本发明涉及生物电子检测技术领域，更具体地，涉及一种离子流速和细胞膜电位同步获取装置与方法。
背景技术：
在植物电生理领域发展的一百多年间，由于检测技术的不断更新，对植物电活动的认识逐渐深刻。其中膜片钳与电压钳方法对细胞膜电位变化的离子构成研究起到了巨大的推动作用。
膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，在电极尖端笼罩下的膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器(膜片钳放大器)测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。
然而，膜片钳技术还存在许多问题，一方面，离子通过载体实现转运过程往往比较缓慢，产生的电流微弱，依靠膜片钳技术难以实时记录细胞膜电位；另外，若包内外离子转运过程中总体呈现电中性，即不产生电流，膜片钳技术也无法反映这种运输过程，故而现在亟须一种能够对离子流速和细胞膜电位同步获取的方法来解决上述问题。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的问题，本发明实施例提出了一种离子流速和细胞膜电位同步获取装置与方法。
根据本发明的一个方面，提供一种离子流速和细胞膜电位同步获取装置，所述装置包括：
第一玻璃微电极、第二玻璃微电极、参比电极以及信号处理模块；
所述信号处理模块的输入端包括正极输入端和负极输入端，所述正极输入端包括第一连接端和第二连接端，所述第一连接端与所述第一玻璃微电极相连，所述第二连接端与所述第二玻璃微电极相连，所述负极输入端连接参比电极；
所述第一玻璃微电极的尖端插入样本的细胞膜内，所述样本和所述参比电极浸泡在基液中；
所述第二玻璃微电极的尖端浸泡在所述基液中，所述第二玻璃微电极内部灌充的电极液离子包括所述基液的待测离子，所述第二玻璃微电极的尖端灌注有离子选择生物传感器液态膜，在进行离子流速和细胞膜电位同步采集时，在所述基液中朝任一方向移动。
其中，所述装置还包括：
电极支架，所述第二玻璃微电极固定于所述电极支架上。
其中，所述装置还包括：
显微镜以及与所述显微镜连接的图像呈现模块，所述显微镜用于观测所述第一玻璃微电极尖端在所述样本细胞膜内的位置，还用于观测所述第二玻璃微电极尖端与所述样品的相对位置，所述图像呈现模块用于将显微镜的观测结果进行显示。
其中，所述信号处理模块包括：
离子流速信号放大单元和膜电位信号放大单元；
所述离子流速信号放大单元用于将所述第二玻璃微电极移动前采集的电位信号以及所述第二玻璃微电极移动后采集的电位信号进行差分放大；
所述膜电位信号放大单元用于对所述第一玻璃微电极采集到的信号进行阻抗转换和差分低倍数放大。
其中，所述第一玻璃微电极的尖端直径小于等于1μm，所述第二玻璃微电极的尖端直径为2-10μm。
在上述装置的基础上，本发明还提供了一种离子流速和细胞膜电位同步获取方法，其特征在于，包括：
s1、实时同步获取所述第一玻璃微电极采集的细胞膜内电位、所述第二玻璃微电极移动前基液电位值、所述第二玻璃微电极移动后基液电位值以及所述参比电极采集的细胞膜外电位值；
s2、根据所述参比电极采集的细胞膜外电位值与所述第一玻璃微电极采集的细胞膜内电位的差，计算每一时刻的细胞膜电位，并
根据nernst–planck公式的扩展项、所述第二玻璃微电极移动前基液电位值和所述第二玻璃微电极移动后基液电位值，计算每一时刻的离子流速。
其中，所述根据nernst–planck公式的扩展项、所述第二玻璃微电极移动前基液电位值和所述第二玻璃微电极移动后基液电位值，计算每一时刻的离子流速，具体包括：
根据所述第二玻璃微电极移动前基液电位值和所述第二玻璃微电极移动后基液电位值，确定所述第二玻璃微电极移动前基液浓度与所述第二玻璃微电极移动后基液浓度的差；
获取所述第二玻璃微电极的移动距离，并根据所述nernst–planck公式的扩展项、所述第二玻璃微电极的移动距离以及所述第二玻璃微电极移动前基液浓度与所述第二玻璃微电极移动后基液浓度的差，计算每一时刻的离子流速；
其中，所述nernst–planck公式的扩展项为j＝-d·△c/△x，j为离子流速、d是扩散常数、△c为所述第二玻璃微电极移动前基液浓度与所述第二玻璃微电极移动后基液浓度的差、△x为所述第二玻璃微电极的移动距离。
其中，所述根据所述第二玻璃微电极移动前基液电位值和所述第二玻璃微电极移动后基液电位值，确定所述第二玻璃微电极移动前基液浓度与所述第二玻璃微电极移动后基液浓度的差，包括：
获取所述第二玻璃微电极移动前位置和移动后位置的截距和斜率；
根据公式v＝k±slgc以及所述第二玻璃微电极移动前基液电位值和所述第二玻璃微电极移动后基液电位值，确定所述第二玻璃微电极移动前基液浓度与所述第二玻璃微电极移动后基液浓度的差，其中v为基液电位值，k为所述截距，s为所述斜率，c为基液浓度。
其中，在步骤s1之前，所述方法还包括：
对所述第二玻璃微电极进行测试标定，判定所述第二玻璃微电极是否满足预设条件，所述测试标定包括将所述第二玻璃微电极置于浓度不同的标准液中，获取所述浓度不同的标准液对应的电位值；
根据所述浓度不同的标准液的标准液浓度以及所述浓度不同的标准液对应的电位值，计算所述第二玻璃微电极的截距和斜率。
其中，在步骤s1之前，所述方法还包括：
测量所述第一玻璃微电极的尖端电位，相应的，在步骤s1测量过程中消除所述第一玻璃微电极的尖端电位。
本发明实施例提供的离子流速和细胞膜电位同步获取装置及方法，能够实时同步的对离子流速和细胞膜电位信号进行获取，获取过程简单方便，且通过离子流速能过准确反映离子运输过程。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种离子流速和细胞膜电位同步获取装置结构示意图；
图2是本发明实施例提供的一种离子流速和细胞膜电位同步获取方法流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
图1是本发明实施例提供的一种离子流速和细胞膜电位同步获取装置结构示意图，如图1所示，所述装置包括：
第一玻璃微电极1、第二玻璃微电极2、参比电极3以及信号处理模块；
所述信号处理模块的输入端包括正极输入端和负极输入端，所述正极输入端包括第一连接端和第二连接端，所述第一连接端与所述第一玻璃微电极1相连，所述第二连接端与所述第二玻璃微电极2相连，所述负极输入端连接参比电极3；
所述第一玻璃微电极1的尖端插入样本的细胞膜内，所述样本和所述参比电极3浸泡在基液中；
所述第二玻璃微电极1的尖端浸泡在所述基液中，所述第二玻璃微电极2内部灌充的电极液离子包括所述基液的待测离子，所述第二玻璃微电极2的尖端灌注有离子选择生物传感器液态膜，在进行离子流速和细胞膜电位同步采集时，在所述基液中朝任一方向移动。
如图1所示，本发明实施例提供的离子流速和细胞膜电位同步获取装置包括第一玻璃微电极1和第二玻璃微电极2，所述第一玻璃微电极1用于采集样本的细胞膜电信号，所述第二玻璃微电极2用于采集离子在细胞外流速，所述参比电极3为第一玻璃微电极1和第二玻璃微电极2的共用负极。
那么在本发明所有实施例中，也可将所述第一玻璃微电极1称为膜电位电极，将所述第二玻璃微电极2称为离子选择性玻璃微电极。
进一步的，本发明实施例提供的膜电位电极膜电位是一类尖端极细的，专门用于刺入细胞内部的微电极传感器，内充液的钾离子与氯离子的离子运动速率较为一致，因此没有较大的液接电位，膜电位电极颈部需长且细，电极内部灌充100-300mmol氯化钾溶液，一般的电极尖端直径小于等于1μm；
而离子选择性玻璃微电极是一类利用膜电势测定溶液中离子的活度的电化学传感器，当它和含待测离子的溶液接触时，在它的敏感膜和溶液的相界面上产生与该离子活度直接有关的膜电势。离子选择性玻璃微电极颈部短，玻璃微电极经过硅烷化的处理，电极液所含离子与生物所处微环境的待测离子相同，电极丝采用银/氯化银丝，离子选择性生物传感器液态膜被灌注在玻璃微电极尖端，并且一般的离子选择性玻璃微电极尖端直径在2-10μm范围内。
进一步的，离子选择性微电极一般定位于与测试样品表面5μm-30μm之处，记录移动前的位置为位置1，并对位置1测得的信号ve1进行存储，再将离子选择性微电极向任一反向移动一定微小距离，该微小距离10μm-100μm，此时记录该位置为位置2，得到ve2计算出该位置处对应的浓度cx2，位置1与位置2之间的距离为δx。
具体的，本发明实施例提供的离子选择性玻璃微电极包括0.8mm-1mm内径的硼酸盐无导液丝玻璃管经过拉制仪制作的尖端直径在2-10μm玻璃管，所述的膜电位电极包括0.8mm-1mm内径的硼酸盐有导液丝玻璃管经过拉制仪制作的尖端直径在小于1μm玻璃管。所述的硅烷化可采用二甲基二氯硅烷作为硅烷化试剂。
以待测离子为钾离子k+为例，电极液采用100mmkcl，离子敏感膜采用potassiumk+ionophorei-cocktailb，电极丝采用银或氯化银制成。
如图1所示，在测量过程中，膜电位电极可直接刺入细胞中，离子选择性电极则需要在胞外两个不同的微小距离下来回移动，这样可以有效的消除温漂、氯化银电极漂移。
同时，本发明实施例还提供了信号处理模块同时对膜电位电极和离子选择性电极采集的电位信息进行处理，同步记录二者数据可以为植物电生理研究提供同步的实时数据，比以往的通过分开仪器测量的离散结果最后通过统计学来进行分析显得更加有效有意义。
可以理解的是，图1提供的示意图中并没有提供信号处理模块的全部部分，一般的，信号处理模块包括阻抗变换单元、放大单元、电极测量基线浓度的模拟信号锁存单元、仪器仪表放大单元、采集与处理单元，通过上述所有单元的信号处理过程，能够持续性的输出离子流速的变化与膜电位的同步变化。
在上述实施例的基础上，所述装置还包括：
电极支架，所述第一玻璃微电极、所述第二玻璃微电极以及所述参比电极固定于所述电极支架上。
可以理解的是，在本发明实施例中，所述第一玻璃微电极、所述第二玻璃微电极以及所述参比电极起到的是电位采集作用，但其布置不可能悬空，故而在本发明实施例中，优选的采用了电极支架对上述三种电极进行固定。
并且，由于第二玻璃微电极在测试过程中需要移动，那么通过控制电极支架移动即可控制第二玻璃微电极的移动过程，整个操作过程方便快捷。
优选的，电极支架采用聚四氟乙烯制作用于固定离子选择性玻璃微电极。
优选的，本发明实施例提供的电极支架采用绝缘材料，可固定银/氯化银丝，可以连接到阻抗变换单元，阻抗变换单元输入阻抗大于等于1013ω，所述阻抗变换单元属于信号处理模块的膜电位放大单元中。
在上述实施例的基础上，所述装置还包括：
显微镜以及与所述显微镜连接的图像呈现模块，所述显微镜用于观测所述第一玻璃微电极尖端在所述样本细胞膜内的位置，还用于观测所述第二玻璃微电极尖端与所述样品的相对位置，所述图像呈现模块用于将显微镜的观测结果进行显示。
可以理解的是，本发明实施例针对的样本是细胞，那么通过肉眼是无法进行直接观测得到的，故而本发明实施例优选的提供了显微镜以及与所述显微镜连接的图像呈现模块，来观测第一玻璃微电极在细胞中的位置。
在上述实施例的基础上，所述信号处理模块包括：
离子流速信号放大单元和膜电位信号放大单元；
所述离子流速信号放大单元用于将所述第二玻璃微电极移动前采集的电位信号以及所述第二玻璃微电极移动后采集的电位信号进行差分放大；
所述膜电位信号放大单元用于对所述第一玻璃微电极采集到的信号进行阻抗转换和差分低倍数放大。
可以理解的是，本发明实施例中信号处理模块主要进行了对于第二玻璃微电极采集的信号和第一玻璃微电极采集的信号的放大作用，本发明实施例将实现该作为的功能模块称为离子流速信号放大单元和膜电位信号放大单元；
其中，所述离子流速信号放大单元通过信号差分放大单元输出ve2与ve1的差δv被高倍放大，ve2为第二玻璃微电极移动后采集的电位信号，ve1为第二玻璃微电极移动前采集的电位信号，从而实现对离子流速信号的两次放大。
所述膜电位信号放大单元通过阻抗转换和差分低倍数放大，实现对膜电位信号的一次放大过程。
具体的，本发明实施例提供的离子流速信号放大单元和膜电位信号放大单元具体包括多通道高阻抗前置放大器和仪器仪表放大器，所述多通道高阻抗前置放大器采用ad549,阻抗大于等于1013ω，放大倍数为10倍，仪器仪表放大器采用ad620，其两个输入引脚分别连接放大单元输出和lf356输出，ad620的放大倍数为50倍，放大单元和ad620输出接带有2个通道模拟数字转换器a/d的采集与处理单元中的一个a/d通道，a/d通道采用分辨率不低于16位的∑δ型a/d转换器；
为了获取波形更为平滑的信号，本发明实施例在信号处理模块中还设置有滤波单元，优选的，滤波单元中的滤波器采用rc低通滤波设计，r＝10k，c＝1μf，离子流速信号和膜电位信号均使用上述低通滤波器进行滤波。
在上述实施例的基础上，所述第一玻璃微电极的尖端直径小于等于1μm，所述第二玻璃微电极的尖端直径为2-10μm。
可以理解的是，由于第一玻璃微电极和第二玻璃微电极所完成的采集功能不同，故而其模具制作的要求也不同，优选的，在本发明实施例中，所述第一玻璃微电极的尖端直径小于等于1μm，所述第二玻璃微电极的尖端直径为2-10μm。
图2是本发明实施例提供的一种离子流速和细胞膜电位同步获取方法流程图，如图2所示，所述方法包括：
s1、实时同步获取所述第一玻璃微电极采集的细胞膜内电位、所述第二玻璃微电极移动前基液电位值、所述第二玻璃微电极移动后基液电位值以及所述参比电极采集的细胞膜外电位值；
s2、根据所述参比电极采集的细胞膜外电位值与所述第一玻璃微电极采集的细胞膜内电位的差，计算每一时刻的细胞膜电位，并
根据nernst–planck公式的扩展项、所述第二玻璃微电极移动前基液电位值和所述第二玻璃微电极移动后基液电位值，计算每一时刻的离子流速。
可以理解的是，通过图1本发明实施例提供的装置，能够通过第一玻璃微电极和第二玻璃微电极采集相应的电位值同步的获取两种电生理信息，其中胞外离子流速应用nernst-planck公式的扩散项计算，而细胞膜电位记录采用尖端直径小于1μm的玻璃微电极刺入到细胞内获取，通过细胞膜内的电位v1减去细胞膜外参比电极v2获得。
在上述实施例的基础上，所述根据nernst–planck公式的扩展项、所述第二玻璃微电极移动前基液电位值和所述第二玻璃微电极移动后基液电位值，计算每一时刻的离子流速，具体包括：
根据所述第二玻璃微电极移动前基液电位值和所述第二玻璃微电极移动后基液电位值，确定所述第二玻璃微电极移动前基液浓度与所述第二玻璃微电极移动后基液浓度的差；
获取所述第二玻璃微电极的移动距离，并根据所述nernst–planck公式的扩展项、所述第二玻璃微电极的移动距离以及所述第二玻璃微电极移动前基液浓度与所述第二玻璃微电极移动后基液浓度的差，计算每一时刻的离子流速；
其中，所述nernst–planck公式的扩展项为j＝-d·△c/△x，j为离子流速、d是扩散常数、△c为所述第二玻璃微电极移动前基液浓度与所述第二玻璃微电极移动后基液浓度的差、△x为所述第二玻璃微电极的移动距离。
所述根据所述第二玻璃微电极移动前基液电位值和所述第二玻璃微电极移动后基液电位值，确定所述第二玻璃微电极移动前基液浓度与所述第二玻璃微电极移动后基液浓度的差，包括：
获取所述第二玻璃微电极移动前位置和移动后位置的截距和斜率；
根据公式v＝k±slgc以及所述第二玻璃微电极移动前基液电位值和所述第二玻璃微电极移动后基液电位值，确定所述第二玻璃微电极移动前基液浓度与所述第二玻璃微电极移动后基液浓度的差，其中v为基液电位值，k为所述截距，s为所述斜率，c为基液浓度。
具体的，d是扩散常数可以由x一维方向上浓度梯度变化和离子的扩散常数求得离子的流速，x是第二玻璃微电极在基液中的水平位置；δx为基液中第二玻璃微电极移动前后所处的两个位置x1、x2之差，范围可为10μm-100μm，两个位置的浓度值cx1和cx2由v＝k±slgc计算，k为截距，s为斜率。
本发明实施例还可以测试溶液中待测离子浓度，获得离子浓度和变化采用所测活度的转化，离子活度则由离子选择性微电极获得。
在上述实施例的基础上，在步骤s1之前，所述方法还包括：
对所述第二玻璃微电极进行测试标定，判定所述第二玻璃微电极是否满足预设条件，所述测试标定包括将所述第二玻璃微电极置于浓度不同的标准液中，获取所述浓度不同的标准液对应的电位值；
根据所述浓度不同的标准液的标准液浓度以及所述浓度不同的标准液对应的电位值，计算所述第二玻璃微电极的截距和斜率。
可以理解的是，制作出的离子选择性玻璃微电极必须通过标定测试，以确定是否符合测试要求。
测试过程主要为：将配置好的含有待测离子的、浓度不同的标准液c1和标准液c2，用于标定，计算出v＝k±slgc，k为截距，s为斜率，c为溶液浓度，斜率符合要求后，离子选择性玻璃微电极方可使用。
具体的，将配置好的含有k+离子的1mm标准液c1和10mm标准液c2，用离子选择性微电极进行采集后，得到分别与两个活度对应的两个电压值，v1＝-23.28mv和v2＝33.41mv，从而根据v＝k±slgc，计算可得s＝56.69mv/mm，根据预设的条件进行对比，s＝56.69mv/mm符合标准，故而此离子选择性微电极符合测试标定，可以进行使用。
在上述实施例的基础上，在步骤s1之前，所述方法还包括：
测量所述第一玻璃微电极的尖端电位，相应的，在步骤s1测量过程中消除所述第一玻璃微电极的尖端电位。
可以理解的是，膜电位电极直接刺入细胞中，需要消除掉尖端电位后才可准确的进行电位测量工作。
例如：将拉制的尖端直径2m以上的，灌充完100mmol氯化钾溶液的微电极先放到测试液中获得电位va＝-19.27mv。再将拉制好的尖端直径小于1μm的膜电位电极放置在测试液中获得电位vb＝-46.26mv，则尖端电位约为27mv。
那么在进行实际测量的过程中，则需要将尖端电位去除，从而得到正确的电位信号。
进一步需要说明的是，为了确保膜电位电极所采集到信号的可靠性，优选的，本发明实施例将膜电位电极刺入到待测细胞内，若实时记录到的电位下降20mv-200mv则算成功记录到了膜电位，然后固定膜电位电极不动，保持在细胞内部实时记录膜电位变化。
具体的，本发明实施例将小麦根区样品放置测试液中进行了仿真测试，测试液的成分包括0.5mmcacl2，2.5mmhepes-naoh(ph6.5)，1.5mmkcl。此时，需要同步测定k+离子流动的流速与根部表皮细胞膜电位，在显微镜与图像呈现模块的帮助下，优先将离子选择性微电极调节至根区可视范围内，再将膜电位电极调节至根区可视范围内，两根电极呈现一定角度，互不干扰。
其中膜电位电极需要与根区表面形成较大程度的90°直角，方便刺入细胞。通过控制三维控制器，先将膜电位电极刺入细胞，在软件中看到膜电位信号下降约50mv以上则说明已经很好的刺入细胞内部，保持膜电位电极不再移动。
然后再将离子选择性电极定位于与测试样品表面5μm-15μm之处，记录移动前的位置为位置1，同时将移动前的信号ve1锁存，同时依据所得公式计算出浓度cx1；将离子选择性微电极向外位移40μm，此时记录该位置为位置2，得到ve2计算出该位置处浓度cx2；位置2和位置1的距离为40μm。同时信号差分放大单元输出ve2与ve1的差δv被仪器仪表放大器ad620放大，经信号处理模块，最终计算出离子流速j。
在膜电位信号与离子流速信号稳定后，对小麦样品进行150mmol氯化钠刺激，便可以同步获取到钾离子流速的变化与膜电位的同步变化。
最后，本申请的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。