本发明涉及一种用于证实凉血通瘀方治疗脑出血调节脑肠互动的实验方法，属于中医药实验方法技术领域。
背景技术：
脑出血是指原发性非外伤性脑实质内出血，占所有卒中的10-30％，急性期病死率约30-40％，是一种致死率极高的脑血管病。中医药治疗脑出血在临床实践中具有优越性。
1.国医大师周仲瑛提出脑出血瘀热阻窍学说，创制凉血通瘀方
中风急性期常见阳明热结腑实证，通腑泻热是其治疗常法，通过“釜底抽薪”，令腑气一通，往往神清气明，病情逆转。
国医大师周仲瑛在此基础上，创新性地提出脑出血瘀热阻窍学说。认为本病系火热毒邪壅于血分，瘀热搏结，气火上冲，迫血上涌，灼伤脑络，络破血溢；同时因脑中蓄血，郁而化热，络热血瘀，进一步损害脑元。据此，确立凉血通瘀法，创制凉血通瘀方治疗，功效凉血散瘀、通腑泻热。方以熟大黄、水牛角为主药，熟大黄通腑泻热逐瘀，对于中风急性期之邪实证，不管是否有腑实证候，均可应用，剂量因病情而定，以下为度，达到“上病下取，以下为清”，予邪出路的目的；水牛角清热凉血，热清血自凉、血凉热自清。生地滋阴养血、凉血清热，赤芍、丹皮凉血活血散瘀，既可阻断血中之热煎熬成瘀，又可防瘀热生风化痰。石菖蒲芳香走窜，引药上行以达巅顶。通下瘀热，顺降气血，给邪以出路，是凉血通瘀方的主要功效特点。
前期评价凉血通瘀方治疗脑出血急性期的临床疗效，经168例观察，证实可减轻急性脑出血患者脑水肿，促进脑血肿吸收，改善神经功能缺损及预后，总有效率88.0％，优于单纯西医内科常规治疗组(169例)的77.5％(p<0.05)。
2.从脑肠互动研究凉血通瘀方治疗中风的作用机制引起关注
大脑与肠腑密切相关，中风发病后精明之腑受损，神明受扰，大肠传化失司，糟粕蓄积，难以排出，浊气不降，上逆为患，扰乱清明，损伤脑窍。通腑泻热是治疗本病的重要法则。其治疗作用有三：一是通降阳明，直折肝阳暴逆；二是上病下取，引导血热下行；三是借泻下之力，祛瘀化痰，推陈致新，使暴涨之风火痰瘀有其出路。如《内经》言：“一窍通则诸窍皆通，大官通则百官皆通”，说明腑气一通，则五脏“诸窍”、“百官”皆通。现代研究表明可以增加胃肠蠕动，降低颅压，减轻脑水肿；清除肠道有害物质，避免氨类吲哚内毒素进入血循环；改善脑肠肽对胃肠道的调节功能。
近年来，脑-肠轴的发现为研究通腑泻热法治疗中风等脑病的作用机制奠定了重要的生理解剖学基础，基于脑肠互动研究受到国内外学者的关注。如王永炎等认为探讨化痰通腑法治疗中风痰热腑实证的疗效机制主要应从调节脑-肠轴、抑制炎性反应等方面进行研究；吴犀翎等认为腑实便秘关乎脑血管病急性期的病情转归预后，脑肠肽中胆囊收缩素(cck)的改变为研究探讨胃肠道与脑的关系提供了物质基础。
3.脑-肠轴是脑肠互动的重要桥梁
脑-肠轴是实现脑与胃肠道系统关联的枢纽，主要包括中枢神经系统(cns)、自主神经系统(ans)和肠神经系统(ens)等结构，各部分功能相互协调，是临床从脑治肠及从肠调节脑功能的基础。
传统医学理论认为脑居巅顶之上，内聚精微，藏而不泄；肠居人体之下，传化糟粕，泄而不藏。中风后脑髓受损，脑主神明失职，大肠传化不能，糟粕蓄积，浊气上逆，扰乱清明。现代医学分析脑居颅内，与脊髓相连，通过椎管、椎间孔与腹腔相互影响，大便不通引起肠蠕动下降，腹腔压力升高，导致颅内压升高；大便传导障碍，毒素不能及时排出，血液有害物质蓄积，破坏脑内环境稳定，加重脑功能障碍。
脑-肠轴包括下行和上行两条通络。从脑到肠的下行通路：cns接收信息，整合后由神经-内分泌网络传到ens或直接作用于胃肠道平滑肌细胞，改变胃肠动力，激活肠黏膜免疫，影响肠屏障功能；从肠到脑的上行通路：ens通过神经、免疫、内分泌等通路将信息从胃肠道传递至脑。细胞因子、胃肠激素等经血液循环至丘脑，在弓状核处穿过血脑屏障，传递免疫、内分泌信号；ens、迷走神经传入纤维经结状神经节传递至孤束核、弓状核和丘脑。
4.脑肠肽是研究凉血通瘀方治疗脑出血的物质基础
近年来脑-肠轴的研究从消化系统涉及神经科学。由脑-肠轴介导的信号在中枢和外周间的传递，是联系中枢神经系统疾病与外周的重要途径。脑-肠轴各部分之间通过神经递质或肽类激素相互联系，维持机体神经-内分泌网络和内环境的平衡和稳定。脑肠肽的分泌与分布是脑肠互动的主要表现形式，双重分布于胃肠道和脑组织，具有神经递质和激素作用，参与多种神经系疾病的病理过程，是脑-肠轴研究的物质基础。
研究表明脑肠肽参与脑血管病的病理生理过程。脑出血脑肠肽水平变化可导致胃肠排空延迟，引起一系列胃肠道症状，急性期出现的腑实证候可能与脑肠肽水平变化有关。胆囊收缩素(cck)是一种典型的脑肠肽，以神经递质的形式调节脑肠反馈互动：脑内cck直接作用于孤束核内的胃肠神经元，在延髓水平调节胃肠功能；肠道cck作用于迷走传入神经元，刺激中枢神经，引起神经活动改变。在cck家族中，cck-8是发挥生物学效应最充分的活性片段，具有神经保护和修复作用，可以拮抗谷氨酸兴奋、激活γ-氨基丁酸受体、延缓细胞衰老、抗凋亡，促进神经元生长。
综上所述，凉血通瘀方是治疗脑出血的有效验方，其与开窍醒脑、减轻脑损害之间存在密切的内在联系。现代有关脑-肠轴的研究进展为破解这一问题奠定了重要的生理解剖学基础，机体通过脑-肠轴进行脑肠功能调节，形成脑肠互动，脑肠肽cck-8在这一互动中发挥重要作用。以凉血通瘀方对脑-肠轴信号通路的干预效应为主要观察指标，结合肠道动力功能改变及脑损害相关指标，研究凉血通瘀方在调节脑肠互动方面的机制。通过研究，为阐明名老中医验方的作用机制提供分子生物学基础，诠释通腑泻热法治疗中风的科学内涵，丰富上病下取、脑病治肠理论，对指导通腑泻热法治疗中风等脑病的临床应用具有重要的科学意义和临床价值。
技术实现要素：
解决的技术问题：本发明提供一种用于证实凉血通瘀方治疗脑出血调节脑肠互动的实验方法。
技术方案：本发明的一个技术方案为一种用于证实凉血通瘀方治疗脑出血调节脑肠互动的实验方法，其基本方法为：
检测脑出血大鼠肠道动力功能(排便作用、肠道平滑肌收缩力)，证实凉血通瘀方可增强胃肠动力，促进大便排出；加快肠道蠕动，促进肠道平滑肌收缩。
检测脑出血大鼠脑损害指标(行为学评分、脑组织血肿含量、脑组织含水量、血脑屏障通透性)，证实凉血通瘀方可改善神经功能缺损；促进血肿吸收；降低脑组织含水量，减轻脑水肿；改善血脑屏障通透性。
检测脑出血大鼠脑肠共有激素(脑肠肽)，证实凉血通瘀方可立即增加肠组织cck-8表达，进而增加血肿周围脑组织cck-8表达。
作为优选，具体步骤如下：步骤一.按照自体血注入法复制脑出血大鼠模型，造模成功后分层随机分为假手术组、模型组、凉血通瘀组，造模成功后分别于24h、72h、120h取三组大鼠，每时间点每组6只；
步骤二.制备凉血通瘀方煎剂，按照人体等效剂量灌胃；
步骤三.从排便作用、肠道平滑肌收缩力2个方面观察凉血通瘀方对脑出血大鼠肠道动力功能指标的影响，以确定本方具有加快肠道蠕动，增强肠道动力的作用；
步骤四.从行为学、脑组织血肿含量、脑组织含水量和血脑屏障通透性4个方面观察凉血通瘀方对脑出血大鼠脑损害指标的影响，以确定本方可减轻脑损害；
步骤五.采用免疫组织化学、elisa法检测凉血通瘀方对脑出血大鼠脑、肠组织共有激素脑肠肽cck-8指标，以确定本方可立即增加肠组织cck-8表达，进而增加血肿周围脑组织cck-8表达增加。
作为优选，在步骤三中从排便作用、肠道平滑肌收缩力2个方面观察凉血通瘀方对脑出血大鼠肠道动力功能指标的影响。
作为优选，在步骤四中从行为学、脑组织血肿含量、脑组织含水量和血脑屏障通透性4个方面观察凉血通瘀方对脑出血大鼠脑损害指标的影响。
作为优选，在步骤五中检测凉血通瘀方对脑出血大鼠脑、肠组织共有激素脑肠肽cck-8指标的影响。
作为优选，在步骤五中确定凉血通瘀方可立即增加肠组织cck-8表达，进而增加血肿周围脑组织cck-8表达增加。
有益效果：本发明所述实验方法能够检测脑出血大鼠肠道动力功能，脑出血大鼠脑损害指标，脑出血大鼠脑肠共有激素，从行为学、脑组织血肿含量、脑组织含水量和血脑屏障通透性4个方面观察凉血通瘀方对脑出血大鼠脑损害指标的影响，采用免疫组织化学、elisa法检测凉血通瘀方对脑出血大鼠脑、肠组织共有激素脑肠肽cck-8指标。
附图说明
图1为各组大鼠24h肠段平滑肌收缩波形图，图1中a为正常组，b为假手术组，c为模型组，d为凉血通瘀组；
图2为各组大鼠72h肠段平滑肌收缩波形图，图中a为正常组，b为假手术组，c为模型组，d为凉血通瘀组；
图3为各组大鼠120h肠段平滑肌收缩波形图，图中a为正常组，b为假手术组，c为模型组，d为凉血通瘀组；
图4为各组大鼠不同时间点肠道活力值图；
图5为假手术组血肿周围脑组织cck-8免疫组化染色(×400)，图中a为24h组，b为72h组，c为120h组；
图6为模型组血肿周围脑组织cck-8免疫组化染色(×400)，图中a为24h组，b为72h组，c为120h组；
图7为凉血通瘀组血肿周围脑组织cck-8免疫组化染色(×400)，图中a为24h组，b为72h组，c为120h组；
图8为假手术组肠组织cck-8免疫组化染色(×400)，图中a为24h组，b为72h组，c为120h组；
图9为模型组肠组织cck-8免疫组化染色(×400)，图中a为24h组，b为72h组，c为120h组；
图10为凉血通瘀组肠组织cck-8免疫组化染色(×400)，图中a为24h组，b为72h组，c为120h组。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
1自体血注入法复制脑出血大鼠模型
1.1动物分组
根据注入尾状核方式不同，随机数字表法将雄性sd大鼠分为3组：假手术组、模型组、凉血通瘀组。模型组、凉血通瘀组按自体血注入法造模；假手术组仅插针不注血。
1.2模型制备
①sd大鼠适应性饲养3～5天；②术前8h禁食，不禁水；③调整立体定向仪，确定门齿钩平面比耳间线平面低2.4mm；④10％水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉；⑤麻醉成功后，俯卧位固定在立体定向仪上，头部备皮，碘酚消毒，正中切开，骨膜剥离器剥离骨膜，确定前囟点，根据大鼠脑立体定位图谱定位右侧尾状核(前囟点右侧中线旁开3mm、冠状缝前0.2mm)；⑥多功能开颅钻接直径1mm牙科钻，轻轻钻开颅骨；⑦下肢翻转朝上固定，酒精反复擦洗尾根部腹侧，正中做一2～3cm纵行切口，分离尾动脉，取微量进样器穿刺尾动脉，抽取50μl动脉血；⑧将微量进样器固定于立体定位仪上，进针深度距离颅骨表面6mm，应用注射泵控制器于10min内匀速注入50μl血液(10μl/min)，注射完后留针10min，退针2mm，再留针5min，缓慢将进样器完全退出，注血过程中缝合尾部皮肤；⑨用骨蜡封闭针眼，缝合头部皮肤，碘酚消毒。
2凉血通瘀方煎剂制备及灌胃方法
药物组成：生大黄10g、水牛角30g、生地20g、赤芍15g、丹皮10g、石菖蒲10g。原材料购于安徽沪春堂中药饮片有限公司/苏州市博源药业有限公司，由南京中医药大学第三附属医院制剂室煎制。
药物制备：中药材统一购入，取水牛角浸泡30min，加10倍量蒸馏水煎煮沸腾后20min，加入生地、赤芍、丹皮、石菖蒲，加10倍量蒸馏水煎煮沸腾后10min，加入生大黄，继续煎煮沸腾10min，过滤，倒出药液，药渣再加入10倍量蒸馏水煎煮沸腾后10min，过滤，合并两次滤液，浓缩后作为原液置4℃冰箱保存备用。每毫升含生药1.2g。
根据如下公式计算大鼠给药剂量：大鼠喂饲剂量＝成人每日剂量(95g)/60×10倍×大鼠体重(kg)。
3凉血通瘀方对脑出血大鼠肠道动力功能的影响
从排便作用、肠道平滑肌收缩力2个方面观察凉血通瘀方对脑出血大鼠肠道动力功能指标的影响，以确定本方具有加快肠道蠕动，增强肠道动力的作用。
3.1实验方法
3.1.1排便作用
造模成功后给药3h后予印度墨汁2ml，单独置于标记好的代谢笼中观察，大鼠正常饮食。观察粪便性状(质硬、成形、稀软、不成形、稀水)；记录6h粪便总粒数、6h黑便粒数，并计算黑便百分比。
3.1.2肠道平滑肌收缩力
采用多导生理记录仪测定不同时间各组大鼠肠道平滑肌收缩力。具体步骤：
(1)按比例配置台式液：氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、葡萄糖；
(2)启动多导生理记录仪，加入台式液冲洗管道，调整氧气流量；
(3)打开生物机能实验系统，以5mg砝码进行定标，调零后设置量程为2mv，频率设置为低通道20hz；
(4)腹腔注射麻醉各组大鼠，剖开腹腔，定位回盲瓣，在回盲瓣上7cm处剪取1cm肠段，迅速放入预冷台式液中，用生理盐水冲洗干净，持续通入氧气；
(5)将冲洗干净的肠段固定于恒温37℃平滑肌槽内台式液中，一端连接张力换能器，调节生物机能实验系统，基础张力1000mg；
(6)及时更换台式液，观察肠道蠕动情况，出现稳定波形后记录保存；
(7)分别采集各组肠收缩频率、肠收缩振幅，按照如下公式计算：肠收缩活力值＝肠收缩频率×肠收缩振幅。
3.2实验结果
3.2.1排便作用观察
(1)大致观察各组大鼠粪便性状
假手术组为成形粪便，无明显质硬或稀软，模型组粪便多质硬或成形，凉血通瘀组粪便多成形或稀软，说明凉血通瘀方可通导大便，改变粪质。见表1。
(2)粪便总粒数、黑便粒数比较
灌胃印度墨汁6h后三组粪便总粒数无统计学差异(p均>0.05)，具有可比性。黑便粒数模型组(1.00±1.00)粒，与假手术组比较，p<0.05；模型组黑便百分比显著低于假手术组(p<0.01)；凉血通瘀组黑便百分比显著高于模型组(p<0.01)。以上结果揭示凉血通瘀方可增强胃肠动力，促进大便排出。见表1。
表1各组大鼠脑出血后排便情况观察
注：与假手术组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，##p<0.01。
3.2.2肠道平滑肌收缩力测定
(1)各组大鼠24h肠活力检测结果
肠收缩力频率比较，正常组收缩频率最高，明显多于假手术组、模型组、凉血通瘀组(p<0.01)。
收缩力振幅比较，正常组和假手术组明显高于模型组、凉血通瘀组(p均<0.01)；凉血通瘀组高于模型组(p<0.05)。
计算肠道活力值并进行比较，正常组和假手术组最高，凉血通瘀组高于模型组(p<0.01)。见表2、图1。
表2各组大鼠24h各组肠活力检测
注：与正常组比较，△△p<0.01；与假手术组比较，**p<0.01；与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01。
(2)各组大鼠72h肠活力检测结果
肠收缩力频率比较，模型组显著低于正常组和假手术组(p均<0.01)；凉血通瘀组高于模型组(p<0.05)。
收缩力振幅比较，模型组、凉血通瘀组显著低于正常组和假手术组(p均<0.01)；凉血通瘀组高于模型组(p<0.05)。
肠道活力值比较，模型组、凉血通瘀组显著低于正常组和假手术组(p均<0.01)；凉血通瘀组显著高于模型组(p<0.01)。结果见表3、图2。
表3各组大鼠72h各组肠活力检测
注：与正常组比较，△△p<0.01；与假手术组比较，**p<0.01；与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01。
(3)各组大鼠120h肠活力检测结果
120h后肠收缩力频率比较，正常组收缩频率最高，模型组显著低于正常组和假手术组(p<0.01)；凉血通瘀组基本接近正常组。
收缩振幅比较，模型组显著低于正常组和假手术组(p均<0.01)；凉血通瘀组显著高于模型组(p<0.01)。
肠道活力值比较，正常组和假手术组最高，模型组显著低于正常组和假手术组(p均<0.01)；凉血通瘀组显著高于模型组(p<0.01)。结果见表4、图3-4。
表4各组大鼠120h各组肠活力检测
注：与正常组比较，△△p<0.01；与假手术组比较，**p<0.01；与模型组比较，##p<0.01。
(4)各组大鼠不同时间点肠活力值比较
如图3-5所示：模型组肠道活力值最低，凉血通瘀方治疗后肠道收缩频率、收缩振幅、肠道活力值明显升高，揭示脑出血可导致肠蠕动减慢，肠道收缩力下降，而经凉血通瘀方治疗后可加快肠道蠕动，促进肠道平滑肌收缩。
3.3讨论
便秘是脑出血后常见并发症，目前脑卒中后出现的胃肠功能紊乱及其对患者预后的影响日益受到关注。脑-肠轴是中枢神经系统和肠神经系统联系起来的神经-内分泌网络。脑和大肠在生理上相互促进，病理上相互影响。
本实验发现模型组大鼠6h内排便粒数较假手术组明显减少(p<0.05)，粪质变硬，肠道收缩频率、收率振幅以及活力值均明显下降，说明脑出血可导致肠道排空延迟，肠道平滑肌收缩障碍，出现大便秘结。脑出血患者多存在肠道蠕动变慢，急性期病理性质为本虚标实，风、火、痰、瘀内结，气机逆乱、升降失调则阳明通降之职失司，积滞内停，燥矢内结；瘀热酿痰，痰热阻滞阳明，腑气益加不通，则可见到口干、口臭、腹胀、便秘等。现代研究证实脑出血后中枢神经系统受损，肠神经系统功能失调，抑制胃肠蠕动，减少肠道分泌液；加之病后卧床或脱水剂治疗，导致便秘发生。便秘反过来影响人体消化功能，促使胃肠毒性物质吸收入血，透过受损的血脑屏障，进入中枢神经系统；同时还可能增高腹内压，引起血压和颅内压升高，导致病情加重，甚至血肿扩大、再出血。
给予凉血通瘀方后，6h内大鼠排便粒数增多，与模型组比较(p<0.05)，粪质成形或稀软，肠道收缩频率、收缩振幅也得到改善，提示凉血通瘀方可促进肠道蠕动，促进肠道平滑肌收缩，缩短粪便在肠道时间。
4凉血通瘀方减轻脑出血大鼠脑损害指标的研究
4.1实验方法
从行为学、脑组织含水量、血脑屏障通透性和脑血肿含量4个方面观察凉血通瘀方对脑出血大鼠脑损害指标的影响，以确定本方可减轻脑损害。
4.1.1行为学评分
(1)longa五级评分法造模结束，待动物苏醒后按照longa五级评分法进行神经功能缺损评分，具体评分参照实验一。
(2)平衡木测验制作长80cm，宽2.5cm的平衡木，距离地面10cm。相应时间点评定神经功能缺损情况。
大鼠能跳上平衡木，行走不会跌倒，记0分；能跳上平衡木，行走跌倒机会<50％，记1分；能跳上平衡木，行走跌倒机会>50％，记2分；需健侧后肢协助跳上平衡木，但瘫痪侧后肢不能帮助前移，记3分；可坐在平衡木上，不能移动，记4分；不能坐在平衡木上，掉落下来，记5分。
4.1.2血肿含量测定
在正常大鼠脑组织匀浆中分别加入0、10、20、40、80μl外源性血液，采用drabkin’s试剂，检测单位脑组织匀浆中血红蛋白含量，建立标准浓度曲线。在脑出血后24h、72h和120h，分别检测凉血通瘀组和模型组大鼠血肿周围脑组织中血红蛋白的含量，以对血肿进行定量检测。
4.1.3脑组织含水量测定
采用干湿重法测定脑含水量。动物麻醉后，开颅取脑后，小心剥离硬脑膜，取出脑组织，用过滤纸将脑表面液体擦干。沿中线将脑组织切成两半，再沿穿刺针眼纵切一刀可见血肿，取血肿周围脑组织150mg(湿重)，置于100℃-110℃的烤箱中，烘烤24h至恒重后称重(干重)。根据elliot公式计算脑组织含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％。
4.1.4血脑屏障通透性检测
(1)eb标准曲线制作称取eb4mg置于容量瓶中，加生理盐水至总容积为25ml，取0.3ml于试管中，加入5.7ml甲酞胺混匀，作为第1管；从第1管取3ml加入3ml甲酞胺，作为第2管；从第2管取3ml加入3ml甲酞胺，作为第3管；依次类推，共作7管，其浓度分别为8，4，2，1，0.5，0.25，0.125μg/ml，60℃孵育24h后酶标仪测值。分别测定脑出血后1h、3h、6h、12h和24h脑组织的eb含量(μg/g湿重脑组织)。
(2)血脑屏障通透性采用甲酰胺法测定。动物处死前1h经尾静脉注入2％eb(2ml/kg)，麻醉后心内灌注生理盐水200ml～300ml，迅速断头取脑，解剖显微镜下去除额极和枕极各2mm，左右半球分开，称取右半球湿重后置于甲酞胺(1mg/100g脑组织)中。60℃孵育24h。1000rpm离心5min，酶标仪测定上清液值。根据标准曲线计算出eb含量。
4.2实验结果
4.2.1行为学评分
各组大鼠行为学评分比较，与假手术组比较，模型组大鼠在3个时间点神经功能均有明显缺损(p均<0.01)；凉血通瘀组在第24h、72h亦有明显神经功能缺损(p均<0.01)。
与模型组比较，凉血通瘀组在脑出血72h、120h，神经功能明显改善，缺损评分明显低于模型组(p<0.05，p<0.01)，说明凉血通瘀方可改善脑出血大鼠神经功能缺损。见表5。
表5各组大鼠行为学评分(
注：与假手术组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01。
4.2.2脑组织血肿含量
模型组和凉血通瘀组在脑出血后24h血肿含量相似；72h凉血通瘀组(21.71±7.31)μl，显著低于模型组脑血肿含量(27.52±6.43)μl；120h时凉血通瘀组(16.53±6.28)μl，显著低于模型组(24.17±7.21)μl(p均<0.01)。结果提示凉血通瘀方可以明显促进脑组织血肿吸收。见表6。
表6模型组和凉血通瘀组大鼠脑组织血肿含量(
注：与模型组比较，##p<0.01。
4.2.3脑组织含水量
模型组脑组织含水量在脑出血后3个时间点均高于假手术组(p均<0.01)，以72h达到高峰。凉血通瘀组脑组织含水量在24h高于假手术组(p<0.05)；72h达到高峰，显著高于假手术组、模型组(p均<0.01)；120h与假手术组相比无统计学差异，与模型组相比，p<0.01，具有显著统计学差异。
结果说明脑出血后72h脑组织含水量达到高峰，经凉血通瘀方治疗可降低脑组织含水量，减轻脑水肿。见表7。
表7各组大鼠脑组织含水量(
注：与假手术组比较，*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较，##p<0.01。
4.2.4脑组织内eb含量及血脑屏障通透性
脑组织内eb含量如表2-4所示，脑出血后模型组和凉血通瘀组大鼠血肿周围组织内的eb含量明显上升，到72h达到最高水平，两组24h和72h的eb含量均明显高于假手术组(p均<0.01)。
与模型组相比，凉血通瘀组各时间点eb含量则显著下降(p均<0.01)，且在脑出血后120h，凉血通瘀组大鼠的eb含量和假手术组已无统计学差异，提示凉血通瘀方可明显改善脑出血后血脑屏障通透性。见表8。
表8各组大鼠血肿周围组织内eb含量(
注：与假手术组比较，**p<0.01；与模型组比较，##p<0.01。
4.3讨论
本实验采用凉血通瘀方治疗脑出血，观察对实验大鼠脑血肿、脑水肿等的影响。凉血通瘀方以熟大黄、水牛角为君药，熟大黄通腑泻热逐瘀，对于中风邪实证，不管是否有腑实证候，均可应用，剂量因病情而定，以下为度，达到“上病下取，以下为清”，予邪出路的目的；水牛角清热凉血，热清血自凉、血凉热自清。生地滋阴养血、凉血清热，赤芍、丹皮凉血活血散瘀，既可阻断血中之热煎熬成瘀，又可防瘀热生风化痰。石菖蒲芳香走窜，开窍豁痰，引药上行以达巅顶。通下瘀热，顺降气血，给邪以出路，是凉血通瘀方的主要功效特点。
实验结果显示本方可明显促进血肿吸收，在治疗72h和120h凉血通瘀组大鼠脑血肿含量明显低于模型组(p<0.01)，且未出现再出血现象。凉血通瘀方可通脉散瘀，行血散血，消散脑中有形蓄血，畅通周身血行，具有“通瘀”作用，以免郁酿生热，耗灼阴津，有效防止动风。本方可明显减轻脑出血大鼠脑水肿，改善血脑屏障通透性。在脑出血后72h，模型组和凉血通瘀组脑组织含水量均达到最高水平，但与模型组相比，凉血通瘀组大鼠脑组织含水量明显降低(p<0.01)。同时，凉血通瘀组在脑出血24h到72h大鼠脑组织eb含量虽然高于假手术组，但均显著低于模型组(p<0.01)。凉血通瘀方通下瘀热，顺降气血，“釜底抽薪”，给邪以出路，可有效阻止瘀热燔灼阴津，酿湿生痰。
此外，神经功能缺损评分结果显示凉血通瘀组在脑出血后120h其神经功能缺损程度明显低于模型组，提示该方可以保护脑出血大鼠神经受损，并改善神经功能，且与课题组前期报道一致。
5凉血通瘀方对脑肠肽cck-8的影响
5.1实验方法
研究凉血通瘀方对脑出血大鼠脑、肠组织cck-8的影响，证实本方可增加脑肠肽cck-8合成。
5.1.1免疫组织组化法检测各组大鼠脑、肠组织cck-8的表达
(1)将组织芯片在60℃恒温箱中烘烤2h；
(2)脱蜡：二甲苯脱蜡15min，三次；
(3)水化：依次经过无水乙醇、95％、90％、80％、70％，各5min，蒸馏水5min；
(4)pbs(洗液c-0079)洗5min，三次；
(5)抗原修复：枸橼酸缓冲液修复，约92-95℃，沸水浴修复15min，凉至室温；pbs洗5min，三次；
(6)3％双氧水消化内源性过氧化物酶，20min，pbs洗5min，三次；
(7)正常山羊血清(包含在sp-0023中)封闭，37℃20min；
(8)一抗孵育，4℃过夜(抗体稀释液c-0007)；
(9)pbs洗5min，三次；
(10)二抗孵育，37℃20min(二抗为生物素标记的羊抗兔igg，包含在sp-0023中)，pbs洗5min，三次；
(11)三抗孵育，37℃20min(三抗为辣根酶标记的链霉亲和素，包含在sp-0023中)，pbs洗5min，三次；
(12)dab(显色剂c-0010)显色，显微镜下观察结果，适时终止；
(13)苏木素(c-0021)复染5min，冲洗，1％的盐酸酒精(75％)溶液(配制比例为：100ml75％酒精+1ml浓盐酸)分化30s，冲洗5min，蓝化；
(14)脱水：经过70％、80％、90％、95％无水乙醇，5min，二甲苯15min，三次；
(15)封片：中性树胶(c-0073)封片；
(16)染色观察：阳性染色为胞浆或胞核棕黄色颗粒；阴性细胞核为蓝色。
(17)图像分析：将染好的切片在生物显微镜下放大10×40倍，脑组织以血肿周围按顺时针方向选取不重叠的5个视野，肠组织选取肠粘膜不重叠的3个视野，采用imageproplus软件计算area、iod数值，以iod/area值为平均光密度值。
5.1.2elisa法检测各组大鼠脑、肠组织cck-8的表达
(1)标本采集
各组大鼠在相应时间点10％水合氯醛腹腔注射麻醉，完全麻醉后迅速断头取脑，冰上将脑组织分块放入冻存管内，置于液氮中保存转移。取血肿周围脑组织，加入裂解液ripa(每100mg组织中加入1mlripa)匀浆，1000转离心15min，收集上清，-20℃保存备用。
(2)取出elisa试剂盒室温放置30min，用前轻摇将所有试剂混匀。
(3)标准品稀释：取出100ul标准品，加入100ul稀释液并标记，充分混匀；从混合液内取100ul加入另一标记ep管内，再加入100ul稀释液混匀；依次步骤重复只到第五只ep管，第六只ep管内只加入稀释液。
(4)将各浓度稀释液分别取40ul加入酶标包被板内，标记为标准孔，且每个浓度设2个平行孔。在酶标包被板空白孔内加入待测样品40ul，标记为待测孔。然后再加生物素标记的抗il-1β抗体10ul，用移液器吹打混匀。
(5)用封板膜封板后放置37℃孵育30min。期间将浓缩洗涤液用双蒸水稀释后备用。
(6)小心揭掉封板膜，甩弃其中液体，每孔加满洗涤液后静置30秒，甩弃液体，如此重复5次后拍干。
(7)每孔加入酶标试剂50ul，空白孔出除外。
(8)用封板膜封板后放置37℃孵育30min，揭掉封板膜，甩弃液体，加满洗涤液，静置30秒，甩弃液体，重复5次后拍干
(9)每孔依次加入显色剂a50ul、显色剂b50ul，震荡混匀，37℃避光显色15min。
(10)加入终止液50ul终止反应。在酶标仪上测450nm波长处吸光度(od值)，计算样本浓度。
5.2实验结果
5.2.1各组大鼠脑组织、肠组织cck-8表达(免疫组化法)
(1)各组大鼠血肿周围脑组织cck-8表达
①血肿周围脑组织cck-8免疫组化染色
假手术组形态学观察：表达阳性主要分布在胞膜、胞浆、胞核中，表达无明显随时间变化趋势。见图5。
模型组形态学观察：表达阳性主要分布在胞膜、胞浆、胞核中，表达在72h明显增多，在120h下降，类似于24h组。见图6。
凉血通瘀组形态学观察：表达阳性主要分布在胞膜、胞浆、胞核中，表达在72h明显增多，在120h虽有下降，但表达强于24h组。见图7。
②血肿周围脑组织cck-8免疫组化评分
各组大鼠24h脑组织cck-8表达，经方差分析f＝0.504，p＝0.632，无统计学差异。
各组大鼠72h脑组织cck-8表达，经方差分析f＝6.832，p＝0.028<0.05，有统计学差异。采用lsd法进行多重比较，凉血通瘀组显著高于假手术组(p<0.01)，高于模型组(p<0.05)。
各组大鼠120脑组织cck-8表达，经方差分析f＝5.965，p＝0.037<0.05，有统计学差异。采用lsd法进行多重比较，凉血通瘀组高于模型组(p<0.05)。见表9。
以上结果揭示：脑出血后脑组织cck-8表达升高，至72h达到高峰，后逐渐下降。72h凉血通瘀组高于模型组、假手术组；120h凉血通瘀组虽有下降，但仍高于模型组，凉血通瘀方可增加脑组织cck-8表达。
表9各组大鼠脑组织cck-8平均光密度值比(
注：与假手术组比较，**p<0.01；与模型组比较，#p<0.05。
(2)各组大鼠肠组织cck-8表达
①肠组织cck-8免疫组化染色
假手术组形态学观察：表达阳性主要分布在肠粘膜上皮细胞中，无明显随时间变化趋势。见图8。
模型组形态学观察：表达阳性主要分布在肠粘膜上皮细胞中，表达无明显随时间变化趋势。见图9。
凉血通瘀组形态学观察：表达阳性主要分布在肠粘膜上皮细胞中，表达在各时间点均增多。见图10。
②肠组织cck-8免疫组化评分
各组大鼠24h肠组织cck-8表达，经方差分析f＝17.930，p＝0.005<0.01，有显著统计学差异。采用lsd法多重比较，凉血通瘀组高于假手术组、模型组(p<0.01，p<0.05)。
各组大鼠72h肠组织cck-8表达，经方差分析f＝9.916，p＝0.018<0.05，有统计学差异。采用dunnettst3法进行多重比较，凉血通瘀组高于假手术组(p<0.05)。
各组大鼠120肠组织cck-8表达，经方差分析f＝5.062，p＝0.063，无统计学差异。见表10。
表10各组大鼠肠组织cck-8平均光密度值比(
注：与假手术组比较，**p<0.01；与模型组比较，#p<0.05。
以上结果揭示：脑出血后肠组织cck-8表达立即升高，72h后逐渐下降，24h、72h凉血通瘀组高于假手术组，凉血通瘀方可立即增加肠组织cck-8表达。
5.2.2各组大鼠脑、肠组织、血清cck-8表达(elisa法)
(1)脑组织cck-8含量
各组大鼠24h脑组织cck-8含量，经方差分析f＝0.707，p＝0.575，无统计学差异。
各组大鼠72hcck-8含量，经方差分析f＝5.551，p＝0.023<0.05，采用lsd法多重比较，凉血通瘀组高于正常组、假手术组(p均<0.05)，显著高于模型组(p<0.01)。
各组大鼠120h脑组织cck-8含量，经方差分析f＝4.609，p＝0.037<0.05，有统计学差异。采用lsd法多重比较，模型组低于正常组、假手术组(p均<0.05)；凉血通瘀组显著高于模型组(p<0.01)。见表11。
表11各组大鼠脑组织cck-8含量(
注：与正常组比较，△p<0.05；与假手术组比较，*p<0.05；与模型组比较，##p<0.01。
以上结果揭示，随着病程进展，脑出血后脑组织cck-8含量逐渐下降，凉血通瘀方治疗脑出血120h后可升高cck-8水平。
(2)肠组织cck-8含量
各组大鼠24h肠组织cck-8含量，经方差分析f＝5.241，p＝0.027<0.05，有统计学差异，采用lsd法多重比较，凉血通瘀组显著高于正常组(p<0.01)，高于假手术组、模型组(p均<0.05)。
各组大鼠72h肠组织cck-8含量，经方差分析f＝9.941，p＝0.004<0.01，有显著统计学差异，采用lsd法多重比较，模型组显著低于正常组(p<0.01)，低于假手术组(p<0.05)，凉血通瘀组显著高于模型组(p<0.01)。
各组大鼠120h肠组织cck-8含量，经方差分析f＝2.617，p＝0.123，无统计学差异。见表12。
表12各组大鼠肠组织cck-8含量(
注：与正常组比较，△△p<0.01；与假手术组比较，*p<0.05；与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01。
以上结果揭示：脑出血后肠组织cck-8含量逐渐下降，至72h模型组显著降低；凉血通瘀方治疗脑出血24h即出现cck-8升高，至72h达到高峰，120h基本恢复正常。
(3)血清cck-8含量
各组大鼠24h血清cck-8含量，经方差分析f＝0.383，p＝0.796，无统计学差异。
各组大鼠72h血清cck-8含量，经方差分析f＝6.220，p＝0.017<0.05，有统计学差异。采用lsd法多重比较，凉血通瘀组显著低于假手术组、模型组(p均<0.01)。
各组大鼠120h血清cck-8含量，经方差分析f＝2.304，p＝0.164，无统计学差异。见表13。
表13各组大鼠血清cck-8含量(
注：与假手术组比较，**p<0.01；与模型组比较，##p<0.01。
以上结果揭示：凉血通瘀方治疗脑出血72h后血清cck-8明显下降，至120h基本恢复正常。
5.3讨论
凉血通瘀方具有通腑泻热作用，临床发现服用本方后患者腹胀腹痛不显，大便次数稍有增加，极少发生脑出血后便秘等并发症。脑和大肠在在生理上互通，脑中精汁下降于肠，以养大肠腑；大肠浊物排出需有时，浊降清自升；病理上相互关联，便秘可影响脑的功能，脑主神明功能失职，易出现肠功能紊乱。
脑-肠轴包括神经、免疫、炎症和内分泌的信号转导通路，副交感神经，交感神经、肠神经系统以及神经内分泌因子在其中发挥重要作用。中枢神经系统通过脑-肠轴把脑内分泌系统、肠神经平滑肌系统及免疫系统有机联系在一起。中枢神经系统通过影响胃肠激素的分泌及免疫功能影响胃肠功能，而胃肠功能的异常又可通过胃肠与神经系统的共有激素即脑肠肽与免疫系统影响神经系统。
脑出血的发生、发展过程与cck-8密切相关。原因在于脑出血后颅内压增高，脑部血液动力学发生一系列变化，ca2+通道开放，兴奋性氨基酸释放增加，产生自由基，破坏细胞膜，而中枢神经系统以cck-8为主，导致cck-8合成和释放增加。本研究结果显示凉血通瘀方干预脑出血大鼠后，肠组织cck-8含量24h立即升高(p<0.05)，至72h达到高峰，120h基本恢复正常；随着病程进展，脑组织cck-8含量逐渐变化，至120h后可升高cck-8水平(p<0.05)。脑组织cck-8含量变化晚于肠组织cck-8含量，体现“脑肠联动”变化。
现代研究发现脑肠肽八肽胆囊收缩素(cck-8)广泛分布于消化系统(十二指肠、空肠及结肠)和中枢神经系统(大脑皮层、海马、杏仁核、下丘脑、脊髓等)，以神经递质的作用形式调节机体生理病理过程。主要通过靶器官和肠神经系统系统上的cck受体发挥作用：调节并促进胆囊收缩、胆道口括约肌舒张、刺激胰腺分泌、抑制胃酸分泌、促进远端十二指肠及空肠蠕动、增加结肠动力、调节饱胀感。cck-8可使远段结肠紧张性收缩松弛，位相性收缩增加，从而使远段结肠蠕动加强；而给大鼠丘脑室旁核内注射cck-8，可明显刺激加快结肠蠕动。cck-8可以拮抗谷氨酸兴奋、激活gaba受体、延缓细胞衰老、抗凋亡，可促进神经元的生长，对神经元具有一定的保护作用。脑出血后颅内血肿及脑水肿是神经元死亡的主要病理因素，兴奋性氨基酸神经毒性是其主要机制之一，而cck-8对谷氨酸具有拮抗作用，其分泌增加可拮抗谷氨酸所致的神经细胞胞体、细胞膜肿胀及破溃，轴突、树突断裂丢失，线粒体肿胀、数目减少等损害，从而抑制谷氨酸对大脑产生毒性作用；cck-8还可通过激活gaba受体阻断与谷氨酸有关的ca2+内流，增加脑血流，降低脑代谢，保护脑组织，间接发挥保护作用。同时，cck-8可使神经细胞微突起数量增加，延长微突起的存留时间，减少细胞质空间的脂褐素，延缓细胞衰老，减少细胞凋亡，因此脑出血后cck-8分泌增加可延长因血肿压迫受损的神经细胞的突起存留时间，避免神经细胞凋亡。另外，cck-8可抑制no大量生成，拮抗细胞外ca2+内流作用，抑制胞浆内ca2+浓度升高对一氧化氮合酶的激活，发挥神经保护作用。