成接收流体样品。流体样品例如可以包括悬浮在流体中的待研究蛋白质。该设备还可以包括气体出口20，其构造成将气体的流动导向所述电子显微镜样品载体的表面。气体出口20可以包括喷嘴，该喷嘴构造成产生气体的流动，该气体的流动调节由电子显微镜样品载体支承的流体样品。在图3所示的示例性布置中，该设备包括围绕载体保持器10基本上对称布置的两个气体出口20。

图3中所示的设备包括插入-冷冻装置，其用于根据本文所述的气流布置在制备后使包括流体样品的样品载体玻璃化。因此，所示设备使得该设备还包括护罩30，其布置成来接收通过来自喷嘴20的气体的短时间爆发从样品载体去除的任何流体。在所示的布置中，护罩是可移动的，使得当样品(未示出)插入液态乙烷(也未示出)以将样品载体上的含有待原位成像的标本的流体玻璃化时，该护罩不会阻碍样品载体从气体出口区域移动到液态乙烷。

图3中所示的设备还包括相机40，其构造成记录位于样品载体保持器10中的载体的一个或多个图像。

诸如图3中所示的设备的操作使得样品栅格放置在样品载体保持器10中。用户可以使用移液管将流体样品转移或分配到样品载体上。在所示的示例性设备中，两个加压气体流从相对于由载体保持器支承的样品栅格的表面以微小角度(大约20度)放置的气体出口20排出。入射气流用于从样品载体去除多余的流体样品。去除多余的流体可以有助于形成支承在载体栅格上的样品流体薄层。在图3所示的示例中，出口20构造成分配加压氮气流，但是应当理解，可以适当地使用其它通常惰性的气体。此外，如下面所详细讨论的那样，一些布置和实现可以允许控制气流的湿度，以当样品载体在去除多余流体之后继续暴露于气流时，控制流体从样品载体蒸发的速率。

在所示的布置中，两个气体喷嘴同时将气体的流动(每侧一个)输送到栅格的表面，以保证样品载体保持在期望位置，并且通过气流进行的样品流体调节基本上是对称的。在暴露于气体的流动之后，样品栅格可以被释放或移动到液态乙烷中。在图3所示的布置中，在样品格栅释放或转移时，两个气体喷嘴20连接到插入式触发器，并且构造成使得它们和护罩30在样品朝向液态乙烷(未示出)插入时移开。

在图3所示的布置中设置的成像设备40包括设置视频记录设备。em样品栅格的视频记录可以允许对样品进行连续的实时监控，提供关于由栅格承载的流体样品的可能产生的质量的直接反馈。

图4a至4c示意性地示出了图3的装置的主要部件在制备显微镜样品时的操作。如图4a所示，在图3所示的示例性设备中，两个气体喷嘴20就位成紧邻构成样品保持器10的镊子的尖端。样品保持器将在设备被使用时保持样品栅格(未示出，但是位于图4中标注a的区域中)。在栅格下方设置护罩30，该护罩30防止被去除的样品流体落入典型地位于样品载体下方的液态乙烷(未示出)浴中。在图3和图4a的布置中，设置机构50，以使气体出口20和护罩30相对于样品保持器10移动，从而保证气体喷嘴和护罩移开，并且镊子可以无障碍地向下插入液态乙烷(未示出)中。图4a示出了处于关闭状态的装置，就像在流体样品调节期间那样，例如使用受控的气体流动去除多余的样品和随后调节样品载体上的液体。图4b示出了处于打开状态的装置，其中，气体喷嘴20和护罩30通过机构50移位，使得保持样品栅格的镊子10可以沿着垂直或水平方向自由移动。图4c示出处于打开状态的装置，其中，镊子10已经通过机构50向下移动，使得样品载体可以向液态乙烷浴移动并移动到该液态乙烷浴中，以实现快速样品载体玻璃化(未示出)。

图5示出了将样品或标本流体引入由诸如图3所示的装置接收的样品载体。在图5所示的示例中，使用移液管60将样品流体70放置在载体栅格80上。应当理解，一些布置可以允许将样品自动分配到栅格上。

图6是由包括在诸如图3所示的装置中的成像设备记录的样品载体的视图。样品载体80包括已经分配有样品流体70的栅格。设置成像装置40允许在样品流体70已经被分配到栅格80上之后，通过等待时段(在此期间可以看到流体样品“湿润”栅格)、通过活动时段(在此期间，向样品载体的表面施加气流并去除多余的流体，并且可能发生蒸发，直到停止施加气流)和通过松弛时段(在气流停止和样品载体上的流体样品玻璃化之间，在此期间，流体可以“松弛”并在样品载体上重新分布)，分析样品流体70的行为。

例如，图7a至7c基于使用成像设备40在样品流体70已经被分配到栅格80上并暴露到来自喷嘴20的气流之后捕获的样品流体70的图像，示出了样品在诸如图3所示的装置中使用的样品载体上的行为。特别地，图7a至7c提供了使用摄像机捕获的图像的示例，其示出了当放置在栅格上的流体经受气流时，波前穿过栅格的移动。

流体-栅格-气体相互作用：概述

类似于图3中所示的设备的操作的视频分析表明，关于放置在载体上的流体和导向样品载体的气体流动之间的相互作用，发生了多个阶段。

特别地，观察到以下现象：

发生将流体样品引入栅格。表面张力最初倾向于将流体样品保持成液滴的一般形式。允许经过一段时间(“等待”时段)可以允许流体样品松弛到栅格孔中。也就是说，可以观察到流体样品在初始引入之后“润湿”样品。

在“活动”时段期间，在此期间可以基本上平行于载体表面的表面施加气体层流，气体的流动最初操作成去除多余的样品流体。也就是说，去除载体表面上存在的任何残留的流体样品珠。只要适当地选择气体流动方向，典型地不会去除已经润湿/进入栅格空间的流体样品。

由于越靠近气流出口的蒸发速率越大，基本上平行于载体表面施加的气体层流的继续施加可能导致在栅格的载体方块中产生的流体样品的“梯度”。也就是说，离气体出口或气流源最远的栅格方格倾向于包含更多的流体。图8a以横截面示意性地示出了栅格载体条90之间的流体样品70的典型行为。样品载体上实现的这种梯度可能是有益的，因为它可以保证在载体上的某处可能可以出现用于使流体中的标本成像的最佳流体厚度。

停止施加气体层流并等待所谓的“松弛”时段允许格栅载体条之间的流体样品在关于样品载体采取任何其它活动(例如，玻璃化)之前“松弛”。松弛时间允许栅格方格中的流体沉淀，并抵消由施加气流引起的任何不对称的表面张力。结果，每个栅格或孔中的流体可能更均匀。图8b以横截面示意性地示出了在去除气流之后，栅格载体条90之间的流体样品70的典型行为。

最后，可以将包括流体样品的样品载体玻璃化。典型地，通过将样品载体插入液态乙烷浴中来实现玻璃化。应当认识到，在一些布置中，可以使用适当选择的其它气流来实现玻璃化。

图9示出了诸如图3中所示的装置的部件。基于先前关于流体与样品载体的相互作用的观察，可以为设备设置一种装置，以关于在样品制备过程期间发生的不同步骤实现不同的可变时间设置。图9示出电子开关允许设定不同时间：i)等待时间(“等待时段”)，在向载体施加流体样品和气流启动之间，使得流体样品例如可以与栅格相互作用；ii)施加气流的持续时间(“活动时段”)；和iii)“松弛”等待时间(“松弛时段”)，在气流停止和样品载体玻璃化(例如通过将栅格插入液态乙烷中)的时间之间。

可选择的实施方式

应当理解，图3的装置的一般操作仅说明了在制备电子显微镜样品中使用气体流动的一般原理的一种具体实施方式。

特别地，所描述的布置的各种可选方案和附加方案对于技术人员是显而易见的。

关于向样品载体施加的气流，应当理解，流动方向可能很重要。基本上平行于样品载体表面的气流可以实现有效去除多余的流体样品。施加基本上垂直于样品载体表面的气流可以允许样品液滴均匀地散布在样品上，和/或可以根据需要允许更均匀的蒸发或冷却。气流在样品载体表面上的入射角可以是固定的或可以是可调节的。在不同的制备阶段可以调节向样品施加的气流方向。

还应当理解，气流速率、气流宽度和气流特性(例如层流或其它)可能影响装置的操作。气流速率可以是可调节的。在一些布置中，喷嘴或出口的形状可以确定成保证均匀的层流气流入射穿过样品载体的表面。

可以控制所使用的气体的类型。特别地，可能期望使用一种用于调节载体上的流体样品的气体和可与第一种气体不同的另一种气体，该气体与实现样品载体上的流体样品的冷却或玻璃化的气流有关。类似地，可以调节气流的湿度，以控制例如样品流体蒸发。

在一些布置中，可以控制装置和周围环境的温度，再次保证电子显微镜样品制备的再现性。

在一些布置中，可以向样品载体的相对表面施加对称的气流(诸如在图3的布置中)。在一些布置中，可以设置单个气体出口。单个气体出口例如也可以布置成向样品载体的相对表面对称地施加气流。在一些布置中，单个气流出口可以构造成向样品载体的单个表面供应气流，以调节流体样品。在一些布置中，单个气流出口可以构造成向样品载体的单个表面供应气流，以冷却流体样品。

各种可选择的布置可以在电子显微镜样品制备装置内提供其它功能。在一些布置中，可以向样品载体表面施加100开尔文的冷氮气流，以使样品栅格和支承在栅格上的流体玻璃化。一些布置可以允许向样品载体施加自动流体样品，而不需要用户手动将样品流体移液到样品载体上的适当位置。流体施加的自动化可以允许使用更小的样品体积。手动施加样品需要将约3微升的体积沉积在栅格上。在喷射气体期间典型地去除了大部分样品。使用纳升沉积技术(例如在蛋白质结晶机器人中使用的那样技术)可以允许将所需的样品体积减少大约10倍，从而节省宝贵的样品。

在实施例中，流体样品包含上述那些标本，特别是核糖体小亚基、聚合酶-dna复合物、转录因子-dna复合物、蛋白质样品、生物标本、大分子等。标本地在浓度典型地约为3-10微摩尔的悬浮液中提供。选择标本浓度，以典型地在样品载体中的每个孔中提供一些标本(例如大分子)。

实施例认识到，为了能够构建标本(例如大分子)的精确图像，需要使标本以近自然的形式和沿着多个方向低温悬浮，以能够从多个标本的成像构建三维图像。特别地，实施例认识到，当样品流体已经接收在样品载体上时，可能发生大分子复合物、亚复合物、配体、辅因子等的分解。而且，当流体样品被载体保持器接收时，流体的蒸发可以改变可能对大分子有害的缓冲条件(例如盐浓度增加、ph变化等)。此外，当流体样品已经被样品载体接收时，大分子可能与气-液界面相互作用，并以优选的取向结合。因此，实施例力图在一定的处理时段内完成介于流体样品沉积在样品载体和然后被玻璃化之间的全部过程，该处理时段消除或最小化了流体的分解和/或蒸发和/或重新定向到优选取向的程度。另外，样品载体上的流体样品的处理力图最小化样品中标本浓度的变化。选择流体中标本的浓度，使得样品载体的每个孔中存在适当数量的样品。通过使足够数量的标本以近自然的形式和沿着多个方向随机悬浮，可以拍摄和组合不同标本的图像，以提供标本的三维视图。

在实施例中，提供了一种用于快速沉积、分割和玻璃化流体样品的自动装置。对于典型的标本，从沉积在栅格上到玻璃化的时间应该在亚秒范围内，并且典型地小于约100ms。该自动装置与上文所述类似；然而，在距离载体栅格约10mm的位置处使用机电注射器(例如小体积(25-100微升)注射器)代替移液管60，以将样品流体70注射到载体栅格80上。

图10是示出该自动装置的时序的时序图。在一个实施例中，通过机电注射器在约20至30ms之间(更典型地在约10至15ms之间)的沉积时段内沉积3微升的样品流体。在该沉积之后可能发生长达10ms的可选延迟。当该可选延迟时段期满时，从气体喷嘴20以在约2至4巴之间的典型压力施加气流，持续约10至20ms的分割时段。其分割样品流体，多余的样品流体从保留在载体栅格80上的剩余样品流体中分开或分离。当分割完成时，载体栅格80被平移，使得它在小于约50ms的玻璃化时段内被接收在冷却浴中，在此期间发生玻璃化。

因此可以看出，实施例将样品施加(注射)、样品分割(“喷射”)和样品玻璃化(插入)之间的时间缩短到毫秒级的时间尺度。这样，总处理时间接近所研究的大分子与气-液界面相互作用和保持以优选方向结合的频率。通过缩短时间，使气-水界面相互作用的数量最小化，其使得以该优选方向结合的分子数量最小化。此外，通过在毫秒级的时间尺度内工作，样品蒸发的作用大大降低。这防止了可能对大分子有害的缓冲条件的变化(例如盐浓度增加、ph的变化)。该方法还允许使用更高的样品起始浓度(因为样品不再是在栅格制备过程中浓缩)，这有利于使在较低浓度下分解的弱结合复合物。

应当理解，可能需要根据流体样品的粘度来改变时间；越粘稠的样品可能需要气体喷嘴20喷射越长时间。可选择地，通过缩短等离子体室中(即辉光放电)的处理时间，可以使载体栅格80不那么具有亲水性。特别地，基于设备的物理布置和流体样品的性质，可以调节实现分割的气流的特性。

应当理解，在实施例中，上述参数可以改变2至3倍。

在一个实施例中，在样品沉积和样品分割之后，通过高分辨率/高速摄像机监测载体栅格80。通过低温电子显微镜来监测样品栅格80的最终质量。

在一个实施例中，气阀位于气体喷嘴20的正前方。

在一个实施例中，使用强(2-4mbar)冲击(喷射)气体来通过力(非蒸发)从cryo-em栅格中去除多余的样品。气流可以与cryo-em栅格的表面平行、呈一定角度或垂直。在栅格的任一侧可能有一个或两个气流进行操作。样品沉积、多余样品去除和样品玻璃化以这样的方式发生，即整个过程在亚秒级的时间范围内发生，从而：1)防止/减少正在研究的样品/大分子的优选取向，和/或2)防止/减少大分子复合物、亚复合物、配体、辅因子等的分解，和/或3)防止/减少样品的蒸发。

尽管本文已经参考附图详细公开了本发明的说明性实施例，但是应该理解，本发明不限于精确的实施例，在不背离由随附权利要求及其等同方案限定的本发明的范围的情况下，并且本领域的技术人员可以在其中实现各种改变和修改。