本发明属于疫苗检测领域，具体的，涉及一种肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定方法。
背景技术：
：：肺炎链球菌是细菌性大叶性肺炎、脑膜炎、支气管炎的主要病原菌，5％～10％正常人上呼吸道中携带该类病菌。该类病菌易感染的人群为抵抗力较差的婴儿和老年人，全球每年约有80～100万5岁以下儿童死于由肺炎链球菌诱发的各种疾病。同时肺炎球菌诱发的细菌性肺炎也是导致60岁以上老年人死亡的一大原因。由于肺炎链球菌最主要的毒力因子荚膜多糖是非t细胞依赖型抗原，而新生儿免疫系统尚未发育完全，因此目前上市的23价多糖疫苗，无法在2岁以下新生儿起预防作用。多糖结合疫苗是一种载体蛋白与肺炎多糖以化学方法结合，从而使多糖由t细胞非依赖性抗原转变为t细胞依赖性抗原的疫苗。2岁以下新生儿接种结合疫苗后可以产生有效的免疫应答，达到预防肺炎球菌的目的。多糖结合疫苗中的游离多糖含量越高，其免疫效果越差，因此多糖结合疫苗中对游离多糖含量测定是多糖结合疫苗质量控制中的关键指标之一，游离多糖含量高低较大程度的决定了疫苗质量的优劣。cn1963500b公开了一种肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，采用蒽酮-硫酸法进行测定。但是检测过程中所用超滤杯造价较高且使用寿命有限，测试成本较高。cn101140276a公开了一种肺炎结合疫苗原液中结合物含量的测定方法，方法为取待测的肺炎结合疫苗原液作为样品，然后加入脱氧胆酸钠溶液，混匀冰浴30分钟后，将冰浴样品加入盐酸水溶液，再进行离心处理，计算出结合疫苗中结合物的含量。但此申请中没有采用标准品溶液，导致测定不够准确。《肺炎链球菌血清型7f荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定》公开了一种荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定方法。但是该文献方法中，脱氧胆酸钠的添加对蒽酮法检测的结果有一定的干扰。因此，本领域亟需一种廉价、高效、准确的测定肺炎结合疫苗中游离多糖含量的方法。技术实现要素：：有鉴于此，提出本发明。本发明的目的是提供一种检测肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定方法，所述方案包括以下步骤：(1)取肺炎链球菌荚膜多糖为样1，取肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物为样2；(2)制备肺炎链球菌荚膜多糖组合糖标准品溶液；(3)制备标准品梯度溶液；(4)分别向肺炎链球菌荚膜多糖和肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物加入脱氧胆酸钠(nadoc)溶液，并调节ph至2-6，离心收集上清液；(5)向肺炎链球菌荚膜多糖上清液中加入显色试剂，进行显色反应，即为样3；向肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物上清液中加入显色试剂，进行显色反应，即为样4；(6)向标准品梯度溶液、空白比色管中分别加入显色试剂，进行显色反应；(7)使用紫外分光光度计，以步骤(6)处理后的空白显色试剂为参比池，分别测定处理后的标准品梯度溶液、样1、样2、样3、样4的吸光度；(8)计算游离多糖含量。优选的，步骤(2)中，根据肺炎链球菌荚膜多糖结合物不同糖型区别，制备肺炎链球菌荚膜多糖组合糖标准品溶液，所述肺炎链球菌多糖标准品溶液中所含各单糖种类和摩尔比与相应多糖结合物中一致。更优选的，分别按一定比例精密称取适量的半乳糖、葡萄糖、甲基戊糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸和氨基己糖，纯化水溶解后定容，获得肺炎链球菌荚膜多糖组合糖标准品溶液。优选的，步骤(3)中取标准品溶液，于比色管中制备成10％，20％，40％，60％，80％，100％的标准品溶液，每管分别用超纯水补足，即标准品梯度溶液。优选的，步骤(4)中，取肺炎链球菌荚膜多糖1.5体积份，置于2-3体积份的离心管中，取肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物1.5体积份，置于另一2-3体积份的离心管中，向每离心管加入0.5-2％nadoc溶液0.1-0.15体积份，振荡混匀，向每离心管滴加0.1-0.5mhcl溶液至体系ph＝4-5，常温5000-10000g离心5-60min，分别将上清液和沉淀分离，收集上清液。更优选的，步骤(4)中，取肺炎链球菌荚膜多糖1.5体积份，置于2.5体积份的离心管中，取肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物1.5体积份，置于另一2.5体积份的离心管中，向每离心管加入1％nadoc溶液0.125体积份，振荡混匀，向每离心管滴加0.2mhcl溶液至体系ph＝4.3-4.7。常温9000g离心30min，分别将上清液和沉淀分离，收集上清液。优选的，步骤(4)中，加入nadoc溶液后，在加入0.125体积份1-5mol/l的nacl溶液。加入高浓度的nacl溶液，以增强蛋白质的沉淀效果，是游离多糖的检测结果更加准确。优选的，步骤(5)、步骤(6)中，显色反应均在沸水浴中进行；反应时间为5-35min，优选为20min；沸水浴完毕后还包括在水浴中静置的步骤；所述静置步骤中，静置的时间为5-15min，优选为10min。所述沸水浴的温度为90-110℃，所述水浴的温度为0-80℃，优选为40℃。优选的，步骤(7)中，利用紫外分光光度计测定吸光度时，吸光度的测量波长为400nm-700nm，优选为620nm。优选的，步骤(7)中，待测样品为肺炎1型多糖结合物时，吸光度的测量波长为530nm。优选的，所述肺炎球菌多糖结合物中多糖糖型为1型时，可选用四硼酸钠硫酸溶液和咔唑的乙醇溶液作为显色试剂；所述肺炎球菌多糖为肺炎球菌2型、3型、4型、5型、6a型、6b型、7f型、9v型、14型、18c型、19a型、19f型、23f型时，选用蒽酮硫酸溶液作为显色试剂进行显色反应。优选的，步骤(8)中，计算游离多糖含量的方法包括如下步骤：以标准品梯度溶液溶度为横坐标，以处理后的标准品梯度溶液吸光度为纵坐标，做标准品溶液浓度与吸光度的标准曲线，并计算线性回归方程；将样1、样2、样3、样4的吸光度代入线性回归方程，计算出样品处理前后的多糖浓度，分别为a1、a2、a3、a4；根据公式计算回收率p及游离多糖含量h：回收率90-120％；根据公式计算游离多糖含量h。优选的，所述四硼酸钠硫酸溶液由四硼酸钠和浓硫酸组成；所述四硼酸钠与浓硫酸的用量比(m：v)为5-15:1000，优选为9.55：1000；所述咔唑的乙醇溶液中，咔唑和无水乙醇的用量比(m：v)为0.05-0.15:100，优选为0.125：100。优选的，所述蒽酮硫酸溶液中，硫酸的浓度为50％-90％，优选为75％；蒽酮硫酸溶液的浓度为0.05g/100ml-0.2g/100ml，优选为0.1g/100ml。本发明中所述的检测方法，通过对样品处理步骤的改进，使得在脱氧胆酸钠含量较高的情况下，也不会对实验结果产生干扰，达到对蛋白更好的沉淀效果。同时，申请人发现，由于脱氧胆酸钠含量的提高，在处理样品时，常温处理也不会对检测结果产生影响，不必要在低温中进行处理或离心，降低了检测成本，提高了检测效率。此外，申请人还发现，由于蛋白沉淀效率的提高，使得对游离多糖的检测限降低，这样可以减少样品的加入量，以节约检测成本。进一步地，在样品处理时加入高浓度的氯化钠，可以进一步提高蛋白的沉淀效率，使检测限进一步降低。本发明的有益效果：(1)本发明克服了现有技术的缺点与不足，开发了一种分析成本低、操作简单的定量检测肺炎多糖结合物中游离多糖方法；(2)本发明以廉价的单糖为原料，按照标准多糖中各单糖摩尔比混合配制成多糖标准品，建立标准曲线检测肺炎游离多糖浓度，该方法避免了现有方法中需使用成本较高的超滤杯，大幅降低了分析成本，同时也保证了很好的检测效果。附图说明：为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为pn1型组合糖标准曲线；图2为pn1型组合糖标准曲线；图3为pn1型肺炎球菌多糖标准糖浓度与吸光度值之间的线性关系。具体实施方式这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置和方法的例子。在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。应当理解，尽管在本发明可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本发明范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境，如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在……时”或“当……时”或“响应于确定”。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。实验例1对本发明所述的检测方法进行重复性实验验证，待测样品选取肺炎球菌1型，具体实验步骤如下：(1)取肺炎链球菌荚膜多糖1型为样1，取肺炎链球菌荚膜多糖1型对应的结合物为样2(取3种不同浓度的游离多糖样品各进行3次平行检测，标记为样a1，样a2，样a3，样b1，样b2，样b3，样c1，样c2，样c3)；(2)根据肺炎链球菌荚膜多糖1型结合物不同糖型区别，制备肺炎链球菌荚膜多糖组合糖标准品溶液；(3)制备标准品梯度溶液，于比色管中制备成5％，10％，20％，40％，60％，80％，100％的标准品溶液，每管分别用超纯水补足；(4)取肺炎链球菌荚膜多糖1.5体积份，置于2.5体积份的离心管中，取肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物1.5体积份，置于另一2.5体积份的离心管中，向每离心管加入1％nadoc溶液0.125体积份，振荡混匀，向每离心管滴加0.2mhcl溶液至体系ph＝4.5，纯化水补足至2.5体积份。常温9000g离心30min，分别将上清液和沉淀分离，收集上清液；(5)向肺炎链球菌荚膜多糖上清液中加入显色试剂，进行显色反应，即为样3；向肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物上清液中加入显色试剂，进行显色反应，即为样4；显色试剂选用四硼酸钠硫酸溶液和咔唑的乙醇溶液，所述四硼酸钠硫酸溶液由四硼酸钠和浓硫酸组成；所述四硼酸钠与浓硫酸的用量比(m：v)为9.55：1000；所述咔唑的乙醇溶液中，咔唑和无水乙醇的用量比(m：v)为0.125：100；(6)向标准品梯度溶液、空白比色管中分别加入显色试剂，进行显色反应；显色试剂选用四硼酸钠硫酸溶液和咔唑的乙醇溶液，所述四硼酸钠硫酸溶液由四硼酸钠和浓硫酸组成；所述四硼酸钠与浓硫酸的用量比(m：v)为9.55：1000；所述咔唑的乙醇溶液中，咔唑和无水乙醇的用量比(m：v)为0.125：100；(7)使用紫外分光光度计，以步骤(6)处理后的空白显色试剂为参比池，在530nm下分别测定处理后的标准品梯度溶液、样1、样2、样3、样4的吸光度；(8)以标准品梯度溶液溶度为横坐标，以处理后的标准品梯度溶液吸光度为纵坐标，做标准品溶液浓度与吸光度的标准曲线，并计算线性回归方程；将样1、样2、样3、样4的吸光度代入线性回归方程，计算出样品处理前后的多糖浓度，分别为a1、a2、a3、a4；根据公式计算回收率p及游离多糖含量h，其中，根据公式计算游离多糖含量h。检测结果如表1所示。表1以pn1型组合糖作为标准品测定标准曲线如下：浓度(μg/ml)abs(吸光度)6.450.04012.90.09225.80.18851.60.40077.40.589103.20.780129.00.935根据表1数据做出pn1型组合糖标准曲线，如图1所示。表2pn1型多糖处理前后糖含量、多糖有效性检测结果根据表2可知，多糖处理前后检测值变化不大，有效性为102％，后续的检测结果准确。表3pn1型结合物处理前后多糖含量检测结果根据表3结果可知，不同浓度的结合物样品的方法重复性试验结果表明，本发明方法(四硼酸钠咔唑法)测定肺炎多糖结合物中游离多糖的cv均≤2％，重复性良好。实验例2对本发明的检测方法进行加样回收率实验，对肺炎球菌1型荚膜多糖对应的结合物进行检测。实验方法为本发明提供的一种检测方法，待测样品为肺炎球菌1型，步骤如下：(1)取肺炎链球菌荚膜多糖1型为样1，取肺炎链球菌荚膜多糖1型对应的结合物为样2(取同一批次已知游离多糖浓度的结合物样品加入多种不同含量的组合糖溶液样品进行检测，标记为样a，样b,样c)；(2)制备肺炎链球菌1型荚膜多糖组合糖标准品溶液；(3)制备标准品梯度溶液，于比色管中制备成5％，10％，20％，40％，60％，80％，100％的标准品溶液，每管分别用超纯水补足；(4)取肺炎链球菌荚膜多糖1.5体积份，置于2.5体积份的离心管中，取肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物1.5体积份，置于另一2.5体积份的离心管中，向每离心管加入1％nadoc溶液0.125体积份，振荡混匀，向每离心管滴加0.2mhcl溶液至体系ph＝4.5，纯化水补足至2.5体积份。常温9000g离心30min，分别将上清液和沉淀分离，收集上清液；(5)向肺炎链球菌荚膜多糖上清液中加入显色试剂，进行显色反应，即为样3；向肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物上清液中加入显色试剂，进行显色反应，即为样4；显色试剂选用四硼酸钠硫酸溶液和咔唑的乙醇溶液，所述四硼酸钠硫酸溶液由四硼酸钠和浓硫酸组成；所述四硼酸钠与浓硫酸的用量比(m：v)为9.55：1000；所述咔唑的乙醇溶液中，咔唑和无水乙醇的用量比(m：v)为0.125：100；(6)向标准品梯度溶液、空白比色管中分别加入显色试剂，进行显色反应；显色试剂选用四硼酸钠硫酸溶液和咔唑的乙醇溶液，所述四硼酸钠硫酸溶液由四硼酸钠和浓硫酸组成；所述四硼酸钠与浓硫酸的用量比(m：v)为9.55：1000；所述咔唑的乙醇溶液中，咔唑和无水乙醇的用量比(m：v)为0.125：100；(7)使用紫外分光光度计，以步骤(6)处理后的空白显色试剂为参比池，在530nm下分别测定处理后的标准品梯度溶液、样1、样2、样3、样4的吸光度；(8)以标准品梯度溶液溶度为横坐标，以处理后的标准品梯度溶液吸光度为纵坐标，做标准品溶液浓度与吸光度的标准曲线，并计算线性回归方程；将样1、样2、样3、样4的吸光度代入线性回归方程，计算出样品处理前后的多糖浓度，分别为a1、a2、a3、a4；根据公式计算回收率p及游离多糖含量h，其中，根据公式计算游离多糖含量h。检测结果如表4所示。表4以pn1型组合糖作为标准品测定标准曲线如下：浓度(μg/ml)abs6.450.04012.90.09225.80.18851.60.40077.40.589103.20.780129.00.935根据表4数据做出pn1型组合糖标准曲线，如图2所示。表5肺炎球菌自制组合糖加样回收率测定结果注：实验所选样品糖型为1型，游离多糖含量占总糖的17.8％，结合物148.32μg/ml时游离多糖浓度为26.4μg/ml根据表5的实验结果，加入不同浓度梯度的组合糖标准品时加样回收率在95％-105％之间，表明我们选择的组合糖标准品适用于方法为四硼酸钠咔唑法的游离多糖测定实验。实施例3本实验例对本发明方法中脱氧胆酸钠对实验结果是否有干扰进行实验。实验方法为本发明提供的一种检测方法，待测样品为肺炎球菌1型，步骤如下：(1)取肺炎链球菌荚膜多糖为样1，取肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物为样2；(2)制备肺炎链球菌1型荚膜多糖组合糖标准品溶液；(3)制备标准品梯度溶液，于比色管中制备成10％，20％，40％，60％，80％，100％的标准品溶液，每管分别用超纯水补足；(4)取肺炎链球菌荚膜多糖1.5体积份，置于2.5体积份的离心管中，取肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物1.5体积份，置于另一2.5体积份的离心管中，向每离心管加入1％nadoc溶液0.025-0.125体积份(分别做0.025、0.05、0.0625、0.75、0.0875、0.10、0.125七个样品)，振荡混匀，向每离心管滴加0.2mhcl溶液至体系ph＝4.5，纯化水补足至2.5体积份。常温9000g离心30min，分别将上清液和沉淀分离，收集上清液；(5)向肺炎链球菌荚膜多糖上清液中加入显色试剂，进行显色反应，即为样3；向肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物上清液中加入显色试剂，进行显色反应，即为样4；显色试剂选用四硼酸钠硫酸溶液和咔唑的乙醇溶液，所述四硼酸钠硫酸溶液由四硼酸钠和浓硫酸组成；所述四硼酸钠与浓硫酸的用量比(m：v)为9.55：1000；所述咔唑的乙醇溶液中，咔唑和无水乙醇的用量比(m：v)为0.125：100；(6)向标准品梯度溶液、空白比色管中分别加入显色试剂，进行显色反应；显色试剂选用四硼酸钠硫酸溶液和咔唑的乙醇溶液，所述四硼酸钠硫酸溶液由四硼酸钠和浓硫酸组成；所述四硼酸钠与浓硫酸的用量比(m：v)为9.55：1000；所述咔唑的乙醇溶液中，咔唑和无水乙醇的用量比(m：v)为0.125：100；(7)使用紫外分光光度计，以步骤(6)处理后的空白显色试剂为参比池，在530nm下分别测定处理后的标准品梯度溶液、样1、样2、样3、样4的吸光度；(8)以标准品梯度溶液溶度为横坐标，以处理后的标准品梯度溶液吸光度为纵坐标，做标准品溶液浓度与吸光度的标准曲线，并计算线性回归方程；将样1、样2、样3、样4的吸光度代入线性回归方程，计算出样品处理前后的多糖浓度，分别为a1、a2、a3、a4；根据公式计算回收率p及游离多糖含量h，其中，根据公式计算游离多糖含量h。同时，采用cn101140276a，及《肺炎链球菌血清型7f荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定》所述的方法检测游离多糖含量，控制脱氧胆酸钠的加入量与本发明方法一致。实验结果如表6所示。表6脱氧胆酸钠对多糖浓度的干扰实验根据表6的实验结果，采用本发明及对比文件的方法对肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖进行检测的过程中，加入0.02％浓度以下的脱氧胆酸钠，加样回收率均在95-105％之间，对检测结果没有干扰；本发明方法的优势在于，当脱氧胆酸钠浓度在0.02％-0.04％之间时，对实验结果依然没有干扰，而对比文件中，该浓度的脱氧胆酸钠会影响检测结果。因此，本发明方法对脱氧胆酸钠的耐受性更高，在检测中受到脱氧胆酸钠影响的几率也更小。实验例4对本发明的检测方法进行检测限实验，对不同游离多糖含量的肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物进行检测。实验方法为本发明提供的一种检测方法，待测样品为肺炎球菌1型，步骤如下：(1)取肺炎链球菌荚膜多糖为样1，取肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物为样2(取多种不同游离多糖含量的样品进行检测，标记为样a，样b，样c，样d，样e，样f，样g)；(2)制备肺炎链球菌1型荚膜多糖组合糖标准品溶液；(3)制备标准品梯度溶液，于比色管中制备成10％，20％，40％，60％，80％，100％的标准品溶液，每管分别用超纯水补足；(4)取肺炎链球菌荚膜多糖1.5体积份，置于2.5体积份的离心管中，取肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物1.5体积份，置于另一2.5体积份的离心管中，向每离心管加入1％nadoc溶液0.125体积份，振荡混匀，向每离心管滴加0.2mhcl溶液至体系ph＝4.5，纯化水补足至2.5体积份。常温9000g离心30min，分别将上清液和沉淀分离，收集上清液；(5)向肺炎链球菌荚膜多糖上清液中加入显色试剂，进行显色反应，即为样3；向肺炎链球菌荚膜多糖对应的结合物上清液中加入显色试剂，进行显色反应，即为样4；显色试剂选用四硼酸钠硫酸溶液和咔唑的乙醇溶液，所述四硼酸钠硫酸溶液由四硼酸钠和浓硫酸组成；所述四硼酸钠与浓硫酸的用量比(m：v)为9.55：1000；所述咔唑的乙醇溶液中，咔唑和无水乙醇的用量比(m：v)为0.125：100；(6)向标准品梯度溶液、空白比色管中分别加入显色试剂，进行显色反应；显色试剂选用四硼酸钠硫酸溶液和咔唑的乙醇溶液，所述四硼酸钠硫酸溶液由四硼酸钠和浓硫酸组成；所述四硼酸钠与浓硫酸的用量比(m：v)为9.55：1000；所述咔唑的乙醇溶液中，咔唑和无水乙醇的用量比(m：v)为0.125：100；(7)使用紫外分光光度计，以步骤(6)处理后的空白显色试剂为参比池，在530nm下分别测定处理后的标准品梯度溶液、样1、样2、样3、样4的吸光度；(8)以标准品梯度溶液溶度为横坐标，以处理后的标准品梯度溶液吸光度为纵坐标，做标准品溶液浓度与吸光度的标准曲线，并计算线性回归方程；将样1、样2、样3、样4的吸光度代入线性回归方程，计算出样品处理前后的多糖浓度，分别为a1、a2、a3、a4；根据公式计算回收率p及游离多糖含量h，其中，根据公式计算游离多糖含量h。同时，采用cn101140276a，及《肺炎链球菌血清型7f荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定》所述的方法检测样a-样g中游离多糖含量。在步骤(4)样品处理时，加入脱氧胆酸钠后，在向样品中加入0.125体积份的1mol/l的nacl溶液。检测结果如表b所示。表7样品中游离多糖的含量实验中发现，在游离多糖浓度较低(小于5μg/ml)时，不同方法检测结果相差很大，因此，申请人进一步做了加样回收实验。检测前，在待测样品中加入10μg/ml的游离多糖，重复上述实验，结果如表8所示。表8样品中游离多糖的含量根据表8的结果可知，在cn101140276a，及《肺炎链球菌血清型7f荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定》中，对于a、b、h三个样品，加样回收率的实验依然不准确，判断上述两种方法在低浓度游离多糖(小于5μg/ml)的情况下，结果不准确，也就是检测限较高。而本发明的方法(不加nacl及加nacl)中，加样回收率的实验结果较为准确，可以判定对a-g组样品的检测结果比较准确，因此本发明的方法检测限较低，更适用于样品检测。对于h组的数据，加入nacl与不加nacl的检测结果差距也很大，加样回收试验依然无法得出结论，因此，申请人再次进行加样回收试验。检测前，在待测样品中加入0.1μg/ml的游离多糖，重复上述实验，结果如表9所示(只检测h组)。表9样品中游离多糖的含量根据表9的结果可知，本发明的方法，如果样品处理时不加入nacl溶液，那么当游离多糖浓度小于0.1μg/ml时，其检测结果不太准确，如样品h，但是当处理样品时加入nacl时，检测结果较为准确。因此可以初步得出结论，本发明的方法在样品处理时加入nacl溶液，可以获得更低的检测限。实施例1肺炎球菌1型结合物(pn1)的检测1.试剂、标准物质和样品四硼酸钠硫酸溶液：精密称取四硼酸钠9.55g，溶于浓硫酸1000ml中，两者混匀。咔唑溶液(0.125％)：精密称取咔唑0.125g，加无水乙醇100ml，溶解后置于棕色瓶中2～8℃冰箱内保存。pn1型组合糖标准品(公司自制，n葡萄糖醛酸：nn-乙酰基-d-半乳糖胺＝2∶1)pn1型混合糖溶液(129μg/ml)：精密称取半乳糖醛酸42.4mg、n-乙酰-d-半乳糖胺22.1mg，用超纯水定容到50ml，临用前稀释10倍。1％nadoc：精确称取脱氧胆酸钠0.5g，用超纯水定溶50ml，温箱保存。0.2mhcl：取浓盐酸200μl加入11.8ml超纯水。1型多糖：1201307006h1b11型结合物：1201307006h1b1j12ttcdap2.仪器uv-1800型紫外分光光度计(日本岛津)，1-15pk型离心机(赛多利斯)，hyq-2121a型涡旋混匀器(silentshake)，pb-10型ph计(赛多利斯)，bt224s型分析天平(赛多利斯)，gh98732型移液器(20-200μl，thermo)，232200a型移液器(100-1000μl，eppendorf)3.操作步骤(1)样品稀释表10pn1型多糖、结合物浓度对pn1型多糖、结合物进行处理，处理条件如表11所示。表11pn1型多糖、结合物处理条件样品号供试品：nadocph值1型多糖12:1(1.5ml：0.125ml)4.51型结合物12:1(1.5ml：0.125ml)4.5将1型多糖以及结合物供试品按上表条件处理后，混匀，常温9000g离心30min，将上清和沉淀分离，收集上清，用糖醛酸法检测沉淀前溶液中和沉淀后上清中多糖浓度。(2)多糖测定1型组合糖标准品稀释：取标准品0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml于比色管中，每管用超纯水补足至1ml。取1型多糖经过doc沉淀处理后的上清液1ml于试管中，向标准品、样品、空白管中分别加入5ml硼酸硫酸溶液(放置冰水浴中)，盖上塞子，并在管口缠上封口膜，混匀后放入试管架，沸水浴中15分钟后冷却至室温。然后再加入0.2ml咔唑溶液，盖上塞子，混匀后放入试管架中再沸水浴15min，冷却至室温后，放置紫外分光光度计中在波长530nm处测量吸光度通过线性回归方程计算出1型多糖处理前后的多糖含量，分析出处理后多糖回收率(实验有效性)，进一步计算出结合物中游离糖含量。4.实验结果表12以pn1型组合糖作为标准品测定标准曲线浓度(μg/ml)abs6.40.04012.90.09225.80.18851.60.40077.40.589129.00.935以pn1型组合糖浓度与其相应吸光度(表12)做线性回归，线性关系见附图3。表13pn1型多糖处理前后糖含量、多糖有效性检测结果表14pn1型结合物处理前后多糖含量检测结果5.结果分析肺炎1型多糖、多糖tt蛋白结合物，在ph＝4.5、多糖：nadoc＝12:1的条件下，实验有效性为101.4％，有效性合格。结合物(1201307006h1b1j12ttcdap)中游离糖含量为15.1％。实施例2本实施例与实施例1方法基本相同。区别在于，在步骤(1)样品稀释时，加入脱氧胆酸钠后，加入0.125ml的1mol/l的nacl溶液。实验结果如表15、表16所示。表15pn1型多糖处理前后糖含量、多糖有效性检测结果表16pn1型结合物处理前后多糖含量检测结果5.结果分析肺炎1型多糖、多糖tt蛋白结合物，在ph＝4.5、多糖：nadoc＝12:1的条件下，实验有效性为101.1％，有效性合格。结合物(1201307006h1b1j12ttcdap)中游离糖含量为14.9％。据实施例1-2结果可知，本发明提供的检测方法均能准确的检测荚膜多糖结合物中游离多糖，且采用不同方法(加nacl，不加nacl)检测的结果基本一致，没有显著差异。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。当前第1页12