诊断试剂用荧光粒子及使用其的免疫测定试剂的制作方法

本发明涉及诊断试剂用荧光粒子及使用其的免疫测定试剂。

背景技术：

目前，在临床检查试剂(以下有时称为诊断试剂)中，利用担载有分析物的结合配偶体(例如抗体等)的载体微粒的、免疫层析法所使用的测定试剂已经有多种实现了实用化。而且，为了提高分析物的检测灵敏度，提出了使用通过照射光而发光的荧光粒子作为载体微粒的方案(例如参照专利文献1)。

专利文献1中，作为免疫层析中使用的荧光粒子，公开了一种含有有机系荧光物质的二氧化硅粒子。该二氧化硅粒子的粒子表面为亲水性，由此可以抑制起因于疏水性相互作用的非特异性反应，但另一方面，在担载分析物的结合配偶体时则难以使用物理性吸附法而需要使用化学性结合法。

专利文献2公开了以无机系荧光微粒为主体的芯/壳型微粒荧光体。该无机系荧光微粒虽然具有适于抗原-抗体反应等生物技术领域的微粒性、以及适于荧光观察的激发波长，但由于为无机系微粒而存在具有毒性的问题。另外，分散性方面也有问题。

另外，虽然并非意图用于生物技术领域的微粒，但专利文献3公开了一种以有机系荧光微粒为主体的荧光发光微粒、及其制造方法。利用该有机系荧光微粒，虽然解决了上述的毒性问题，但在作为诊断试剂的材料使用时，在发光强度等方面仍有问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2015-022914号公报

专利文献2：国际公开第2007-102458号公报

专利文献3：日本特开2003-313545号公报

技术实现要素：

发明所要解决的问题

综上，需要一种在作为诊断试剂的材料使用时容易担载分析物的结合配偶体、无毒性、具有分析物的检测灵敏度(特别是辨识性)和检测重现性的微粒。

本发明的目的在于，提供一种在作为诊断试剂的材料使用时容易担载分析物的结合配偶体、无毒性、检测灵敏度(特别是辨识性)和检测重现性得以提高的担载有分析物的结合配偶体的诊断试剂用荧光粒子、及使用了该荧光粒子的测定试剂。

用于解决问题的手段

本发明包含以下记载的技术方案。

(1)一种诊断试剂用荧光粒子，其特征在于，其含有：合成高分子、以及以粒子的总质量基准计为10质量％以上的凝聚性发光材料，所述诊断试剂用荧光粒子在表面具有与分析物结合的结合配偶体。

(2)根据(1)所述的诊断用荧光粒子，其中，粒子的cv值为20％以下，平均粒径为0.05～3.0μm。

(3)根据(1)或(2)所述的诊断用荧光粒子，其中，合成高分子为含有选自苯乙烯单体及(甲基)丙烯酸中的至少一种的共聚物。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的诊断用荧光粒子，其中，凝聚性发光材料的数均分子量为10000以下。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的诊断用荧光粒子，其中，凝聚性发光材料为被4个以上苯基或苯基衍生物取代了的、乙烯衍生物或苯衍生物。

(6)根据(1)～(4)中任一项所述的诊断用荧光粒子，其中，凝聚性发光材料选自四苯基乙烯、1-(4-溴苯基)-1，2，2-三苯基乙烯、四(4-羟基苯基)乙烯。

(7)根据(1)～(4)中任一项所述的诊断用荧光粒子，其中，凝聚性发光材料为六苯基噻咯或六苯基苯。

(8)一种免疫测定试剂，其使用(1)～(7)中任一项所述的诊断试剂用荧光粒子。

(9)一种含凝聚发光性材料的粒子的制造方法，其具有以下工序：制备种粒子分散液的工序，所述种粒子分散液分散有含有合成高分子的种粒子；制备含有凝聚性发光材料和有机溶剂的乳化液的工序；向种粒子分散液中加入乳化液，使种粒子吸收凝聚性发光材料和有机溶剂而得到溶胀粒子液滴分散液的工序；和使溶胀粒子液滴中的有机溶剂进行液中干燥，得到含凝聚发光性材料的粒子的工序。

(10)根据(9)所述的含凝聚发光性材料的粒子的制造方法，其中，按照凝聚性发光材料质量成为种粒子质量的0.1～64倍的方式，向种粒子分散液中加入乳化液。

(11)一种分析物测定法，其具有以下工序：将可能含有分析物的试样溶液、与含有具有分析物的结合配偶体的含凝聚荧光材料的粒子的溶液混合而制备混合液的工序；在具有至少1个固定化有分析物的结合配偶体的检测部的不溶性载体上使混合液展开的工序；在检测部测定由含凝聚荧光材料的粒子产生的荧光强度的工序；以及将相对于分析物浓度的荧光强度的标准曲线与荧光强度进行对比，对荧光强度与混合液中的分析物浓度建立关联的工序。

(12)一种免疫层析用的测试条，其含有：(a)可能含有分析物的试样溶液的供给部；(b)包含含凝聚荧光材料的粒子的缀合物垫，所述含凝聚荧光材料的粒子在表面具有分析物的结合配偶体；和(c)具有至少1个固定化有分析物的结合配偶体的检测部的不溶性膜载体，其中，含凝聚荧光材料的粒子含有(i)合成高分子和(ii)以粒子的总质量基准计为10质量％以上的凝聚性发光材料。

(13)根据(12)所述的测试条，其中，含凝聚荧光材料的粒子的cv值为20％以下，平均粒径为0.05～3.0μm。

(14)根据(12)或(13)所述的测试条，其中，凝聚荧光材料粒子中所含的合成高分子为含有选自苯乙烯单体及(甲基)丙烯酸中的至少一种的共聚物。

(15)根据(12)～(14)中任一项所述的测试条，其中，凝聚荧光材料粒子中所含的凝聚性发光材料的数均分子量为10000以下。

(16)根据(12)～(15)中任一项所述的测试条，其中，凝聚荧光材料粒子中所含的凝聚性发光材料为被4个以上苯基或苯基衍生物取代了的、乙烯衍生物或苯衍生物。

(17)根据(12)～(16)中任一项所述的测试条，其中，凝聚荧光材料粒子中所含的凝聚性发光材料选自四苯基乙烯、1-(4-溴苯基)-1，2，2-三苯基乙烯、四(4-羟基苯基)乙烯。

(18)根据(12)～(17)中任一项所述的测试条，其中，凝聚荧光材料粒子中所含的凝聚性发光材料为六苯基噻咯或六苯基苯。

发明效果

根据本发明，可提供一种无毒性、分析物的检测灵敏度(特别是辨识性)和检测重现性得到了提高的、担载有分析物的结合配偶体的诊断试剂用荧光粒子。

附图说明

图1：图1是本发明的含凝聚性发光材料的粒子表面的sem照片。

图2：图2是示出对本发明的含凝聚性发光材料的粒子照射波长365nm的紫外线(uv)时的凝聚发光的样子的照片。

图3：图3是图2的局部放大图。

图4：图4是示出对比较例1的含凝聚发光性材料的粒子照射波长365nm的紫外线(uv)时的凝聚发光的样子的照片。

图5：图5是图4的局部放大图。

图6：图6是免疫层析用的测试条的概念图。

具体实施方式

以下，列举实施方式进行本发明的说明，但本发明不受以下的实施方式限定。

[诊断试剂用荧光粒子]

本发明人等为了解决上述课题反复进行了研究，结果发现：通过使聚合物微粒高比例地含有在分散于溶液的状态下几乎不发光但是通过使其凝聚而显示出高发光性的荧光材料(以下也称为“凝聚发光性材料”。)，从而可得到具有高发光强度的荧光粒子。即，本发明涉及一种含有合成高分子和以粒子的总质量基准计为10％质量以上的凝聚性发光材料的、担载有分析物的结合配偶体的诊断试剂用荧光粒子。需要说明的是，在本说明书中，对于在粒子上“担载”分析物的结合配偶体的情形，有时表述为“结合”。

作为构成诊断试剂用荧光粒子的合成高分子，没有特别限定，可列举例如：聚苯乙烯、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、衣康酸聚合物、苯乙烯-亲水性羧基单体共聚物，例如苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-丙烯酸共聚物、苯乙烯-衣康酸共聚物等。其中，优选苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-衣康酸共聚物、苯乙烯及苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物。特别优选苯乙烯及苯乙烯-(甲基)丙烯酸共聚物。

作为苯乙烯磺酸盐中的盐，没有特别限定，可列举钠盐、钾盐、锂盐、铵盐等。这些既可以单独使用，也可以将2种以上组合使用。其中，优选使用苯乙烯磺酸钠。作为本发明中使用的亲水性羧基单体，可以使用甲基丙烯酸、丙烯酸、衣康酸、马来酸、富马酸等。优选的是，可以使用甲基丙烯酸、丙烯酸。

在使用亲水性羧基单体时，聚合后的合成高分子所具有的羧基量会影响荧光粒子的发光强度，因此若将粒子表面的羧基量设为0.001～0.6meq/g，则对于荧光粒子来说，羧基量依存性地显示出强发光。粒子表面的羧基量优选为0.1～0.6meq/g，更优选为0.2～0.6meq/g。粒子表面的羧基量可以利用常规的测定法来测定。例如，可以使用电位差自动滴定装置测定。

作为构成诊断试剂用荧光粒子的凝聚发光性材料，没有特别限定，可列举例如：酮亚胺硼配合物衍生物、双亚胺硼配合物衍生物、四苯基乙烯衍生物、氨基马来酰亚胺衍生物、氨基苯基吡喃并呫吨衍生物(アミノべンゾピロキサンテン誘導体)、三苯基胺衍生物、六苯基苯衍生物、六苯基噻咯衍生物等。上述衍生物中，从合成简便且有市售的角度出发，优选四苯基乙烯衍生物。

作为四苯基乙烯衍生物，可列举例如被4个以上苯基或苯基衍生物取代了的乙烯衍生物。具体可列举如下式(1)所示这样的乙烯衍生物。

[化1]

(式中，r1表示氢原子、溴原子、羟基中的任一个，r2、r3、r4分别表示氢原子或羟基。)

更具体地，可列举四苯基乙烯、1-(4-溴苯基)-1，2，2-三苯基乙烯、四(4.羟基苯基)乙烯。

作为六苯基苯衍生物，可列举例如被4个以上苯基或苯基衍生物取代了的苯衍生物。具体可列举六苯基噻咯或六苯基苯。

作为三苯基胺衍生物，可列举例如4-(二-对甲苯氨基)苯甲醛。

凝聚性发光材料的数均分子量优选为10000以下。其原因在于，当超过上述上限时存在下述倾向：凝聚发光性材料变得难以溶解而无法加工为粒子形态，或者含量下降。

上述的各衍生物除了其自身被包含在诊断试剂用荧光粒子内以外，也可以以被引入聚合物的主链、侧链的方式被包含在诊断试剂用荧光粒子内。但是，由于引入聚合物链时含量会下降或者在粒子合成中需要其它阶段的工艺等原因，优选各衍生物自身被包含在诊断试剂用荧光粒子内。

从辨识性提高的观点出发，以粒子的总质量基准计的凝聚性发光材料的比例为10质量％以上，优选为30质量％以上，优选为95质量％以下。当超过95质量％时，粒子的cv值变大，有时测定试剂的重现性会下降。

诊断试剂用荧光粒子的平均粒径没有特别限定，只要能作为诊断试剂用着色胶乳粒子诊断试剂用荧光粒子来使用，则可以为任意平均粒径。其中，只要为可通过色谱展开的平均粒径，则没有特别的问题，但当使用小粒径的粒子时，有时得不到充分的检测灵敏度，因此更优选为300nm以上且1000nm以下的粒子。

需要说明的是，就本申请中的“平均粒径”而言，使用扫描型电子显微镜(sem)，以在1个视野中可观察到约100个含凝聚性发光材料的粒子的倍率来观察粒子，用卡尺测定随机选择的50个含凝聚发光性材料的粒子的最长径，求出该值的数平均值，将其作为平均粒径。

上述粒子的粒径的变异系数(cv值)优选为20％以下。当超过20％时，试剂制备时的批次重现性差，有时测定试剂的重现性下降。更优选为15％以下。需要说明的是，上述粒径的变异系数通过下式来计算。

粒径的变异系数(cv值)＝粒径的标准偏差/平均粒径

作为制备诊断试剂用荧光粒子的方法，没有特别限定，可以使用公知的方法，但从得到粒径均匀的粒子的方面出发，优选使用种子溶胀法。上述种子溶胀法是使预先合成的粒径均匀的苯乙烯聚合物粒子等在溶解有凝聚发光性材料的溶液中溶胀的方法。由此，通过制备含有凝聚发光性材料的均匀液滴并适时地进行干燥，从而可得到目标荧光粒子。

例如，在使用苯乙烯及苯乙烯磺酸钠、作为亲水性羧基单体的甲基丙烯酸时，所得到的粒子具有均匀的粒度分布、优异的分散稳定性，分散稳定性是由各诊断试剂用荧光粒子的表面所存在的苯乙烯磺酸来源的磺酸基彼此的静电斥力带来的。另外，当在粒子表面存在羧基时，一方面有助于分散稳定性，另一方面还可用作与抗体的化学结合部位，因此是优选的。

[诊断试剂用荧光粒子的制造方法]

作为诊断试剂用荧光粒子的制造方法，没有特别限定，作为一例，可列举以下的方法(种子溶胀法)。

(i)首先制备构成种粒子的合成高分子。作为制备合成高分子的方法，没有特别限定，可以使用公知的方法，优选为不使用乳化剂(表面活性剂)的无皂乳液聚合法。作为该乳液聚合法中使用的聚合引发剂，可列举过硫酸钾、过硫酸铵等，可以优选过硫酸钾。本发明中可以如下制造：向反应容器中加入离子交换水、例如单体、聚合引发剂，边搅拌边对反应容器内进行氮置换，然后在65℃～80℃反应12～42小时。得到的粒子具有低cv值、优异的分散稳定性。作为合成高分子，可以使用上述的合成高分子。此时，从提高诊断试剂用荧光粒子的分散度、辨识性评价的限制性的观点出发，包含合成高分子的种粒子优选平均粒径为0.05～3.0μm、cv值为1～20％。

(ii)然后，制备将得到的种粒子分散于溶剂而成的种粒子分散液。作为溶剂，没有特别限制，可以使用水。

(iii)制备含有将凝聚性发光材料溶解于有机溶剂而成的溶液的乳化液。例如，将作为凝聚性发光材料的四苯基乙烯溶解于乙酸乙酯，将得到的四苯基乙烯溶液添加到使苯乙烯磺酸钠溶解于水而成的水溶液中，由此可以制备乳化液。

(iv)边搅拌边将乳化液加入到种粒子分散液中，得到溶胀粒子液滴分散液。然后，将向种粒子分散液中加入乳化液而得的溶液持续搅拌1分钟～36小时左右、优选1小时～30小时左右、更优选12小时～24小时左右、进一步优选20小时～24小时左右，由此可以使种粒子吸收凝聚性发光材料和有机溶剂。在得到溶胀粒子液滴的分散液时，优选按照凝聚性发光材料质量为种粒子质量的0.1倍以上且64倍以下的方式加入乳化液。

(v)使溶胀粒子液滴中的有机溶剂进行液中干燥，得到含凝聚发光性材料的粒子。液中干燥的条件根据有机溶剂的沸点、气化点来确定。例如，在使用乙酸乙酯作为有机溶剂时，通过将得到的溶胀粒子液滴的分散液在65℃以200rpm的速度搅拌24小时左右，从而可以使乙酸乙酯干燥。需要说明的是，也可以代替加热(或与加热一起)来进行减压。

通过以上来制造含凝聚发光性材料的粒子。

[粒子的用途]

本发明的诊断试剂用荧光粒子可以通过在粒子表面结合作为分析物的结合配偶体的抗原(或抗体)等，从而很好地用于利用抗原-抗体反应的酶联免疫测定法、荧光免疫测定法、胶乳凝聚法、免疫层析法等利用了生物学反应的各种方法。

根据本发明，可提供使用上述的诊断试剂用荧光粒子的免疫测定试剂。

作为在诊断试剂用荧光粒子的粒子表面结合抗原(或抗体)的方法，没有特别限定，可以使用现有公知的方法。例如有如下方法：在含有抗原(或抗体)的缓冲液中浸渍诊断试剂用荧光粒子，并在一定温度下培养一定时间等基于物理吸附的结合方法；基于化学结合的结合方法。物理吸附是利用粒子表面与抗原(或抗体)的疏水性相互作用的方法，具有操作容易的优点，化学结合是利用粒子表面的反应性官能团与抗原(或抗体)中的特定基团的化学反应的方法，具有能够控制粒子与抗原(或抗体)的距离等优点。在合成高分子具有羧基时，可以使抗原(或抗体)所含有的氨基进行交联来结合。这些可以考虑分析物的结合配偶体的特性等来适宜选择。

根据本发明，可制作显示出足够强的发光的诊断试剂用荧光粒子，由此在将诊断试剂用荧光粒子作为免疫测定用试剂来使用时，目视判定性大幅提高，可以提高检测灵敏度。另外，由于粒子分散度低，因此制备试剂时的批次重现性提高。

以下对诊断试剂用荧光粒子的具体用途和术语进行说明。

(分析物测定法)

根据本发明，可提供一种分析物测定法，其具备下述工序：将含有或可能含有分析物的试样溶液与含有具有分析物的结合配偶体的含凝聚荧光材料的粒子的溶液(该溶液包含如图6f所示的、在所谓的缀合物涂布垫中以干燥状态存在的情况)混合，制备混合液的工序；在具有至少1个固定化有分析物的结合配偶体的检测部的不溶性载体上使混合液展开的工序；在检测部测定由含凝聚荧光材料的粒子产生的荧光强度的工序；以及将相对于分析物浓度的荧光强度的标准曲线与荧光强度进行对比，对荧光强度与混合液中的分析物浓度建立关联的工序(在该对荧光强度与混合液中的分析物浓度建立关联的工序中，包括建立：通过与作为基准的荧光强度的强弱关系来判断分析物是否存在的定性的或半定量的关联)。

根据该测定法，通过使用上述的灵敏度高的含凝聚荧光材料的粒子，从而即使在分析物浓度低的情况下，也能够精度良好地测定分析物的有无、分析物浓度。上述中，建立关联既可以通过目视进行，也可以利用装置进行。在通过目视进行的情况下，本发明尤其有利。

另外，通过进一步适当组合地使用包含后述的第一试液(r1)和第二试液(r2)的测定试剂，从而可以使用现有的测定装置在宽泛的范围幅度内进行分析物测定。

(测试条)

根据本发明，可提供如图6所示的免疫层析用的测试条，所述免疫层析用的测试条具备：塑料制粘合片a；配置在塑料制粘合片上的不溶性膜载体b，所述不溶性膜载体b具有至少1个固定化有分析物的结合配偶体的检测部c；配置在不溶性膜载体b的一端侧的缀合物涂布垫d，所述缀合物涂布垫d具有：可能含有分析物的试样溶液的供给部e、和固定化有具有分析物的结合配偶体的含凝聚荧光材料的粒子的缀合物f；以及配置在不溶性膜载体b的另一端侧的吸收垫g。

根据该测试条，通过使用上述的灵敏度高的含凝聚荧光材料的粒子，从而与以往的测试条相比目视确认变得极为容易。

需要说明的是，通过如图6所示那样设置多个检测部，从而能进行其它项目的检查。图6中，为了缩短测定时间和提高辨识性，缀合物f在缀合物涂布垫d的背面与不溶性膜载体b的表面接触的区域中的、除了试样流动方向的下游侧端的部分形成为线状。但是，缀合物f的配置位置、形状没有特别限制。

(试样)

作为测定对象，没有特别限定，可列举各种生物试样。例如血液、血清、血浆、尿、唾液、咳痰、鼻涕、鼻腔擦拭液、咽喉擦拭液、泪液等体液。

(分析物)

作为分析物，如果是蛋白质、肽、氨基酸、脂质、糖、核酸、半抗原等只要存在结合于该分析物的配偶体就在理论上能够测定的分子，那么没有特别限制。作为例子，可列举：流感病毒等病毒、细菌、crp(c反应蛋白)、lp(a)(脂蛋白(a))、mmp3(基质金属蛋白酶3)、抗ccp(环瓜氨酸肽)抗体、抗磷脂抗体、抗梅毒抗原抗体、rpr、iv型胶原蛋白、psa、afp、cea、bnp(脑钠尿肽)、nt-probnp、胰岛素、微量白蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂c、rf(类风湿因子)、ca-rf、kl-6、pivka-ii、fdp、d二聚体、sf(可溶性纤维蛋白)、tat(凝血酶-抗凝血酶iii复合体)、pic、pai、xiii因子、胃蛋白酶原i·ii、苯妥英、苯巴比妥、卡马西平、丙戊酸、茶碱等。

(结合配偶体)

就结合配偶体而言，作为与分析物结合的物质，可列举蛋白质、肽、氨基酸、脂质、糖、核酸、半抗原等，从特异性及亲和性的角度出发，通常利用抗体、抗原。另外，只要针对分析物的结合特异性、亲和性落入所期望的范围，则对分子量的大小(例如，若为抗体，则包括为免疫球蛋白整体的情况、为分析物结合性功能片段的情况等)、天然或合成之类的来源(例如，若为抗体，则包括来自动物体液的抗体、利用基因重组技术得到的抗体)没有特别限制。

(测定试剂)

关于供于本发明的测定法的测定试剂的构成，没有特别限制，优选包含上述测试条的免疫层析用的试剂。另外，考虑到在临床检查领域通用的自动分析装置中的使用时，通常为由双组分构成的测定试剂，所述双组分为由缓冲液构成的第一试液(r1)、和含有担载有分析物的结合配偶体的含凝聚荧光材料的粒子的第二试液(r2)。

(测定试剂的成分)

就使用本发明的含凝聚荧光材料的粒子的测定试剂的成分而言，除了作为反应的主要成分的担载有结合配偶体的微粒以外，还可以含有作为对试样的离子强度、渗透压等进行缓冲的成分的、例如乙酸、柠檬酸、磷酸、tris、甘氨酸、硼酸、碳酸及good’s缓冲液、它们的钠盐、钾盐、钙盐等。另外，还可以含有作为促进、增强分析物和与该分析物结合的配偶体的结合(例如抗原抗体反应)的成分的、聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、磷脂聚合物等高分子。另外，还可以组合含有作为对分析物和与该分析物结合的配偶体的结合进行控制的成分的、高分子物质、蛋白质、氨基酸、糖类、金属盐类、表面活性剂类、还原性物质、离液物质等通用成分中的一种或多种成分。另外，还可以含有消泡成分。

实施例

以下通过实施例、比较例对本发明的详细情况进行说明，但本发明并不受这些例子的限定。

[实施例1]

(种粒子的制造)

向具备搅拌机、回流用冷凝器、温度检测器、氮导入管及夹套的玻璃制反应容器(容量1l)中，添加超纯水400g、苯乙烯单体10g、过硫酸钾0.20g，对容器内进行氮气置换后，边在65℃下以200rpm的速度进行搅拌边聚合24小时(无皂乳液聚合法)。

聚合结束后，将上述溶液利用纸质滤纸进行过滤处理，取出胶乳粒子。然后，用透析膜进行48小时透析处理，得到作为种粒子的纯化了的测定试剂用胶乳粒子。得到的胶乳粒子的平均粒径为0.15μm，粒径的cv值为5.1％。

(含凝聚发光性材料的粒子的制造)

将使作为凝聚性发光材料的六苯基噻咯0.59g溶解于乙酸乙酯31g而成的溶液添加到使苯乙烯磺酸钠0.1g溶解于水150g而成的水溶液中并进行混合，由此制备乳化液。

向上述合成的种粒子的分散液中，按照六苯基噻咯成为种粒子重量的0.43倍的方式加入乳化液，搅拌24小时，得到吸收了六苯基噻咯和乙酸乙酯的种粒子的溶胀粒子液滴的分散液。

将得到的溶胀粒子液滴的分散液边在65℃下以200rpm的速度搅拌24小时边使乙酸乙酯干燥，由此得到含凝聚发光性材料的粒子(种子溶胀法)。

(实施例2)

将六苯基噻咯变更为六苯基苯，除此以外，与实施例1同样地操作而得到含凝聚发光性材料的粒子。

(实施例3)

将六苯基噻咯变更为4-(二对甲苯基氨基)苯甲醛，除此以外，与实施例1同样地操作而得到含凝聚发光性材料的粒子。

(实施例4)

将六苯基噻咯变更为种粒子重量的0.11倍的四苯基乙烯，除此以外，与实施例1同样地操作而得到含凝聚发光性材料的粒子。

(实施例5)

将六苯基噻咯变更为四苯基乙烯，除此以外，与实施例1同样地操作而得到含凝聚发光性材料的粒子。

(实施例6)

将六苯基噻咯变更为种粒子重量的等倍的四苯基乙烯，除此以外，与实施例1同样地操作而得到含凝聚发光性材料的粒子。

(实施例7)

将六苯基噻咯变更为种粒子重量的2.33倍的四苯基乙烯，除此以外，与实施例1同样地操作而得到含凝聚发光性材料的粒子。

(实施例8)

将六苯基噻咯变更为种粒子重量的9倍的四苯基乙烯，除此以外，与实施例1同样地操作而得到含凝聚发光性材料的粒子。

(实施例9)

(种粒子的制造)

向具备搅拌机、回流用冷凝器、温度检测器、氮导入管及夹套的玻璃制反应容器(容量1l)中，添加超纯水400g、苯乙烯单体10g、甲基丙烯酸1g、过硫酸钾0.20g，对容器内进行氮气置换后，边在65℃下以200rpm的速度进行搅拌，边聚合24小时(无皂乳液聚合法)。

聚合结束后，将上述溶液用纸质滤纸进行过滤处理，取出胶乳粒子。然后，用透析膜进行48小时透析处理，得到作为种粒子的纯化了的测定试剂用胶乳粒子。得到的胶乳粒子的平均粒径为0.16μm，粒径的cv值为8.6％。

(含凝聚发光性材料的粒子的制造)

将使作为凝聚性发光材料的四苯基乙烯0.59g溶解于乙酸乙酯31g而成的溶液添加到使苯乙烯磺酸钠0.1g溶解于水150g而成的水溶液中并进行混合，由此制备乳化液。

向上述合成的种粒子的分散液中，按照四苯基乙烯成为种粒子重量的0.11倍的方式加入乳化液，搅拌24小时，得到吸收了四苯基乙烯和乙酸乙酯的种粒子的溶胀粒子液滴的分散液。

将得到的溶胀粒子液滴的分散液边在65℃下以200rpm的速度搅拌24小时，边使乙酸乙酯干燥，由此得到含凝聚发光性材料的粒子(种子溶胀法)。

(实施例10)

将六苯基噻咯变更为1-(4-溴苯基)-1，2，2-三苯基乙烯，除此以外，与实施例1同样地操作而得到含凝聚发光性材料的粒子。

(实施例11)

将六苯基噻咯变更为四(4-羟基苯基)乙烯，除此以外，与实施例1同样地操作而得到含凝聚发光性材料的粒子。

(比较例1)

将六苯基噻咯变更为种粒子重量的0.05倍，除此以外，与实施例4同样地操作而得到含凝聚发光性材料的粒子。

(比较例2)

(种粒子的制造)

向溶解有苯乙烯磺酸钠0.1g的超纯水400g中加入溶解有偶氮异丁腈0.01g的苯乙烯单体10g，用均化器以12000rpm、5分钟的条件进行搅拌，得到乳化液。将得到的乳化液加入到具备搅拌机、回流用冷凝器、温度检测器、氮导入管及夹套的玻璃制反应容器(容量1l)中，边在65℃下以200rpm的速度进行搅拌，边聚合24小时(悬浮聚合)。

聚合结束后，对上述溶液用纸质滤纸进行过滤处理，取出胶乳粒子。然后，用透析膜进行48小时透析处理，得到作为种粒子的纯化了的测定试剂用胶乳粒子。得到的胶乳粒子的平均粒径为0.22μm，粒径的cv值为34.5％。

(含凝聚发光性材料的粒子的制造)

将使作为凝聚性发光材料的四苯基乙烯0.59g溶解于乙酸乙酯31g而成的溶液添加到使苯乙烯磺酸钠0.1g溶解于水150g而成的水溶液并进行混合，由此制备乳化液。

向上述合成的种粒子分散液中，按照四苯基乙烯成为种粒子重量的0.11倍的方式加入乳化液，搅拌24小时，得到吸收了四苯基乙烯和乙酸乙酯的种粒子的溶胀粒子液滴的分散液。

将得到的溶胀粒子液滴的分散液边在65℃下以200rpm的速度搅拌24小时，边使乙酸乙酯干燥，由此得到含凝聚发光性材料的粒子。

[表1]

(1)平均粒径和分散度的测定

使用扫描型电子显微镜(sem)，以在1个视野中可观察到约100个含凝聚性发光材料的粒子的倍率来观察粒子，用卡尺测定随机选择的50个含凝聚发光性材料的粒子的最长径，求出该值的数平均值和变异系数，将其作为平均粒径和分散度。

(2)凝聚发光性材料含有率

使用热解气相色谱(q1000、日本电子公司制)测定含凝聚性发光材料的粒子0.01g中所含的凝聚发光性材料的含量(质量)。

(3)合成高分子含有率

使用热解气相色谱(q1000、日本电子公司制)测定含凝聚性发光材料的粒子0.01g中所含的合成高分子的含量。

(4)辨识性

使用13种按照后述的应用例一栏中的“1.”～“5.”所制作的流感病毒测定用免疫层析试剂，将利用同栏“6.”中记载的检体提取液将a型流感病毒调整为3.8×10⁵～4.8×10⁵tcid50/ml而得的试样作为样品，基于“8.试剂性能评价测定”来评价辨识性。

(5)重现性

将上述辨识性评价重复进行3次。将其结果完全一致者评价为◎，将误差在1以内者评价为○，将误差为2以上者评价为×。

(6)表面观察

使用扫描型电子显微镜(sem)观察含凝聚性发光材料的粒子的表面。从所得到的sem照片中，将实施例10的sem照片示于图1。另外，图2示出对含凝聚性发光材料的粒子照射波长365nm的紫外线(uv)时的凝聚发光的样子。图3示出图2的局部放大图。另外，图4示出对比较例1的凝聚发光性粒子照射波长365nm的紫外线(uv)时的凝聚发光的样子。图5示出图4的局部放大图。

[应用例]

<流感病毒测定用免疫层析法试剂的制作>

1.含凝聚发光性材料的粒子标记的抗a型流感病毒抗体的制备

(1)准备下述(i)至(iv)，加入(i)5ml、(ii)0.2ml及(iii)0.8ml并搅拌后，向其中添加4ml(iv)，在室温下搅拌2小时。

(2)将上述(1)中得到的溶液以13000rpm离心分离10分钟，除去上清后，添加含有10％蔗糖的2％牛血清白蛋白(bsa)水溶液10ml，进一步搅拌2小时后，以13000rpm离心分离10分钟，得到13种缀合物。

(3)对于上述(2)中得到的缀合物，添加含有10％蔗糖的2％bsa水溶液10ml而使缀合物悬浮，得到着色成蓝色的胶乳粒子标记的抗a型流感病毒抗体。

(i)分别包含2％蓝色含凝聚发光性材料的粒子(实施例1～实施例11及比较例1、2共计13种)的20mmmes(ph6.5)缓冲液

(ii)20mmmes(ph6.5)缓冲液

(iii)交联剂1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺(edc)15mg/ml

(iv)含有2.5mg/ml抗a型流感病毒单克隆抗体的20mmmes(ph6.5)缓冲液。在试剂性能评价中，测定缀合物的吸光度时以凝聚发光性材料的最大吸收波长来进行测定。

3.缀合物涂布垫的制作

将上述1.及上述2.中制备的13种缀合物分别按照达到6.4od/ml的方式与含有0.5％酪蛋白及10％蔗糖的tris缓冲液(ph8.5)混合，由此制作缀合物溶液。然后，使用免疫层析法用的分配器“xuz3050”(biodot公司制)使该缀合物溶液以10μl/cm渗入到22.0mm×254mm×0.56mm(宽度×长度×厚度)的玻璃纤维制的垫(lvdall公司制)中。然后，在烘箱内以70℃、30分钟的条件进行加温、干燥，由此制成缀合物涂布垫。需要说明的是，在添加表面活性剂(例如emulgen150(花王公司制)、amiet320(花王公司制))等的情况下，可以在向上述缀合物溶液中添加必要量之后进行同样的操作。

4.抗流感病毒抗体固定化膜的制作

向25.0mm×254mm×0.235mm(短边×长边×厚度)的硝基纤维素膜(sartorius公司制)上，将含有制备为0.75mg/ml的与上述着色为蓝色的胶乳粒子标记的抗a型流感病毒抗体的表位不同的抗a型流感病毒抗体、制备为0.75mg/ml的抗klh抗体、及2.5％蔗糖的10mm磷酸缓冲液(ph7.2)涂布为宽度约1mm的线状。涂布使用免疫层析法用的分配器“xyz3050”(biodot公司制)，将喷出量设为1μl/cm。将涂布线之后的硝基纤维素膜在烘箱内于70℃干燥45分钟，由此制成抗流感病毒抗体固定化膜。

5.测试条的制作

在塑料制粘合片上粘贴上述抗流感病毒抗体固定化膜，并分别配置安装上述3.中制作的13种缀合物涂布垫，在相对侧的端部配置安装吸收垫(whatman公司制、740-e)(参照图6)。最后，按照覆盖抗体固定化膜及吸收垫的方式在上表面配置安装聚酯膜，并进行层压。将如此地重叠各构成要素而得的结构物切割成4mm宽，制作出测试条。该测试条的尺寸为4mm×98mm(宽度×长度)，制成为免疫层析测试条的形态。

6.检体提取液的制备

将含有200mm氯化钾、150mm精氨酸、0.5％brii35、0.25％bsa、及0.05％プロクリン(注册商标)950的50mmtris缓冲液(ph8.5)作为检体提取液。

7.样品的制备

a.鼻腔抽吸检体的情况

向鼻腔抽吸液中浸入1根棉棒，将浸渗了检体的棉棒放入320μl的pbs中而使检体成分溶解于pbs，制成试剂性能评价的样品。此时的a型流感病毒的浓度相当于3.8×10⁵～4.8×10⁵tcid50/ml。

b.鼻腔擦拭检体的情况

用2根棉棒擦拭鼻腔，使棉棒溶解于320μl的pbs，制成试剂性能评价的样品。此时的a型流感病毒的浓度相当于3.8×10⁵～4.8×10⁵tcid50/ml。

8.试剂性能评价测定

在样品中浸渍上述5.中制作的13种测试条，10分钟之后，对a线(检测部c1)、对照线(未图示)照射uv光并测定发光强度。需要说明的是，以5个等级来评价发光强度(辨识性)，按照n＝3进行测定。得到了与表1所示的辨识性同样的成绩。

产业上的可利用性

通过使用本发明的诊断试剂用荧光粒子及使用了该诊断试剂用荧光粒子的免疫测定试剂，从而在作为免疫层析法等免疫测定法的粒子来使用时，目视判定性、检测灵敏度优异，因此有助于疾病的早期诊断、误诊的防止。另外，如果将测定灵敏度设为以往程度，则可以减少所使用的抗体量，在降低成本方面也是有用的。