本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种脊髓灰质炎病毒ⅱ型d抗原预包被检测方法及其检测试剂盒和应用。
背景技术：
脊髓灰质炎病毒(poliovirus)属于小核糖核酸病毒科、肠道病毒属，分3个血清型，其主要侵犯脊髓前角灰质区运动神经元，临床特征为弛缓性肌肉麻痹，多发生在5岁以下儿童，尤其是婴幼儿，故亦称小儿麻痹症，是who继天花之后要消灭的第二种传染病的主要病原体。脊髓灰质炎病毒感染后没有特效的治疗手段，只能通过疫苗进行预防，目前用于预防控制脊灰流行的疫苗有两种：脊髓灰质炎减毒活疫苗(opv)和灭活脊髓灰质炎疫苗(ipv)，opv因易于接种，成本相对较低而一度被广泛使用，但在长期使用过程中发现，其可能引起脊灰疫苗相关麻痹(vapp)病例和疫苗衍生株脊灰病毒vdpv)，ipv则能有效避免vapp和vdpv的发生。因此，彻底消灭脊灰病毒最终需要用ipv全部取代opv进行预防控制。
脊髓灰质炎病毒共有3个血清型，分别为polioⅰ型、polioⅱ型和polioⅲ型，3个型别的病毒颗粒均有2种形式，分别为具有感染性的完整病毒颗粒形式的d抗原和不具有感染性的空心颗粒c抗原。c抗原通过d抗原感染细胞过程、加热、紫外线照射、碱变性、毒力降解而产生，其vp4消失而无感染性。d抗原具有免疫原性，可诱导机体产生保护性中和抗体，从而预防脊髓灰质炎的发生，而c抗原虽有组特异性，但免疫血清尚不能中和病毒，由于d抗原含量与灭活脊髓灰质炎疫苗（ipv)接种后机体产生免疫效力之间具有较好的一致性，因此，d抗原作为ipv疫苗的主要成分抗原，其含量是ipv疫苗体外效力的关键指标，对ipv疫苗生产质控具有重要意义。
d抗原检测在ipv疫苗生产、质量控制过程中时常用到，单价原液检测、半成品配制、三价半成品检测、成品检定都有涉及脊灰病毒d抗原检测的项目，由于d抗原含量是ipv疫苗质量的一个重要标准，直接影响疫苗的保护效果，因此d抗原检测方法的优劣和便捷在一定程度上可以直接影响到疫苗的生产进程和质量标准。
由于脊灰病毒抗体用于实验后发现其包被微孔板稳定性差，不能制备成预包被板成品，只能使用前包被，包被完毕需及时进行检测，否则检测结果会出现较大差异，因此目前市场上并没有商售的脊灰病毒d抗原检测试剂盒。现有的d抗原检测方法（试剂）无法批量制备，每次使用前包被导致检测周期长，至少3天才能完成一个检测，周期过长，影响疫苗检定的时效，并且对检测人员的操作技能要求高，换操作人员即有可能导致人员操作偏差出现，不利于疫苗质量的稳定性。基于市场的需求和疫苗生产检定的要求，申请人研发了一种可用于ⅱ型ipv病毒d抗原定性或定量快速检测的方法，可以进行预包被，批量生产，全部检测时间从3天缩短为3.5小时，有效提高了疫苗的检定工作效率和检测结果的稳定性。
技术实现要素：
基于上述现有技术存在的缺陷和不足，本发明旨在提供一种脊髓灰质炎病毒（poliovirus）ⅱ型d抗原检测方法，该方法可以对脊髓灰质炎病毒ⅱ型d抗原进行高特异性的精准定性和定量检测。本发明还提供了一种预包被的可以进行批量生产的脊髓灰质炎病毒（poliovirus）ⅱ型d抗原检测试剂盒。
一方面，本发明提供的一种脊髓灰质炎病毒ⅱ型d抗原快速定性、定量检测方法，用于非临床疾病诊断治疗和非健康状况判断用途，其特征在于，包括以下步骤：
s1、对动物抗ⅱ型脊髓灰质炎病毒抗体进行制备并纯化，得动物抗ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原的纯化抗体；
s2、用辣根过氧化物酶通过高碘酸钠法对动物抗ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原的纯化抗体进行标记，得动物抗ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原的检测用酶标抗体，制成酶标抗体使用液；
s3、以动物抗ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原的纯化抗体进行酶标检测板的预包被处理，预包被处理中加入保护剂进行封闭保护；所述保护剂包括但不限于以下成分：bsa、明胶、酪蛋白、白蛋白、海藻糖、磷酸盐、碳酸盐中的一种或多种，制得预包被载体；，所得预包被载体能批量制作且能满足检测条件指标下实现长期存放；
s4、采用预包被载体捕获待检抗原形成抗原抗体复合物，再与酶标记抗体使用液结合，通过底物催化酶显色，根据显色结果完成对脊髓灰质炎病毒ⅱ型d抗原的定性检测或定量检测。
进一步的，步骤s3中所述保护剂为：每1000ml保护剂包含7~13gbsa，7~13海藻糖、3~7g明胶，1~2g酪蛋白，30~70mmol磷酸盐溶液；所述预包被载体使用抽真空包装后存放。
进一步地，纯化抗体的制备步骤包括：
1）ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原抗血清制备：将灭活脊髓灰质炎病毒通过10-30%蔗糖密度梯度离心，收集d抗原层，经电镜检测确认后用于免疫血清制备；试验动物牛、兔或羊，首免，ⅱ型单价灭活病毒d抗原与福氏佐剂等量混匀，皮下注射免疫，进行3次加强免疫后采血，分离血清，采用微量中和试验进行血清中和抗体滴度测定；
2）牛、兔或羊抗ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原纯化抗体制备：取蛋白a/g亲和层析柱，室温放置平衡30分钟，用5倍柱体积的平衡液对层析柱进行平衡；将抗血清与平衡液等体积比混合后上样，用10倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白，保留目的蛋白；用10倍柱体积的常规洗脱液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来，收集洗脱峰，脱盐后备用；用lowrry法测定蛋白含量，得牛、兔或羊抗ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原纯化抗体，-20℃以下保存待用。
进一步地，所述s2步骤包括：将辣根过氧化物酶用注射用水溶解后，加入naio4，静置，加入乙二醇溶液，静置，再与步骤s1所得纯化抗体混合，透析过夜；加硼氢化钠，静置，加饱和硫酸铵，离心；取沉淀溶解后透析过夜；得到牛、兔、羊抗ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原检测用酶标纯化抗体，低温保存备用。
进一步地，所述s3步骤包括：
1）酶标检测板包被：将纯化好的牛、兔或羊抗ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原的纯化抗体通过棋盘试验确认包被条件，按条件稀释抗体至0.1-15µg/ml后，50-150µl/孔加至酶标专用检测板中，2～8℃过夜，洗板；
2）酶标检测板封闭：以100-250µl/孔的量加入保护剂，2～8℃过夜，洗板，晾干，真空包装后冰箱保存备用，所述保护剂包括但不限于以下成分：bsa、明胶、酪蛋白、白蛋白、海藻糖、磷酸盐、碳酸盐中的一种或多种。
进一步地，所述s4中定性或定量检测包括以下步骤：
1）将待检样品稀释后加入预包板的检测孔中，同步加入ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原参考品，定量样品及含量参考品复孔加样，50-150µl；定性检测样品50-150µl/孔原倍加入，设空白孔1孔，及抗原阴性对照各2孔；37℃孵育1-3小时，洗板3-5次；
2）在1）已洗好的酶标检测板中50-150µl/孔加入酶标抗体使用液，空白孔不加，37℃孵育0.5-3小时，洗板3-5次；
3）在2）已洗好的酶标检测板中加入tmb显色液，混匀，放入湿盒中，37℃孵育7-10分钟；
4）使用终止液终止反应；
5）在检测450nm波长，630校正波长下，用空白孔调零后检测吸光度a值，根据阴阳性对照计算cutoff值，根据cutoff值即可得定性结果或根据抗原含量参考品计算得定量的检测结果。
另一方面，本发明还提供了一种脊髓灰质炎病毒ⅱ型d抗原快速定性、定量检测方法在ipv疫苗开发及其质量检定中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种脊髓灰质炎病毒ⅱ型d抗原快速定性、定量检测方法在制备脊髓灰质炎病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种脊髓灰质炎病毒ⅱ型d抗原快速定性、定量检测用的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂组分：脊髓灰质炎病毒ⅱ型d抗原检测板，酶标记抗体使用液，tmb显色液a、显色液b，浓缩洗液，脊髓灰质炎病毒ⅱ型d抗原阳性对照，脊髓灰质炎病毒ⅱ型d抗原阴性对照，脊髓灰质炎病毒ⅱ型d抗原含量参考品。
进一步地，所述脊髓灰质炎病毒ⅱ型d抗原检测板的制备方法为：
1）将纯化好的牛、兔或羊抗ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原的纯化抗体通过棋盘试验确认包被条件，按条件稀释抗体至0.1-15µg/ml后，50-150µl/孔加至酶标专用检测板中，2～8℃过夜，洗板；
2）酶标检测板封闭：以100-250µl/孔的量加入保护剂，2～8℃过夜，洗板，晾干，真空包装后冰箱保存备用，所述保护剂包括：5%bsa、5%明胶，3%酪蛋白、3%白蛋白、15%海藻糖、20%~30%磷酸盐或碳酸盐。
与现有技术相比本发明具有下列优点和效果：
（1）采用预包被牛（兔、羊）抗ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原纯化抗体，以辣根过氧化物酶标记牛（兔、羊）抗ⅱ型髓灰质炎病毒d抗原纯化抗体作放大系统，能高特异性地检测ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原，提高检测灵敏度和特异性。
（2）采用密度梯度离心分离获得的ⅱ型脊髓灰质炎病毒颗粒（d抗原，不含有c抗原成分），既有特异性高、灵敏度好、能批量制备、减少检测及操作误差、检测时间短的优点。免疫用抗原中去除了c抗原成分，获得的抗血清特异性更好，由此制备的检测板特异性更高。
（3）本发明解决了细胞培养病变法不能检测灭活病毒的难题，为相关疫苗的研究开发和疫苗质量检定工作提供有力的技术保障。
（4）本发明采用保护剂对包被抗体进行预包被保护，免疫动物获得的抗体包被并经保护剂保护，将原本传统检测过程需要持续不可断的状态形成了可终断分割步骤的方式，实现了可以长期保存的预包被检测板，可间断的检测方式减少免疫检测中的制备准备步骤，直接使用制备好的预包被板从而缩短检测时间，将一般检测时间从3天缩短为3-4小时，解决了脊灰病毒抗体包被后不能长期保存的问题，使检测试剂可以批量制备、存放的同时提高了检测效率。（5）本发明制备的预包被板稳定性好，检测结果满足elisa实验需求，在-20℃长期保持也有良好的稳定性，最长保存时间18个月，检测灵敏度、线性（r2）、精密性(cv)满足疫苗检测及elisa检测试剂的要求。实现制备、检测可分割的检测方法，其另一个突出效果是能对检测试剂进行阶段质控，便于实际制备、检测过程中对于差错的纠察和控制，方便操作并减少人员误差，不仅在制备、检测中提高了效率，还保证了检测结果的重复性和疫苗质量的稳定性，达到对制备质量、检测质量的双重可控性和保障性。即本发明的预包板检测试剂可以进行批量生产并可以长期保存，在实际使用中能有效减少ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原检测中的实验试剂及操作误差，有利于提高工作效率。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原抗血清制备
将灭活脊髓灰质炎病毒通过10-30%蔗糖密度梯度40000rpm离心4-8小时，收集d抗原层，经电镜检测确认为d抗原后用于免疫血清制备；试验动物（牛、兔、羊均可），首免，ⅱ型单价灭活病毒d抗原10-20ml与福氏完全佐剂等量混匀，皮下注射免疫，然后进行3次加强免疫后采血，分离血清，采用微量中和试验进行血清中和抗体滴度测定。
实施例2牛（兔、羊）抗ⅱ型脊髓灰质炎病毒纯化抗体（简称抗ⅱ型ipv-igg）的制备
1、取蛋白a/g亲和层析柱，室温放置平衡30分钟，用5倍柱体积的平衡液对层析柱进行平衡；2、将抗血清与平衡液等体积比混合后上样，用10倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白，留下目的蛋白；3、用10倍柱体积的常规洗脱液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来，收集洗脱峰，脱盐后备用；4、用lowrry法测定蛋白含量，得牛（兔、羊）抗ⅱ型ipv-igg，-20℃以下保存待用；所述洗液、平衡液均为现有技术的常规用液。
实施例3酶标记抗体制备
将辣根过氧化物酶10mg用注射用水溶解1ml后，加入0.2mlnaio4，静置0.1-1小时，加入0.5ml乙二醇溶液，静置0.1-1小时，再与步骤二所得纯化抗体1ml混合，透析过夜；加0.5ml硼氢化钠，静置0.1-1小时，加饱和硫酸铵，15000rpm离心30-60分钟；取沉淀溶解后透析过夜；得到牛（兔、羊）抗ⅱ型ipv-igg-hrp，低温保存备用。
实施例4预包被酶标板的制备
1）酶标板包被：将牛（兔、羊）抗ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原纯化抗体稀释至0.1-15µg/ml，按50～150µl/孔的量加入到酶标板中，2～8℃过夜，洗板3～5次；
2）酶标板封闭：按100～250µl/孔的量加入保护剂封闭，2～8℃过夜，对酶标板进行封闭保护,洗板3～5次，晾干，抽真空包装后冰箱保存备用，所述保护剂按每1000ml保护剂包含7~13gbsa，7~13海藻糖、3~7g明胶，1~2g酪蛋白，30~70mmol磷酸盐溶液制成；或保护剂按包括：5%bsa、5%明胶，3%酪蛋白、3%白蛋白、15%海藻糖、20%~30%磷酸盐或碳酸盐制成。
实施例5ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原检测
1、将待检的ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原样品及其他样品系列稀释后加入预包板检测孔中，定量样品及含量参考品复孔加样；定性检测样品原倍直接加入50-150µl/孔，同步加入ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原参考品及抗原阴性对照，设空白孔1孔，37℃孵育0.5-3小时，洗板5次；
2、在步骤1已洗好的酶标检测板中加入酶标抗体使用液，50-150µl/孔，空白孔不加，37℃孵育0.5-3小时，洗板5次；
3、在步骤2已洗好的酶标检测板中加入tmb显色液100µl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃孵育5-15分钟；
4、终止液终止反应；
5、在检测450nm波长，630校正波长下，用空白孔调零后检测吸光度a值，即得检测结果；
6、结果判定：
1）cutoff值=阴性对照平均值×2.1，（阴性对照的平均a值小于等于0.05，按实际值计算）。
2）按照样品a值≥cutoff值，该样品判定为ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原阳性样品，样品a值＜cutoff值，为阴性，该样品判定为ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原阴性样品。
3）将系列稀释的定量检测样品a值与抗原含量参考品a值带入对应的公式进行计算，即可获得待检样品的含量。
以上实验中的待检样品包含ⅰ、ⅱ、ⅲ型脊髓灰质炎病毒d抗原，c抗原及其他肠道病毒，ⅱ型髓灰质炎病毒d抗原含量参考品，精密性参考品等，并对本实施例做精密性、线性、灵敏度、重复性性能指标检测，结果如表1所示，
表1ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原预包被快速检测法性能指标
从检测试剂的性能指标看，本发明的平均精密性、灵敏度及线性均满足elisa检测试剂要求，可以用于疫苗检测。检测方法灵敏度分析，用本发明对ⅱ型ipv-d抗原含量参考品进行检测，检测下限均能测到0.125du/ml。检测方法精密性分析，本发明试验cv为5.4%小于15%，满足elisa试验要求。
对本实施例的检测方法做特异性实验，结果如表2所示,用本发明检测方法进行对各型脊髓灰质炎病毒d、c抗原和其他肠道病毒进行交叉试验，特异性显示无交叉情况出现。
表2ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原预包被快速检测试剂特异性试验
实施例6ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原预包被板相关性能检测
步骤1.按实施例3中的方法制备预包被板；其中：保护剂按每1000ml封闭液含10gbsa，10g海藻糖、5g明胶，1g酪蛋白，50mmol磷酸盐溶液制成；
步骤2.将预包被板分别存放于37℃作3、5、8天加速破坏实验；结果见表3；
步骤3.预包被板存于4℃及-20℃以下做6、9、12、18个月的长期稳定性试验；结果见表4；
步骤4.稳定性试验的预包被板在不同温度放置到期后带入精密性参考品，含量参考品按照标准检测程序进行检测。
表3ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原预包被板快速检测试剂37℃稳定性试验结果
表4ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原预包被板快速检测试剂-20℃稳定性试验结果
本发明制备的预包被板在37℃加速破坏实验条件下有较好的稳定性，检测结果满足elisa实验需求，在-20℃长期保持也有良好的稳定性，最长保存时间18个月（表3、4），检测灵敏度、线性（r2）、精密性(cv)满足疫苗检测及elisa检测试剂的要求。用3批预包被的检测试剂对7个样品进行检测（对比实施例，表5），样品含量检测结果波动在95%可信限范围，符合elisa检测试剂要求，本发明的预包板检测试剂可以进行批量生产并可以长期保存，在实际使用中能有效减少ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原检测中的实验试剂及操作误差，有利于提高工作效率。
对比实施例
使用常规ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原检测法与本发明同步检测样品，并对检测结果进行比对，方法如下，牛（兔、羊）抗ⅱ型ipv纯化抗体包板，吸附过夜；洗板，加封闭液孵育1小时，洗板后加待检样品，吸附过夜；洗板，加二抗，2.5小时；洗板，加酶标抗体，孵育1.5小时；洗板，加tmb-显色液显色，450nm检测结果；将样品a值与抗原参考品a值带入对应的公式进行计算，即可获得待检样品的含量。对比结果如表5所示：
表5ⅱ型脊髓灰质炎病毒d抗原预包被快速检测法与常规检测法检测结果对比
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本实施例所用溶液如下：
1.洗液：磷酸氢二钠2.1g，磷酸二氢钠0.2g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，吐温0.5ml，注射用水1000ml。
2.包被液：无水碳酸钠1.2g，碳酸氢钠2.3g，注射用水1000ml。
3.终止液：浓硫酸54ml，注射用水445ml。
4.tmb显色液a：tmb50mg，二甲基亚砜50ml，加注射用水50ml。
5.tmb显色液b：醋酸钠4.55g，冰醋酸0.15ml，双氧水，2.5ml，加注射用水至500ml。
6.封闭液：1000ml封闭液含10gbsa，10g海藻糖、5g明胶，1g酪蛋白，50mmol磷酸盐溶液。