本发明属于免疫分析和生物传感技术领域,涉及一种夹心型肺癌标志物电化学传感器的制备方法及应用。具体是采用新型纳米功能材料作为催化剂标记检测抗体,实现对肺癌标志物cea、ca125、scca的灵敏检测。
背景技术:
肺癌具有较高的发病率,不易察觉,且肿瘤的生长和转移的速度快,成为对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。因此,实现肺癌标志物的灵敏检测,对于肺癌的早期发现和早期治疗非常重要。目前,对于肺癌标志物的检测方法有很多,如酶联免疫法,放射免疫法等,但这些方法在检测过程中可能需要大型仪器设备,存在放射性污染等问题,因此,发明一种特异性强,灵敏度高,检测速度快,操作简便的肺癌肿瘤标志物传感器十分重要。
电化学免疫传感器依靠抗原与其相应抗体的特异性结合,已经广泛应用于肺癌及各种肿瘤标志物的检测,一般可分为夹心型免疫传感器和无标记型免疫传感器两种。夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术,具有灵敏度高、检测范围宽、检测下限低、检测快速等优点,已广泛应用于环境监测、食品安全控制、生物监测、临床检验等领域。
核壳结构的双金属纳米复合材料因其独特的光学、电学以及化学性质,目前已在生产、生活及科研中得到了广泛应用。氮掺杂石墨烯具有大的表面积、良好的导电性和生物相容性,被广泛用于电池、传感器等领域。本发明采用聚多巴胺功能化的金纳米粒子作为基底材料,au@ptdns/ng/cu2+作为催化材料,并与检测抗体进行孵化作为标记物,构建了用于肺癌标记物检测的夹心型电化学免疫传感器。
技术实现要素:
本发明提供了一种夹心型肺癌标志物电化学传感器的制备方法及应用,实现了对肺癌标志物的超灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种夹心型肺癌标志物电化学传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的au@ptdns/ng/cu2+标记的传感器应用于肺癌标志物的高灵敏、特异性检测。
本发明的技术方案,包括以下步骤。
1.一种夹心型肺癌标志物电化学传感器的制备方法,步骤如下:
(1)将直径为4mm的玻碳电极用al2o3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;
(2)取6µl、1.0~3.0mg/ml的聚多巴胺功能化的金纳米粒子分散液滴涂到电极表面,室温下晾干,超纯水冲洗电极表面,晾干;
(3)将6µl、8~12µg/ml的肺癌标志物捕获抗体ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4℃冰箱中干燥;
(4)继续将3µl、0.5~1.5mg/ml的牛血清白蛋白bsa溶液滴加到电极表面,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干;
(5)滴加6µl、0.0001~100ng/ml的一系列不同浓度的肺癌标志物抗原ag溶液,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干;
(6)将6µl、1.5~3.5mg/ml检测抗体孵化物au@ptdns/ng/cu2+-ab2溶液滴至电极表面,置于4℃冰箱中孵化40min,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干,制得一种夹心型肺癌标志物电化学传感器。
2.所述聚多巴胺功能化的金纳米粒子的制备,步骤如下:
(1)金纳米粒子溶液的制备
将1~2ml、质量分数为1%的氯金酸加入99ml超纯水中,加热至沸腾后加入1.5~3.5ml、质量分数为1%的柠檬酸钠溶液,回流10~30min,冷却至室温,得到酒红色的金纳米粒子溶液;
(2)聚多巴胺功能化的金纳米粒子的制备
取10~20mg多巴胺加入到10ml、10mmol/l的ph=8.5的tris-hcl缓冲液中,加入10ml上述制备的金纳米粒子溶液,在室温下振荡24h,得到聚多巴胺功能化的金纳米粒子。
3.所述au@ptdns/ng/cu2+的制备,步骤如下:
(1)au@ptdns的制备
在烧瓶中配制10ml含0.25mmol/l氯金酸和75mmol/l十六烷基三甲基溴化铵的水溶液,剧烈搅拌下快速加入0.6ml、10mmol/l硼氢化钠,室温下缓慢搅拌3h后制得金水溶胶;量取1ml制得的金水溶胶超纯水稀释至100ml,制得金晶种溶液。
将0.1~0.5ml、10mmol/l氯金酸,2~3ml、0.2mol/l十六烷基三甲基溴化铵和1.5~2.0ml、0.1mol/l抗坏血酸的水溶液混合,在混合液中加入0.3~0.5ml金晶种溶液,超纯水稀释至25ml,在室温下振荡8h,制得立方金纳米粒子的溶液;在立方金纳米粒子的溶液中依次加入1~3ml、0.1mol/l抗坏血酸和1ml、10mmol/l氯亚铂酸钾,于60℃的水浴中反应12h,;离心,超纯水洗涤3次,于40℃真空干燥箱中烘干,制得au@ptdns;称取一定质量的au@ptdns超声分散到一定体积的超纯水中制成au@ptdns分散液使用;
(2)氮掺杂石墨烯ng的制备
称取20~40mg丙醛肟置于500ml三口烧瓶中,依次加入200ml浓氨水和15ml氧化石墨烯悬浮液,超声分散均匀后,将三口烧瓶转移到油浴锅中,在搅拌条件下90℃反应4h,自然冷却至室温;离心分离,用超纯水洗涤至滤液成中性,冻干,制得ng;
所述氧化石墨烯悬浊液制备方法如下:称取2.0g石墨粉,加入96ml浓硫酸,在搅拌条件下反应20min,随后加入12g高锰酸钾,在冰水浴条件下搅拌1.5h,随后加热至55℃,反应5h;缓慢加入100ml超纯水后,再加入10ml、质量分数30%的双氧水,搅拌30min,离心分离,上清液即为氧化石墨烯悬浮液;
(3)au@ptdns/ng/cu2+的制备
称取10mg上述制备的ng,分散在10~20ml、1mg/ml的au@ptdns分散液中,超声2h,离心分离,40℃下烘干得到au@ptdns/ng;取10mg的au@ptdns/ng分散在10ml超纯水中,加入1~3mmol/l氯化铜,在室温下搅拌24h,离心分离,40℃下烘干,制得au@ptdns/ng/cu2+;
(4)au@ptdns/ng/cu2+-ab2的制备
称取3~7mg的au@ptdns/ng/cu2+分散到1ml超纯水中,加入100µl、80~120µg/ml的检测抗体孵化物au@ptdns/ng/cu2+-ab2溶液和900µl、50mmol/l的ph=6.8的磷酸盐缓冲溶液,4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h,离心分离,重新分散于1ml、50mmol/l的ph=6.8的磷酸盐缓冲溶液,制得au@ptdns/ng/cu2+检测抗体ab2孵化物溶液,4℃下保存备用。
4.肺癌标志物的检测,步骤如下:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,所制备的传感器为工作电极,在10ml的ph为5.8~8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试;
(2)用计时电流法对分析物进行检测,输入电位为-0.4v,取样间隔为0.1s,运行时间为400s;
(3)当背景电流趋于稳定后,每隔50s向10ml的ph为6.8磷酸盐缓冲溶液中注入10µl、5mol/l的双氧水,记录不同浓度下的肺癌标志物抗原所对应的电流变化;
(4)利用工作曲线法,得到待测样品中肺癌标志物抗原的浓度。
上述肿瘤标志物选自下列之一:cea、ca125、scca。
本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
(1)采用聚多巴胺功能化的金纳米粒子作为基底材料,具有独特的导电性和粘附性,可以结合更多抗体。au@ptdns为枝晶状纳米复合材料,具有良好的水溶性和催化性能,且存在更多的结合位点,能有效吸附并固载抗体。ng具有优异的导电性,大的比表面积,可以结合更多au@ptdns,通过吸附cu2+,由于协同效应可以进一步提高材料的催化性能,实现了对测定信号放大,提高了肿瘤标志物检测的灵敏度,降低了检测限;
(2)一种夹心型肺癌标志物电化学传感器,实现了对肺癌标志物的灵敏检测,其中对cea的测定,线性范围为0.0005~50ng/ml,检测限为0.167pg/ml;对ca125的测定,其线性范围为0.0001~50ng/ml,检测限为0.033pg/ml;对scca的测定,其线性范围为0.0005~100ng/ml,检测限为0.167pg/ml,表明一种夹心型肺癌标志物电化学传感器可以达到准确测定的目的。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明,但不限于此。
实施例1一种夹心型肺癌标志物电化学传感器的制备方法,步骤如下:
(1)将直径为4mm的玻碳电极用al2o3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;
(2)取6µl、1.0mg/ml的聚多巴胺功能化的金纳米粒子分散液滴涂到电极表面,室温下晾干,超纯水冲洗电极表面,晾干;
(3)将6µl、8µg/ml的肺癌标志物捕获抗体ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4℃冰箱中干燥;
(4)继续将3µl、0.5mg/ml的牛血清白蛋白bsa溶液滴加到电极表面,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干;
(5)滴加6µl、0.0001~100ng/ml的一系列不同浓度的肺癌标志物抗原ag溶液,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干;
(6)将6µl、1.5mg/ml检测抗体孵化物au@ptdns/ng/cu2+-ab2溶液滴至电极表面,置于4℃冰箱中孵化40min,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干,制得一种夹心型肺癌标志物电化学传感器。
实施例2一种夹心型肺癌标志物电化学传感器的制备方法,步骤如下:
(1)将直径为4mm的玻碳电极用al2o3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;
(2)取6µl、2.0mg/ml的聚多巴胺功能化的金纳米粒子分散液滴涂到电极表面,室温下晾干,超纯水冲洗电极表面,晾干;
(3)将6µl、10µg/ml的肺癌标志物捕获抗体ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4℃冰箱中干燥;
(4)继续将3µl、1.0mg/ml的牛血清白蛋白bsa溶液滴加到电极表面,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干;
(5)滴加6µl、0.0001~100ng/ml的一系列不同浓度的肺癌标志物抗原ag溶液,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干;
(6)将6µl、2.5mg/ml检测抗体孵化物au@ptdns/ng/cu2+-ab2溶液滴至电极表面,置于4℃冰箱中孵化40min,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干,制得一种夹心型肺癌标志物电化学传感器。
实施例3一种夹心型肺癌标志物电化学传感器的制备方法,步骤如下:
(1)将直径为4mm的玻碳电极用al2o3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;
(2)取6µl、3.0mg/ml的聚多巴胺功能化的金纳米粒子分散液滴涂到电极表面,室温下晾干,超纯水冲洗电极表面,晾干;
(3)将6µl、12µg/ml的肺癌标志物捕获抗体ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4℃冰箱中干燥;
(4)继续将3µl、1.5mg/ml的牛血清白蛋白bsa溶液滴加到电极表面,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干;
(5)滴加6µl、0.0001~100ng/ml的一系列不同浓度的肺癌标志物抗原ag溶液,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干;
(6)将6µl、3.5mg/ml检测抗体孵化物au@ptdns/ng/cu2+-ab2溶液滴至电极表面,置于4℃冰箱中孵化40min,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干,制得一种夹心型肺癌标志物电化学传感器。
实施例4所述聚多巴胺功能化的金纳米粒子的制备,步骤如下:
(1)金纳米粒子溶液的制备
将1ml、质量分数为1%的氯金酸加入99ml超纯水中,加热至沸腾后加入1.5ml、质量分数为1%的柠檬酸钠溶液,回流10min,冷却至室温,得到酒红色的金纳米粒子溶液;
(2)聚多巴胺功能化的金纳米粒子的制备
取10mg多巴胺加入到10ml、10mmol/l的ph=8.5的tris-hcl缓冲液中,加入10ml上述制备的金纳米粒子溶液,在室温下振荡24h,得到聚多巴胺功能化的金纳米粒子。
实施例5所述聚多巴胺功能化的金纳米粒子的制备,步骤如下:
(1)金纳米粒子溶液的制备
将1.5ml、质量分数为1%的氯金酸加入99ml超纯水中,加热至沸腾后加入2.5ml、质量分数为1%的柠檬酸钠溶液,回流20min,冷却至室温,得到酒红色的金纳米粒子溶液;
(2)聚多巴胺功能化的金纳米粒子的制备
取15mg多巴胺加入到10ml、10mmol/l的ph=8.5的tris-hcl缓冲液中,加入10ml上述制备的金纳米粒子溶液,在室温下振荡24h,得到聚多巴胺功能化的金纳米粒子。
实施例6所述聚多巴胺功能化的金纳米粒子的制备,步骤如下:
(1)金纳米粒子溶液的制备
将2ml、质量分数为1%的氯金酸加入99ml超纯水中,加热至沸腾后加入3.5ml、质量分数为1%的柠檬酸钠溶液,回流30min,冷却至室温,得到酒红色的金纳米粒子溶液;
(2)聚多巴胺功能化的金纳米粒子的制备
取20mg多巴胺加入到10ml、10mmol/l的ph=8.5的tris-hcl缓冲液中,加入10ml上述制备的金纳米粒子溶液,在室温下振荡24h,得到聚多巴胺功能化的金纳米粒子。
实施例7所述au@ptdns/ng/cu2+的制备,步骤如下:
(1)au@ptdns的制备
在烧瓶中配制10ml含0.25mmol/l氯金酸和75mmol/l十六烷基三甲基溴化铵的水溶液,剧烈搅拌下快速加入0.6ml、10mmol/l硼氢化钠,室温下缓慢搅拌3h后制得金水溶胶;量取1ml制得的金水溶胶超纯水稀释至100ml,制得金晶种溶液。
将0.1ml、10mmol/l氯金酸,2ml、0.2mol/l十六烷基三甲基溴化铵和1.5ml、0.1mol/l抗坏血酸的水溶液混合,在混合液中加入0.3ml金晶种溶液,超纯水稀释至25ml,在室温下振荡8h,制得立方金纳米粒子的溶液;
在立方金纳米粒子的溶液中依次加入1ml、0.1mol/l抗坏血酸和1ml、10mmol/l氯亚铂酸钾,于60℃的水浴中反应12h,;离心,超纯水洗涤3次,于40℃真空干燥箱中烘干,制得au@ptdns;称取一定质量的au@ptdns超声分散到一定体积的超纯水中制成au@ptdns分散液使用;
(2)氮掺杂石墨烯ng的制备
称取20mg丙醛肟置于500ml三口烧瓶中,依次加入200ml浓氨水和15ml氧化石墨烯悬浮液,超声分散均匀后,将三口烧瓶转移到油浴锅中,在搅拌条件下90℃反应4h,自然冷却至室温,离心分离,用超纯水洗涤至滤液成中性,冻干,制得ng;
所述氧化石墨烯悬浊液制备方法如下:称取2.0g石墨粉,加入96ml浓硫酸,在搅拌条件下反应20min,随后加入12g高锰酸钾,在冰水浴条件下搅拌1.5h,随后加热至55℃,反应5h;缓慢加入100ml超纯水后,再加入10ml、质量分数30%的双氧水,搅拌30min,离心分离,上清液即为氧化石墨烯悬浮液;
(3)au@ptdns/ng/cu2+的制备
称取10mg上述制备的ng,分散在10ml、1mg/ml的au@ptdns分散液中,超声2h,离心分离,40℃下烘干得到au@ptdns/ng。取10mg的au@ptdns/ng分散在10ml超纯水中,加入1mmol/l氯化铜,在室温下搅拌24h,离心分离,40℃下烘干,制得au@ptdns/ng/cu2+;
(4)au@ptdns/ng/cu2+-ab2的制备
称取3mg的au@ptdns/ng/cu2+分散到1ml超纯水中,加入100µl、80µg/ml的检测抗体孵化物au@ptdns/ng/cu2+-ab2溶液和900µl、50mmol/l的ph=6.8的磷酸盐缓冲溶液,4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h,离心分离,重新分散于1ml、50mmol/l的ph=6.8的磷酸盐缓冲溶液,制得au@ptdns/ng/cu2+检测抗体ab2孵化物溶液,4℃下保存备用。
实施例8所述au@ptdns/ng/cu2+的制备,步骤如下:
(1)au@ptdns的制备
在烧瓶中配制10ml含0.25mmol/l氯金酸和75mmol/l十六烷基三甲基溴化铵的水溶液,剧烈搅拌下快速加入0.6ml、10mmol/l硼氢化钠,室温下缓慢搅拌3h后制得金水溶胶;量取1ml制得的金水溶胶超纯水稀释至100ml,制得金晶种溶液。
将0.3ml、10mmol/l氯金酸,2.5ml、0.2mol/l十六烷基三甲基溴化铵和1.8ml、0.1mol/l抗坏血酸的水溶液混合,在混合液中加入0.4ml金晶种溶液,超纯水稀释至25ml,在室温下振荡8h,制得立方金纳米粒子的溶液;在立方金纳米粒子的溶液中依次加入2ml、0.1mol/l抗坏血酸和1ml、10mmol/l氯亚铂酸钾,于60℃的水浴中反应12h,;离心,超纯水洗涤3次,于40℃真空干燥箱中烘干,制得au@ptdns;称取一定质量的au@ptdns超声分散到一定体积的超纯水中制成au@ptdns分散液使用;
(2)氮掺杂石墨烯ng的制备
称取30mg丙醛肟置于500ml三口烧瓶中,依次加入200ml浓氨水和15ml氧化石墨烯悬浮液,超声分散均匀后,将三口烧瓶转移到油浴锅中,在搅拌条件下90℃反应4h,自然冷却至室温,离心分离,用超纯水洗涤至滤液成中性,冻干,制得ng;
所述氧化石墨烯悬浊液制备方法同实施例7。
(3)au@ptdns/ng/cu2+的制备
称取10mg上述制备的ng,分散在15ml、1mg/ml的au@ptdns分散液中,超声2h,离心分离,40℃下烘干得到au@ptdns/ng;取10mg的au@ptdns/ng分散在10ml超纯水中,加入1.5mmol/l氯化铜,在室温下搅拌24h,离心分离,40℃下烘干,制得au@ptdns/ng/cu2+;
(4)au@ptdns/ng/cu2+-ab2的制备
称取5mg的au@ptdns/ng/cu2+分散到1ml超纯水中,加入100µl、100µg/ml的检测抗体孵化物au@ptdns/ng/cu2+-ab2溶液和900µl、50mmol/l的ph=6.8的磷酸盐缓冲溶液,4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h,离心分离,重新分散于1ml、50mmol/l的ph=6.8的磷酸盐缓冲溶液,制得au@ptdns/ng/cu2+检测抗体ab2孵化物溶液,4℃下保存备用。
实施例9所述au@ptdns/ng/cu2+的制备,步骤如下:
(1)au@ptdns的制备
在烧瓶中配制10ml含0.25mmol/l氯金酸和75mmol/l十六烷基三甲基溴化铵的水溶液,剧烈搅拌下快速加入0.6ml、10mmol/l硼氢化钠,室温下缓慢搅拌3h后制得金水溶胶;量取1ml制得的金水溶胶超纯水稀释至100ml,制得金晶种溶液。
将0.5ml、10mmol/l氯金酸,3ml、0.2mol/l十六烷基三甲基溴化铵和2.0ml、0.1mol/l抗坏血酸的水溶液混合,在混合液中加入0.5ml金晶种溶液,超纯水稀释至25ml,在室温下振荡8h,制得立方金纳米粒子的溶液;在立方金纳米粒子的溶液中依次加入3ml、0.1mol/l抗坏血酸和1ml、10mmol/l氯亚铂酸钾,于60℃的水浴中反应12h,;离心,超纯水洗涤3次,于40℃真空干燥箱中烘干,制得au@ptdns;称取一定质量的au@ptdns超声分散到一定体积的超纯水中制成au@ptdns分散液使用;
(2)氮掺杂石墨烯ng的制备
称取40mg丙醛肟置于500ml三口烧瓶中,依次加入200ml浓氨水和15ml氧化石墨烯悬浮液,超声分散均匀后,将三口烧瓶转移到油浴锅中,在搅拌条件下90℃反应4h,自然冷却至室温,离心分离,用超纯水洗涤至滤液成中性,冻干,制得ng;
所述氧化石墨烯悬浊液制备方法同实施例7;
(3)au@ptdns/ng/cu2+的制备
称取10mg上述制备的ng,分散在20ml、1mg/ml的au@ptdns分散液中,超声2h,离心分离,40℃下烘干得到au@ptdns/ng;取10mg的au@ptdns/ng分散在10ml超纯水中,加入3mmol/l氯化铜,在室温下搅拌24h,离心分离,40℃下烘干,制得au@ptdns/ng/cu2+;
(4)au@ptdns/ng/cu2+-ab2的制备
称取7mg的au@ptdns/ng/cu2+分散到1ml超纯水中,加入100µl、120µg/ml的检测抗体孵化物au@ptdns/ng/cu2+-ab2溶液和900µl、50mmol/l的ph=6.8的磷酸盐缓冲溶液,4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h,离心分离,重新分散于1ml、50mmol/l的ph=6.8的磷酸盐缓冲溶液,制得au@ptdns/ng/cu2+检测抗体ab2孵化物溶液,4℃下保存备用。
实施例10肺癌标志物cea的检测,步骤如下:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,所制备的传感器为工作电极,在10ml的ph为5.8~8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试;
(2)用计时电流法对分析物进行检测,输入电位为-0.4v,取样间隔为0.1s,运行时间为400s;
(3)当背景电流趋于稳定后,每隔50s向10ml的ph为6.8磷酸盐缓冲溶液中注入10µl、5m的双氧水,记录不同浓度下的肿瘤标志物抗原所对应的电流变化;
(4)利用工作曲线法,得到待测样品中肿瘤标志物抗原的浓度。
(5)根据所得电流强度与cea浓度之间的线性关系,绘制工作曲线,测得线性范围为0.0005~50ng/ml,检测限为0.167pg/ml。
实施例11肺癌标志物ca125的检测
按照实施例10的方法对样品中ca125进行检测,其线性范围为0.0001~50ng/ml,检测限为0.033pg/ml。
实施例12肺癌标志物scca的检测
按照实施例10的方法对样品中scca进行检测,其线性范围0.0005~100ng/ml,检测限为0.167pg/ml。