本发明涉及微流控芯片实验室、光镊微操纵技术、纳米光子学以及生物医学检测等交叉技术领域，尤其涉及一种基于微流控芯片的多功能光镊系统及方法。
背景技术：
常用的细胞分选方法有细胞筛分选法、离心分选法、激光诱导荧光分选法和磁分选法。商品化的流式细胞术通常采用激光诱导荧光检测，结合介电泳力分选的方法，而基于微流控芯片的流式细胞术能够将传统的细胞分选方法推广到微流控技术层面实现，利用外力的作用实现分选，如介电泳分选、磁力吸附、光力分选和声力分选，从而充分体现微流控芯片尺寸小、效率高、集成度高、分析速度快、价格低廉等特点。
光镊的概念最早由美国科学家ashkin于1970年提出，由一束高度会聚的高斯激光在焦点处产生足够强的光阱梯度力，对微米乃至纳米尺寸的粒子进行捕获和操纵。光镊技术采用非接触式遥控工作模式、无需加工微操控部件，且不会对被操控细胞产生机械损伤，因而成为在微流控芯片中对单细胞或其他粒子进行光学操控的最常用手段。
上转换发光纳米材料能吸收两个或多个低能光子而辐射一个高能光子，通常是将近红外光转换为可见光。其作为生物标记探针具有诸多优点，例如：低毒性、高化学稳定性、优异的光稳定性、窄带发射、长的发光寿命和高信噪比等；此外，近红外激光作为其激发光源带来了许多优势，例如：较深的光穿透深度，对生物组织几乎无损伤、无背景荧光等。
基于微球的悬浮芯片技术是指将抗体或其他生物分子固载在微球载体上制成捕获微球，然后处在悬浮状态的捕获微球特异性识别检测体系中不同的待检物质，最后与报告抗体或生物分子发生杂交或免疫反应，形成夹心结构。通过检测单个微球上的报告分子的信号如荧光、放射性、化学发光等来定量检测目标物的浓度。通过微球的尺寸编码、荧光编码等能够实现多种分析物的同时检测，该技术非常适用于微量样品的检测。
基于微流控芯片和上转换纳米标记技术，构建光镊分选体系在生物分析等领域有非常好的应用潜力，能够对复杂样品(如全血清、全血浆)中的多种生物分子如核酸、蛋白质等或者病毒粒子等待测物进行高灵敏检测，以及对肿瘤患者血样中循环肿瘤细胞(ctcs)进行检测、分选和分型，为癌症的早期诊断、疗效评估和癌症转移机制研究提供一种新的分析技术。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题在于针对现有技术中的缺陷，提供一种基于微流控芯片的多功能光镊系统及方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明提供一种基于微流控芯片的多功能光镊系统，该系统包括：微流控芯片微粒进样系统、计数系统、信号检测系统和光镊分选系统；其中：
微流控芯片微粒进样系统，用于通过流体动力学聚焦使微粒沿一定路径逐一经过微流控芯片，微流控芯片上预设有检测计数区和捕获分选区；
微粒通过检测计数区时，信号检测系统通过微弱光信号检测技术，实现微粒的发光信号和前向散射光信号的多参数同时表征，实现微粒的检测，并通过计数系统对微粒数量进行统计；
微粒通过捕获分选区时，根据微粒的检测结果，通过光镊分选系统对特定种类的微粒进行偏转，实现微粒的分选功能。
进一步地，本发明的微流控芯片设置有3路流入端和3路流出端，检测计数区和捕获分选区设置在流入端和流出端之间的位置；其中：
3路流入端中，两侧为鞘流，中间为微粒的样品流；样品流与鞘流同时流入检测计数区和捕获分选区，两侧的鞘流用于保证样品流在中间形成单个排列的微粒，微粒四周被鞘流围绕；
3路流出端中，中间为样品流的流出端(废液通道)，两侧为收集通道；通过光镊分选的微粒发生光镊偏转，通过收集通道流出。
进一步地，本发明的该系统还包括光源系统，光源系统包括led光源和激光光源；其中：
led光源产生白色led光，经过透镜聚焦后作为微粒的指示光源，指示光源从微流控芯片微粒进样系统的上方进行照射；
激光光源产生近红外激光，通过可调偏振式衰减器，将非偏振的近红外激光分解成两束不同的偏振光，包括p光和s光，并任意调整两束激光的能量比，两束偏振激光从微流控芯片微粒进样系统的下方进行照射。
进一步地，本发明的两束偏振激光中，s光通过声光调制器进行调制，声光调制器用于同时进行激光的强度和偏转角度的调制；p光和s光的聚焦光斑分别位于微流控芯片上的上游和下游，分别用作激发光源和捕获光源；s光再通过扩束系统，并由物镜聚焦形成光阱，光阱用于捕捉微粒。
进一步地，本发明的近红外激光器的波长为808nm、980nm或者1064nm。
进一步地，本发明的信号检测系统包括多个光电倍增管pmt和一个ingaas检测器，分别用于检测微粒的上转换发光和前向散射光信号，根据需要增加上转换发光信号检测通道数，构建多通道检测系统。
本发明提供一种基于微流控芯片的多功能光镊方法，包括以下步骤：
步骤一：将上转换荧光探针耦合到微粒表面，形成的单微粒悬浮液注入微流控芯片微粒进样系统的通道中，根据流动聚焦原理使样品流成单行通过检测计数区和捕获分选区；
步骤二：启动近红外激光器，经物镜聚焦后的激光，通过可调偏振式衰减器，将非偏振的近红外激光分解成两束不同的偏振光，包括p光和s光；通过相机或摄像机观察调整p光和s光的位置，并调整激光功率大小，使p光在通道内的上游与微粒作用，激发上转换发光信号，s光在下游形成光阱；
步骤三：根据上转换发光信号和前向散射光信号强度指示声光调制器进行光镊分选系统的开启或者关闭，使靶微粒受到光阱作用力进入收集通道，未受到光阱力作用的微粒则进入废液通道，从而进行实时计数、定量分析和对靶微粒的分选。
进一步地，本发明的探针为上转换纳米材料。
进一步地，本发明的进行检测的靶微粒类型包括：细胞、细胞外泌体，以及采用微球富集的核酸、蛋白、病毒、小分子和金属离子。
进一步地，本发明的进行分选的靶微粒类型为微小颗粒物，包括细胞或者微球。
本发明产生的有益效果是：本发明的基于微流控芯片的多功能光镊系统及方法，具有以下优点：
1、本发明将微流控芯片实验室、上转换材料标记生物样品与多功能光镊系统相结合，提出一种新型的分析检测装置，该装置可对多种待测物进行实时分析和分离。
2、本发明以小粒径的上转换发光纳米材料作为标记探针，对生物样品的损伤小。
3、本发明构建的多功能光镊系统能够对样品进行检测的同时实现分选，有很高的检测通量和分选的准确性。
4、本发明将单束激光分成p光和s光，避免使用双激光器，并且易于分别调节两束光的强度，简化了装置，降低了成本。
5、本发明将简单的白光led照明光源同时作为样品的指示光源。
6、本发明装置由于采用近红外激光来实现激发上转换纳米材料发光，只有激光聚焦焦点处出现强的上转换发光信号，克服了常规荧光检测方法中难以克服的自发荧光干扰，因此本方法用于复杂样品体系的分析时，提高了方法的抗干扰能力。此外，激光与微粒作用的前向散射光信号经分光镜能够准确的判断颗粒的出现。物理信号和化学信号的结合分析，便于进行精确的后续分选。
7、本发明装置由ingaas器件对较弱的近红外散射光信号进行检测，由光电倍增管对上转换发光信号进行检测。两种检测器都具有高信噪比、高灵敏度并且响应速度快等优点。
8、本发明装置通过相机(摄像机)观察视野，便于快速定位芯片通道探测区。
9、本发明用于生物样品的检测时，具有高通量、低背景、高灵敏度的特点。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1本发明装置结构示意图；
图2芯片设计图；
图3肿瘤标志物标记上转换纳米材料示意图；
图4细胞标记上转换纳米材料示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的具体实施例中，基于上转换发光纳米材料标记靶标的微流控芯片计数、检测和分选的多功能光镊系统，将微流控芯片实验室、上转换发光纳米材料标记生物靶标相结合构建多功能光镊系统，利用声光调制器对捕获激光进行偏转，从而实现集计数、检测与分选于一体的体系，并且能够应用到复杂样品(如全血清、全血浆)中的多种生物分子如核酸、蛋白质或者病毒粒子等待测物的高灵敏检测中，以及肿瘤细胞的分选与诊断等方面。
为了达到上述目的，本发明的基于微流控芯片的计数、检测与分选的多功能光镊系统，包括微流控芯片微粒(细胞、微球等)进样系统、前向散射光计数系统、上转换发光信号检测系统、光镊偏转分选系统。白光led光源经透镜聚焦后作为微粒的指示光源。由近红外激光器所发出的激光垂直进入可调偏振式衰减器(vpbs)，分成两束不同的偏振态光，反射光为s光，透过光为p光，p光经透镜组、反射镜后进入第二个可调偏振式衰减器，同时反射的s光经声光调制器(aom)和透镜组进入第二个可调偏振式衰减器，此时两束光都经反射镜和二色滤光片后进入20倍物镜后瞳，并由物镜聚焦后，p光实现微粒的上转换发光激发，称为检测激光，检测激光束由透镜组适当调整光束直径，使其最终由物镜聚焦于微通道内的光斑直径为15-20微米，s光由物镜聚焦形成光阱用于捕获样品微粒。p光作用在微粒上，前向散射光信号由聚光镜收集后经二色滤光片反射后进入偏振分光镜，然后由ingaas检测器检测，上转换发光信号则返回并透过二色滤光片被光电倍增管(pmt)检测，由信号检测系统(daq数据采集卡)结合上转换发光信号和前向散射光信号，在检测与计数的同时判断该微粒是否为靶标微粒，光镊偏转到达收集通道，未受到光阱力作用的微粒则进入废液通道，从而实现计数、检测和分选于一体的体系。
利用可调偏振式衰减器，将非偏振光分成两束偏振态光，可以衰减激光能量至实际所需的功率，也可以根据偏振态的光检测散射信号。可调偏振式衰减器半波片和偏振分光镜两种光学元件组成，在可调偏振式衰减器中有两个半波片，入射方的半波片起调节分束比的作用，出射方半波片起调节出射光偏振方向的作用。如果出射方的偏振方向满足需要，则出射方的半波片就可以省略不用。当一束非偏振光垂直入射时，分光镜会将其分成两束偏振光，偏振态互相垂直，反射光为s光，透过光为p光。s光和p光的能量比与入射光的偏振方向有关，因此改变入射光的偏振方向就可以改变p光和s光的能量比。
由分光镜分出的s光由声光调制器进行调制，声光调制器可以同时进行激光的强度与偏转角度的调制。
对同一近红外激光束分束形成的s光和p光的作用不同。p光和s光的聚焦光斑分别位于微通道内的上游和下游，分别用作激发光源和捕获光源。s光首先进入声光调制器，然后经透镜组扩束，并由物镜聚焦形成光阱。
所述近红外激光器适用于上转换发光信号的激发，波长为808nm、980nm或1064nm。
微流控芯片通道设计主要是基于流动聚焦样品，使样品微粒逐一通过检测区。
样品微粒由上转换纳米材料标记，近红外激光激发与检测，对生物样品的光损伤小。
检测与计数模块由光电倍增管检测上转换发光和ingaas检测器检测前向散射光，ccd(或cmos)相机(摄像机)用于成像观察。
声光调制器能够调制激光强度和方向，形成主动操控的光镊。
信号检测系统由多通道的数据采集卡和软件组成。
基于微流控芯片的计数、检测和分选的多功能光镊系统实现检测、分选生物靶标的方法，具体步骤如下：
步骤一，将上转换荧光探针耦合到微粒表面，将单颗粒悬浮液注入微流控芯片通道中，根据流动聚焦原理使样品成单行通过预设检测区；
步骤二，启动近红外激光器，经物镜聚焦后的激光，调整激光功率大小，p光在上游与微粒作用，确保激发上转换发光信号；s光在下游形成光阱；
步骤三，根据上转换发光信号和前向散射光信号强度指示声光调制器进行光镊的开启或者关闭，使靶标微粒进入收集通道，未受到光阱力作用的微粒则进入废液通道，从而进行实时计数、定量分析和对靶标微粒的分选。
本发明装置由白光led光源经透镜聚焦后作为样品微粒的指示光源。由波长为980nm半导体近红外光纤激光器所发出的激光经准直镜垂直进入可调偏振式衰减器(vpbs)，分成两束偏振态光，反射光为s光，透过光为p光，p光经透镜组和反射镜后进入第二个可调偏振式衰减器，同时反射的s光经声光调制器再经透镜组扩束后进入第二个可调偏振式衰减器，此时两束光都经反射镜和二色滤光片后进入20×物镜后瞳，由物镜聚焦后，p光用于细胞的上转换发光激发，称为检测激光，检测激光束由透镜组适当调整光束直径，使其最终由物镜聚焦于微通道内的光斑直径为15-20μm，s光由物镜聚焦形成光阱用于捕获样品微粒。p光作用在微粒上，散射光信号由聚光镜收集后经二色滤光片反射后进入偏振分光镜，然后由ingaas检测器检测，上转换发光信号则返回经二色滤光片被光电倍增管(pmt)检测，由信号检测系统结合上转换发光信号和前向散射光信号，在检测与计数的同时判断微粒是否为靶标，光镊偏转到达收集通道，未受到光阱力作用的微粒则进入废液通道，从而实现计数、检测与分选于一体的体系。
本发明采用上转换纳米材料标记待测物，可以采用不同发射波长的上转换发光材料进行标记，从而实现多种微粒的高通量同时检测。通过散射光和上转换发光信号实现待测物的识别。
本发明采用微流控芯片中流体动力学聚焦的方式将样品微粒聚焦在皮升级别的检测区，设计不同的分选通道实现不同待测物的分离。
本发明采用声光调制器aom实现主动操控的高通量分选模式。
下面列举实施例对本发明提出的检测与分选方法做进一步说明。
实施例1
肿瘤标志物甲胎蛋白afp和癌胚抗原cea的检测
将表面修饰羧基基团的不同大小的微球(3微米和5微米)，通过双位点夹心法分别富集afp和cea抗原，以上转换材料作为标记材料。
第一步，制备免疫编码微球。取表面羧基修饰的微球，先通过edc/nhs反应活化微球表面的羧基，然后在室温下分别偶联afp和cea单克隆抗体，得到免疫微球。
第二步，制备上转换探针。smcc活化表面氨基修饰的上转换材料，然后共价偶联另一种afp和cea单克隆抗体。
第三步，分别富集肿瘤标志物。用双位点一步法捕获抗原法，即在离心管中分别加入一定量的上述不同尺寸的免疫编码微球混合物，上转换纳米探针，以及afp和cea抗原。不同尺寸的免疫微球对应富集不同的抗原，得到编码微球复合物。
第四步，将上述编码微球复合物通过注射泵注入微流控芯片中，在鞘液夹流的作用下成单行通过检测区，近红外980nm激光激发产生上转换发光信号和散射光信号，由光电倍增管pmt收集上转换发光信号，ingaas检测器收集前向散射光信号。
第五步，定量分析。测定一定数量的不同浓度系列标准样品的微球的强度制作标准曲线，测定一定数量的未知样品微球，采用标准曲线法进行定量分析。
实施例2
乳腺癌细胞的分选/分型
根据乳腺癌细胞(例如：三种不同细胞系的乳腺癌细胞mcf-7、sk-br-3和mda-mb-453)的分型不同，采用绿色和红色两种上转换发光纳米材料对其表面的上皮细胞粘附分子(epcam)和人表皮生长因子受体-2(her2)进行双重标记，抗体与上转换纳米材料偶联再与待测样中靶细胞上抗原特异性结合形成“靶细胞-抗原抗体-上转换粒子”复合物，再通过光镊筛选富集。具体步骤如下：
第一步：制备上转换探针。smcc活化表面氨基修饰的两种不同发射波长的上转换纳米材料，然后分别共价偶联两种抗体，再与待测样中靶细胞形成“靶细胞-抗原抗体-上转换纳米粒子”复合物。
第二步：将待测样注入微流控芯片通道中，经流动聚焦使细胞成单行通过检测区，近红外980nm激光与细胞作用产生前向散射光和上转换发光信号，散射光信号用于计数，双通道发光信号强度用于判断细胞性质，经处理后发送指令由声光调制器aom对捕获激光进行调制，从而决定是否开启光镊将靶细胞偏转至分选通道。在检测上转换发光信号的瞬间，光镊激光处于关闭状态，当绿色信号显著时(mcf-7)，光镊捕获该细胞并短距离右移，同时关闭激光释放细胞，结果是细胞被带入右侧通道；当红色信号显著时(sk-br-3)，激光光镊捕获该细胞并短距离左移，同时关闭激光释放细胞，结果是细胞被带入左侧通道；红、绿信号均很弱时(mda-mb-453)，细胞会继续直线前进进入中间通道。
实施例3
细菌的检测与分选
根据单克隆抗体tem-1β-内酰胺酶和上转换纳米材料偶联的二抗选择性标记抗药菌，结合前向散射光信号对总菌计数，再利用光镊分选富集。具体步骤如下：
第一步：细菌标记。细菌先后与单克隆抗体tem-1β-内酰胺酶、共价偶联二抗绿色上转换发光材料孵育。
第二步：类似于实例2中第二步，通过前向散射光对细菌总数计数，通过上转换发光信号判断是否为抗药菌。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。