本发明涉及一种生物细胞分选方法。特别是涉及一种基于偏振衍射成像流式细胞仪的无标记细胞流式分选方法。
背景技术：
生物细胞的分选在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的现实意义，流式细胞分选仪是细胞分选方法重要分支，传统的流式细胞分选仪是传统流式细胞分析仪技术基础上，增加分选装置，依据细胞标记物的不同，将细胞分类收集的仪器。由于传统细胞流式分选仪通常采用细胞所标记的荧光类型作为分类标签，因此属于有标记的细胞分选方法。
偏振衍射成像流式细胞仪是利用流式方法得到单排细胞队列，在相干光照明下，拍摄队列中细胞的双偏振衍射图像，并对衍射图像进行分析的仪器。该分析仪器分析的细胞无需进行荧光标记等操作，因此属于无标记的细胞的分析方法。
衍射图像相较于普通平面图像更为抽象，因此通常采用机器学习的方法研究其分类问题，卷积神经网络(cnn)就是常见方法之一，在细胞衍射图像的分类中得到了很好的应用。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种达到无标记细胞分类收集目的的基于偏振衍射成像流式细胞仪的无标记细胞流式分选方法。
本发明所采用的技术方案是：一种基于偏振衍射成像流式细胞仪的无标记细胞流式分选方法，包括如下步骤：
1)建立卷积神经网络分类模型；
2)依据待选细胞类型对所建立的卷积神经网络分类模型进行训练和检验；
3)调用fpga编程软件生成卷积神经网络分类模型的fpga代码；
4)将所述fpga代码写入实时图像识别单元中的fpga芯片；
5)分选细胞。
步骤1)所述的基于卷积神经网络分类模型包括有：1个输入层、2个以上的卷积层、与卷积层对应的2个以上的池化层、1个全连接层和1个输出层，所述的输入层为细胞衍射图，所述的输出层有3个输出结点，命名为a分选通道、b分选通道和落选通道。
步骤2)包括依据待分选样品的细胞类型从衍射图数据库中挑选出对应细胞衍射图，将衍射图及所对应的细胞类型标签分为两组，一组为训练组，另一组为检验组，通过训练组数据对卷积神经网络分类模型进行训练，得到卷积神经网络的网络参数；然后，将检验组中各细胞的衍射图分别输入卷积神经网络分类模型，则卷积神经网络分类模型分辨出所输入的细胞属于a分选通道或b分选通道或落选通道，统计卷积神经网络分类模型分类的准确度，准确度达到设定值时，表示所述卷积神经网络分类模型训练完成，否则，增加细胞衍射图数量，重新训练。
所述的衍射图数据库存储的是含有细胞类型标签的细胞衍射图。
所述的统计卷积神经网络分类模型分类的准确度，是用分类正确的细胞数与细胞总数的比值。
步骤4)中所述的实时图像识别单元包括有fpga芯片，所述fpga芯片输入是s偏振衍射图和p偏振衍射图，所述fpga芯片的输出端连接用于控制细胞流动方向的分选驱动器，所述fpga芯片还连接存储器，以及通过通信接口连接计算机。
所述的s偏振衍射图和p偏振衍射图，是每一个细胞流经拍摄位置时，在水平方向的相干光照明下，细胞的衍射光被衍射像显微拍摄单元中的偏振分光棱镜分为两个正交的偏振光，从而拍得两幅正交偏振的衍射图像，分别记为s偏振衍射图和p偏振衍射图，这两幅图拍摄完成后送入实时图像识别单元。
步骤5)包括：依据实时图像识别单元选定的细胞所属的通道，驱动分选机构使细胞流入所对应的通道。
本发明的基于偏振衍射成像流式细胞仪的无标记细胞流式分选方法，能够快速获取无标记的细胞衍射图像，实时识别衍射图像对应细胞类型，并由微流控装置适时分选细胞，达到无标记细胞分类收集之目的。本发明具有以下优点：
1、不需要对细胞进行特殊标记，例如荧光染色等，对细胞无伤害，有益于细胞重复利用。
2、使用成本低廉，不需要特殊的化学品耗材，环境友好。
3、适应性广，对细胞的类型无特殊要求，只要能采集衍射图像即可。
4、分选准确率高，衍射图像反应细胞的三维结构信息，信息量更丰富，从而可得到更高的准确率。
附图说明
图1是偏振衍射成像流式细胞仪的结构示意图；
图2是微流控芯片板的结构示意图；
图3a是p偏振衍射图；
图3b是s偏振衍射图；
图4是实时图像识别单元的结构框图；
图5是卷积神经网络分类模型。
图中
101：衍射像显微拍摄单元102：p相机
103：实时图像识别单元104：计算机
105：s相机106：s筒镜
107：分选驱动器108：a分选试管
109：落选试管110：b分选试管
111：相干光113：微流控芯片板
114：样品瓶115：鞘液瓶
116：显微物镜117：窄带滤光片
118：偏振分光棱镜119：p筒镜
201：样品流通道202：鞘液通道
203：锥形口204：检测通道
205：拍摄位置206：待分选细胞单排队列
207：压电陶瓷芯片208：分选位置
209：a分选通道210：落选通道
211：b分选通道1：fpga芯片
2：存储器3：通信接口
4：s衍射图5：p衍射图
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的基于偏振衍射成像流式细胞仪的无标记细胞流式分选方法做出详细说明。
偏振衍射成像流式细胞仪如图1所示，包括有：用于获取细胞衍射图像的衍射像显微拍摄单元101，设置在所述衍射像显微拍摄单元101下端的用于引导细胞以特定的速度在适当的位置流动、以方便光学系统拍摄和分选装置运作的微流控芯片板113，所述衍射像显微拍摄单元101的两个图像采集的输出端通过信号线连接用于衍射图像所对应细胞种类的实时识别的实时图像识别单元103，所述实时图像识别单元103还分别连接计算机104以及用于驱动微流控芯片板113中分选执行机构的分选驱动器107的信号输入端。所述计算机104内含配套控制软件系统，用于细胞衍射图数据库管理、实时图像识别单元中识别算法生成和人机交互，其中细胞衍射图数据库存储的是细胞衍射图及其对应的细胞类型标签。所述分选驱动器107的信号输出端分别连接微流控芯片板113的用于驱动细胞流动方向的压电陶瓷芯片。所述微流控芯片板113的细胞流出端分别连接a分选试管108、落选试管109和b分选试管110。所述微流控芯片板113的输入端分别连接样品瓶114和鞘液瓶115。所述微流控芯片板113的中部设置有用于拍摄视场内细胞照明的相干光111。
所述的衍射像显微拍摄单元101包括有由下至上沿光路依次设置的显微物镜116、窄带滤光片117、偏振分光棱镜118、p筒镜119和p相机102，依次设置在所述偏振分光棱镜118所分出的另一光线上的s筒镜106和s相机105。其中，所述的p相机102和s相机105的输出端分别连接所述实时图像识别单元103。
如图2所示，所述的微流控芯片板113包括有一体形成的锥形口203、检测通道204、a分选通道209、b分选通道211和落选通道210，其中，所述的检测通道204与所述的a分选通道209、b分选通道211和落选通道210连接处设置有分选位置208，对应所述分选位置208设置有用于驱动细胞流动方向的压电陶瓷芯片207，所述的锥形口203内形成有样品流通道201和鞘液通道202，所述的检测通道204内有待分选细胞单排队列206，并且在检测通道204处设置拍摄位置205。
本发明的基于偏振衍射成像流式细胞仪的无标记细胞流式分选方法，包括如下步骤：
1)建立卷积神经网络分类模型；
如图5所示，所述的基于卷积神经网络分类模型包括有：1个输入层、2个以上的卷积层、与卷积层对应的2个以上的池化层、1个全连接层和1个输出层，所述的输入层为细胞衍射图，所述的输出层有3个输出结点，命名为a分选通道、b分选通道和落选通道。
2)依据待选细胞类型对所建立的卷积神经网络分类模型进行训练和检验；包括：
依据待分选样品的细胞类型从衍射图数据库中挑选出对应细胞衍射图，所述的衍射图数据库存储的是含有细胞类型标签的细胞衍射图。将挑选出的衍射图及所对应的细胞类型标签分为两组，一组为训练组，另一组为检验组，通过训练组数据对卷积神经网络分类模型进行训练，得到卷积神经网络的网络参数；然后，将检验组中各细胞的衍射图分别输入卷积神经网络分类模型，则卷积神经网络分类模型分辨出所输入的细胞属于a分选通道或b分选通道或落选通道，统计卷积神经网络分类模型分类的准确度，所述的统计卷积神经网络分类模型分类的准确度，是用分类正确的细胞数与细胞总数的比值。准确度达到设定值时，表示所述卷积神经网络分类模型训练完成，否则，增加细胞衍射图数量，重新训练。
例如：待分选的细胞样品中含有c1,c2,c3,c4四种细胞均存在于衍射图数据库中，用户预分选出c1和c2，则可指定c1进入a分选通道209，c2进入b分选通道211，c3和c4进入落选通道210。将挑选出的c1～c4细胞各1000个，每个细胞含有一张p偏振衍射图和一张s偏振衍射图，共有4000对衍射图，分为训练组3600对，检验组400对，利用google的tensorflow软件对卷积神经网络(cnn)分类器进行训练，得到cnn网络参数。通用的cnn分类器的输入要求是单张图像，因此将每一个细胞的p偏振衍射图和s偏振衍射图上下连接在一起的复合图像作为输入，输出是c1～c4分入的分选通道。用检验组数据对训练好的cnn分类器进行检验，假如分类结果中有90个c1细胞分入a分选通道，92个c2细胞分入b分选通道，92个c3细胞分入落选通道，94个c4分入落选通道，则正确率为(90+92+92+94)/400＝92％。假如设定的分类准确率是90％，则所训练的分类器模型可用。
3)调用fpga编程软件生成卷积神经网络分类模型的fpga代码；
fpga芯片厂商一般提供编程软件，例如xilinx公司提供的ise开发软件，用户可以依据步骤2)中生成的cnn网络参数，用verilog语言编辑相应的实现程序，经ise编译后生成fpga代码。
4)将所述fpga代码写入实时图像识别单元中的fpga芯片；
如图4所示，所述的实时图像识别单元包括有fpga芯片1，所述fpga芯片1输入是s偏振衍射图4和p偏振衍射图5，所述fpga芯片1的输出端连接用于控制细胞流动方向的分选驱动器107，所述fpga芯片1还连接存储器2，以及通过通信接口3连接计算机104。
所述的s偏振衍射图4和p偏振衍射图5，是每一个细胞流经拍摄位置时，在水平方向的相干光照明下，细胞的衍射光被衍射像显微拍摄单元中的偏振分光棱镜分为两个正交的偏振光，从而拍得两幅正交偏振的衍射图像，分别记为s偏振衍射图和p偏振衍射图，这两幅图拍摄完成后送入实时图像识别单元。
在xilinx的ise软件中集成了fpga芯片的编程软件，可以自动识别出fpga芯片的型号，通过下载器将步骤3)中生成的fpga代码写入实时图像识别单元的fpga芯片。
5)分选细胞。包括：
依据实时图像识别单元选定的细胞所属的通道，驱动分选机构使细胞流入所对应的通道。结合图1和图2具体有如下过程：
(1)进样
用户将含有c1～c4细胞的悬浮液置于样品瓶114中，鞘液瓶115中鞘液和样品瓶114中的样品在气压驱动下进入水平放置的微流控芯片板113的鞘液通道202和样品流通道201，之后经锥形口203进入检测通道204。形成待分选细胞单排队列206沿水平y方向行进。
(2)拍摄衍射图
当细胞通过拍摄位置205时，与水平z方向传播的相干光111(通常采用532nm单模激光)相遇，由此产生的以x轴为中心，显微物镜116孔径角范围内的散射光被显微物镜116收集，经窄带滤光片117(532nm中心波长，10nm带宽)滤除其他波长杂光，之后经偏振分光棱镜118分为p和s两束正交偏振光，p偏振光经p筒镜119到达p相机102形成p偏振衍射图，s偏振光经s筒镜106到达s相机105形成s偏振衍射图，如图3a和图3b所示。
(3)实时识别细胞衍射图对应分选通道
衍射图拍摄完成后将被输送到实时图像识别单元103，实时图像识别单元103中由fpga芯片实现的卷积神经网络分类器依据该衍射图像判别出细胞对应的分选通道。
(4)驱动分选机构分选细胞
当细胞行进到分选位置208，实时图像识别单元103中的fpga芯片发送的分选通道标识信号到达分选驱动器107，分选驱动器107依据分选通道标识信号输出适当的电压驱动由压电陶瓷芯片207组成的分选机构动作，细胞在微动片的冲击下偏移到a分选通道209或b分选通道211，当压电陶瓷芯片无动作时，细胞进入落选通道210。以上过程就实现了分选特定种类细胞的目的。