本发明涉及一种用于小鼠精母细胞染色体铺展的方法。
背景技术：
精母细胞减数分裂的研究是细胞遗传学中的重要领域，虽然早就确立了减数分裂染色体减半的原理，但由于精母细胞或卵母细胞都呈组织状态，从中取出减数分裂的细胞进行染色体研究并不容易。因此，对减数分裂过程中染色体形态变化的研究，在相当长的历史时期里停滞不前。六十年代以来，由于在制片方法上的改进和各种新技术的应用，使体细胞染色体的研究有了飞速的发展，也为进一步研究生殖细胞染色体开创了新的途径。
但是现有的制片方法中存在步骤繁琐，所需试剂种类繁多，还有刺激性有毒试剂，所获得的分裂相分散较差，背景杂质多等问题，影响观察效果，在一定程度上限制了对减数分裂进程的深入研究。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种用于小鼠精母细胞染色体铺展的方法。该方法可使小鼠精母细胞染色体的分散良好，可在显微镜下观察到每条染色体的形态特征。
本发明采取的技术方案为：
一种用于小鼠精母细胞染色体铺展的方法，包括以下步骤：将小鼠睾丸破碎处理后并过滤离心后，以nacl溶液作为低渗液；以多聚甲醛和十二烷基硫酸钠的pbs混合液作为固定液将小鼠精母细胞固定于玻片上；然后以小鼠sycp3单克隆抗体为一抗，dylight549荧光标记的山羊抗小鼠igg二抗为二抗，采用激光共聚焦显微镜观察小鼠精母细胞染色体铺展情况并记录分裂相。
所述nacl溶液的质量浓度为0.2～0.75％。此浓度范围的氯化钠溶液相对于细胞质渗透势是低渗液，而且配制简单方便，如果氯化钠的浓度过高则低渗效果较差，耗时较长，如果浓度过低细胞吸水过快，容易将细胞胀破。
所述多聚甲醛和十二烷基硫酸钠的pbs混合液中的多聚甲醛的质量浓度为1～4％；十二烷基硫酸钠的质量浓度为0.01～0.5％。本发明中利用1～4％多聚甲醛作为固定液，多聚甲醛对细胞的穿透能力强，对抗原物质保存效果较好，可快速将组织细胞固定在离体之前的状态，使染色体的形态及其上蛋白在离体之后不再发生变化；其浓度需要控制在1～4％的范围之内，如果浓度过高容易改变抗原的空间构象，不利于荧光染色，过低则导致固定不彻底，蛋白抗原容易降解；此外，以多聚甲醛作为固定液还减少了实验过程的刺激性气味；为了增强染色体的分散效果本发明在固定液中添加了0.01～0.5％阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(sds)，主要目的是借助sds将染色体分散开，sds的浓度需控制在0.01～0.5％范围之内，浓度过高会将相邻细胞内的染色体分散到一起去，过低则分散效果不好，染色体较集中。
进一步地，用于小鼠精母细胞染色体铺展的方法具体包括以下步骤：
s1：取一侧小鼠睾丸的1/3，加入3～5mlpbs溶液，利用剪刀将睾丸组织剪碎，利用巴氏吸管反复吹打，所得溶液过滤、离心；
s2：弃去离心液得到沉淀细胞，沉淀细胞中加入3～5mlpbs溶液，利用巴氏吸管重新悬浮沉淀细胞，然后离心；
s3：弃去上清液得到沉淀细胞，向沉淀细胞中加入2～4ml质量浓度为0.2～0.75％nacl溶液，重悬细胞，并静置5～20分钟；
s4：利用巴氏吸管打匀细胞悬液，吸10～100μl悬液滴加载玻片上，用另一张玻片反复折回两次，晾干；
s5：将晾干的玻片放入含有质量浓度为1～4％多聚甲醛和质量浓度为0.01～0.5％十二烷基硫酸钠的pbs混合液中2～20分钟；
s6：将玻片再次放入含有质量浓度为1～4％多聚甲醛的pbs溶液中1～10分钟；
s7：将玻片放入photo～flo200溶液中3～5分钟，取出晾干；
s8：向玻片上滴加50～100μl封闭液，室温封闭1～2小时；
s9：弃封闭液，滴加稀释的小鼠sycp3单克隆抗体作为一抗，37℃烘箱中孵育1～2小时；
s10：弃一抗，利用pbs清洗3遍，滴加稀释的dylight549荧光标记的山羊抗小鼠igg二抗作为二抗，37℃烘箱中孵育1小时；
s11：弃二抗，利用pbs清洗3遍，载玻片中央加1～2滴抗荧光淬灭剂，加盖盖玻片封片；
s12：利用激光共聚焦显微镜，在激发波长549nm下，观察并记录分裂相即可。
所述步骤s1中，利用孔径大小为100～250目的滤网过滤。
所述步骤s1和s2中，离心的参数为600～1200转/分钟，离心5～15分钟。
所述步骤s7中，photo～flo200溶液的质量浓度为0.01～1％。photo～flo200为去水渍剂，其浓度需控制在0.01～1％的范围内，浓度过低会使玻片残留部分水渍痕迹，背景观察会较模糊，不利于分裂相的观察；浓度过高会不利于染色体与玻片的粘附，在后续过程会丢失染色体，会导致实验误差。
所述步骤s8中，封闭液为质量浓度为1～5％bsa溶液。bsa作为抗原封闭液，浓度需控制在1～5％的范围内，浓度过低会导致非特异性位点封闭不彻底，在孵育一抗时导致抗体特异性下降，观察过程会使背景加深，不利于观察；浓度过高导致目的抗原也会部分被覆盖，导致抗体灵敏度降低，荧光强度变弱，也会不利于观察。
进一步地，所述步骤s9具体包括以下步骤：弃封闭液，滴加1:50～1:500稀释的小鼠sycp3单克隆抗体50～100μl作为一抗，37℃烘箱中孵育1～2小时。
进一步地，所述步骤s10具体包括以下步骤：弃一抗，利用pbs清洗3遍，滴加1:500～1:1000稀释的dylight549荧光标记的山羊抗小鼠igg二抗50～100μl作为二抗，37℃烘箱中孵育1小时。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)从实验人员安全角度考虑，利用1～4％多聚甲醛替代了常规的甲醇：冰乙酸＝3:1作为固定液，减少了实验过程中有毒试剂的使用；
(2)利用0.2～0.75％nacl代替了配制繁琐的heb低渗液，简化了实验操作流程，大大缩短了实验时间；
(3)通过对细胞悬液过滤离心减少了细胞溶液中的杂质，降低了背景；
(4)在固定液中添加十二烷基硫酸钠促进染色体的分散，能够更清楚的观察每一条染色体的形态特征，为研究和分析精母细胞的减数分裂进程或相关疾病发病机制提供便利。
此外，本发明公开的用于小鼠精母细胞染色体铺展的方法还可适用于大鼠、兔、羊、人等睾丸组织标本精母细胞染色体的铺展，只需在铺展的过程中替换相应种属的一抗和二抗即可。
附图说明
图1为利用实施例1中的方法得到的小鼠精母细胞染色体显微镜照片(放大倍数10*40)；
图2为利用比较例1中的方法得到的小鼠精母细胞染色体显微镜照片(放大倍数10*40)。
具体实施方式
本发明中所涉及的pbs溶液ph为7.2～7.4，所含各物质的含量分别为：nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l。
小鼠sycp3单克隆抗体购买自santacruz公司；
dylight549荧光标记的山羊抗小鼠igg二抗购买自abbkine公司；
photo～flo200购买自kodak公司；质量浓度为0.01～1％的photo-flo200的制备方法为：将购买的photo～flo200原液加入到0.01～1％质量浓度所需相应体积的pbs溶液中，从而配制成photo-flo200工作液。
质量浓度为1～5％的bsa封闭液的制备方法为：将bsa加入到1～5％质量浓度所需相应体积的pbs溶液中，从而配制成bsa工作液。
实施例1
一种用于小鼠精母细胞染色体铺展的方法，包括以下步骤：
s1：在室温25±2℃的环境下，颈椎脱臼法处死8周龄以上雄性小鼠，腹面向上，利用剪刀和镊子将其腹腔解剖开，在腹腔底部阴囊部位取出一侧睾丸，置于一次性塑料培养皿中，用pbs溶液清洗掉其上的血液；取一侧睾丸的1/3，加入2mlpbs溶液，利用剪刀将睾丸组织剪碎，利用巴氏吸管反复吹打，将所得溶液利用孔径大小为200目的滤网过滤到15ml离心管中，放入离心机800转/分钟，离心10分钟；
s2：取出离心管，将上清倒掉，加入3mlpbs溶液，利用巴氏吸管重新悬浮沉淀细胞，按步骤s1离心参数再离心一次；
s3：取出离心管，弃去上清液得到沉淀细胞，向沉淀细胞中加入2ml质量浓度为0.5％nacl溶液，重悬细胞，室温静置5-20分钟；
s4：利用巴氏吸管打匀细胞悬液，吸20μl悬液滴加载玻片上，用另一张玻片反复折回两次，晾干；
s5：将晾干的玻片放入含有质量浓度为2％多聚甲醛和质量浓度为0.03％十二烷基硫酸钠的pbs混合液中7分钟；
s6：将玻片再次放入含有质量浓度为2％多聚甲醛的pbs溶液中5分钟；
s7：将玻片放入质量浓度为0.4％的photo～flo200溶液中5分钟，取出晾干；
s8：向玻片上滴加80μl质量浓度为2％的bsa封闭液，室温封闭2小时；
s9：弃封闭液，滴加1:350稀释的小鼠sycp3单克隆抗体80μl作为一抗，37℃烘箱中孵育1.5小时；
s10：弃一抗，利用pbs溶液清洗3遍，滴加1:800稀释的dylight549荧光标记的山羊抗小鼠igg二抗80μl作为二抗，37℃烘箱中孵育1小时；
s11：弃二抗，利用pbs溶液清洗3遍，载玻片中央加1～2滴抗荧光淬灭剂，加盖盖玻片封片；
s12：利用激光共聚焦显微镜，在激发波长549nm下，观察并记录分裂相即可。所得显微照片如图1所示，从图中可以清楚看到每条染色体的形态特征。
实施例2
一种用于小鼠精母细胞染色体铺展的方法，包括以下步骤：
s1：在室温25±2℃的环境下，颈椎脱臼法处死8周龄以上雄性小鼠，腹面向上，利用剪刀和镊子将其腹腔解剖开，在腹腔底部阴囊部位取出一侧睾丸，置于一次性塑料培养皿中，用pbs溶液清洗掉其上的血液；取一侧睾丸的1/3，加入4mlpbs溶液，利用剪刀将睾丸组织剪碎，利用巴氏吸管反复吹打，将所得溶液利用孔径大小为200目的滤网过滤到15ml离心管中，放入离心机1000转/分钟，离心5分钟；
s2：取出离心管，将上清倒掉，加入4mlpbs溶液，利用巴氏吸管重新悬浮沉淀细胞，按步骤s1离心参数再离心一次；
s3：取出离心管，弃去上清液得到沉淀细胞，向沉淀细胞中加入3ml质量浓度为0.75％nacl溶液，重悬细胞，室温静置5分钟；
s4：利用巴氏吸管打匀细胞悬液，吸100μl悬液滴加载玻片上，用另一张玻片反复折回两次，晾干；
s5：将晾干的玻片放入含有质量浓度为4％多聚甲醛和质量浓度为0.4％十二烷基硫酸钠的pbs混合液中10分钟；
s6：将玻片再次放入含有质量浓度为4％多聚甲醛的pbs溶液中5分钟；
s7：将玻片放入质量浓度为0.8％的photo～flo200溶液中4分钟，取出晾干；
s8：向玻片上滴加100μl质量浓度为3.5％的bsa封闭液，室温封闭1～2小时；
s9：弃封闭液，滴加1:100稀释的小鼠sycp3单克隆抗体100μl作为一抗，37℃烘箱中孵育2小时；
s10：弃一抗，利用pbs溶液清洗3遍，滴加1:500稀释的dylight549荧光标记的山羊抗小鼠igg二抗100μl作为二抗，37℃烘箱中孵育1小时；
s11：弃二抗，利用pbs溶液清洗3遍，载玻片中央加1～2滴抗荧光淬灭剂，加盖盖玻片封片；
s12：利用激光共聚焦显微镜，在激发波长549nm下，观察并记录分裂相即可。
实施例3
一种用于小鼠精母细胞染色体铺展的方法，包括以下步骤：
s1：在室温25±2℃的环境下，颈椎脱臼法处死8周龄以上雄性小鼠，腹面向上，利用剪刀和镊子将其腹腔解剖开，在腹腔底部阴囊部位取出一侧睾丸，置于一次性塑料培养皿中，用pbs溶液清洗掉其上的血液；取一侧睾丸的1/3，加入5mlpbs溶液，利用剪刀将睾丸组织剪碎，利用巴氏吸管反复吹打，将所得溶液利用孔径大小为200目的滤网过滤到15ml离心管中，放入离心机1200转/分钟，离心5分钟；
s2：取出离心管，将上清倒掉，加入5mlpbs溶液，利用巴氏吸管重新悬浮沉淀细胞，按步骤s1离心参数再离心一次；
s3：取出离心管，弃去上清液得到沉淀细胞，向沉淀细胞中加入4ml质量浓度为0.3％nacl溶液，重悬细胞，室温静置20分钟；
s4：利用巴氏吸管打匀细胞悬液，吸50μl悬液滴加载玻片上，用另一张玻片反复折回两次，晾干；
s5：将晾干的玻片放入含有质量浓度为3％多聚甲醛和质量浓度为0.1％十二烷基硫酸钠的pbs混合液中15分钟；
s6：将玻片再次放入含有质量浓度为3％多聚甲醛的pbs溶液中8分钟；
s7：将玻片放入质量浓度为0.8％的photo～flo200溶液中3分钟，取出晾干；
s8：向玻片上滴加70μl质量浓度为2％的bsa封闭液，室温封闭1小时；
s9：弃封闭液，滴加1:500稀释的小鼠sycp3单克隆抗体100μl作为一抗，37℃烘箱中孵育2小时；
s10：弃一抗，利用pbs溶液清洗3遍，滴加1:1000稀释的dylight549荧光标记的山羊抗小鼠igg二抗100μl作为二抗，37℃烘箱中孵育1小时；
s11：弃二抗，利用pbs溶液清洗3遍，载玻片中央加1～2滴抗荧光淬灭剂，加盖盖玻片封片；
s12：利用激光共聚焦显微镜，在激发波长549nm下，观察并记录分裂相即可。
比较例1
一种用于小鼠精母细胞染色体铺展的方法，包括以下步骤：
s1：在室温25±2℃的环境下，颈椎脱臼法处死8周龄以上雄性小鼠，腹面向上，利用剪刀和镊子将其腹腔解剖开，在腹腔底部阴囊部位取出一侧睾丸，置于一次性塑料培养皿中，用pbs溶液清洗掉其上的血液；取少量睾丸组织放于heb缓冲液中，室温低渗1小时；
s2：向载玻片上滴加两滴0.1m的蔗糖溶液，取出低渗后的睾丸组织，置于一滴蔗糖溶液中，洗掉残余低渗液，然后转移至第二滴蔗糖溶液中，用镊子将睾丸组织扯碎，制成单细胞悬液；
s3：用含有0.2％tritonx-100的1％多聚甲醛冲洗预先用3:1甲醇冰乙酸处理过的载玻片，待玻片上液体分布均匀后，取10μl细胞悬液于玻片一角，用另一张玻片反复折回数次，放入水平湿盒中，室温放置6-10小时；
s4：取出玻片，室温干燥30分钟，然后放入质量浓度0.01％photo～flo200浸泡2分钟，取出晾干；
s5：向玻片上滴加100μl质量浓度为1％的bsa封闭液，室温封闭1～2小时；
s6：弃封闭液，滴加1:200稀释的小鼠sycp3单克隆抗体150μl作为一抗，37℃烘箱中孵育1.5小时；
s7：弃一抗，利用pbs溶液清洗3遍，滴加1:800稀释的dylight549荧光标记山羊抗小鼠igg二抗150μl作为二抗，37℃烘箱中孵育1小时；
s8：弃二抗，利用pbs溶液清洗3遍，载玻片中央加1～2滴抗荧光淬灭剂，加盖盖玻片封片；
s9：利用激光共聚焦显微镜，在激发波长549nm下，观察并记录分裂相即可。所得显微照片如图2所示，从图中不能清楚看到每条染色体的形态特征，且背景较为模糊。
上述参照实施例对一种用于小鼠精母细胞染色体铺展的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。