用于肺癌早期筛查的生物标志物的制作方法

本发明涉及医学检测领域，特别是在血液中进行的蛋白相关的医学检测方法，用于进行疾病，特别是肺癌的早期筛查及预防。和与其相关联疾病的风险的生物标志物及其用途。
背景技术：
：癌症一直是困扰人类的巨大难题，世界卫生组织官方网站上指出，全球每年新发现肿瘤患者将从每年1000万增加到1500万。2014年初发布的《2013中国肿瘤登记年报》显示，我国每年新发肿瘤病例约为312万例，平均每天8550人，这意味着每分钟就有6人被诊断为恶性肿瘤。这些数据都表明，癌症依然是威胁我们健康的一大杀手。无论在中国还是世界范围，肺癌都是对人们造成危害最严重的癌症种类之一。在世界范围内，仅2012年一年，就有超过180万肺癌新发病例。同样在2012年，全世界大约有160万因肺癌造成的死亡病例。在中国，肺癌位列男性癌症种类发病率和死亡率的双料第1名，位列女性癌症种类发病率的第2名和死亡率的第1名。肺癌造成严重危害最重要的原因是早期发现的概率太低，而肺癌的五年生存率与肺癌被发现时的分期息息相关：从肺癌分期的ib到iia、iib、iiia、iiib和iv，五年生存期分别为50％、43％、36％、25％、19％、7％和2％。临床实际应用的肺癌的早筛早诊手段是胸透和ct。原理均是通过x射线成像监控胸腔内是否有异常小结节。现有文献报道ldct筛查可以减低因肺癌引发的死亡率，是目前最认可的临床筛查方法。该方法的整体的灵敏度(检出的肺癌病人数占参与检测的所有肺癌病人数百分比)高达90％，但在中央型肺癌的灵敏度低于40％。对筛查鳞癌和小细胞癌的筛查作用有限。ldct筛查的特异性(检测判断出非肺癌病人数占参与检测的所有非肺癌病人数百分比)不理想，其假阳性率(误诊率)高达94％左右。即使应用了其他相关的排除方法，实际误诊率也在20％左右。高误诊率和长达2-3年的随访计划，以及患者长期的精神紧张。很大比例的筛查对象并不能依从这样长期的随访。在ldct筛查的基础上还需要其他的体外诊断的方法进行辅助筛查。肺部结节90％以上都是良性结节，目前临床上ct探测到小结节后确诊的方式一般为活体穿刺，之后由病理科进行组织或者细胞病理检验以确诊是否为肺癌。然而活体穿刺是一项有风险的手术，其容易引起气胸等术后并发症。同时，若小结节真的是恶性肿瘤，那么穿刺还可能带来人为引发的肿瘤转移。临床上需要在ct和病理诊断之间设立新的非侵入性的辅助检查方式，帮助医生得到更准确的诊断。目前有多种潜在的生物标记物尝试进行辅助诊断。但是其效果良莠不齐，我们按照靶标类型进行如下分类：1.肿瘤抗原。随着肿瘤的形成和瘤体积的不断增大，许多肿瘤相关的蛋白或其片段在血液中不断增多。通过检测这些抗原，可以预测患者是否为癌症。但是肿瘤抗原的灵敏度和特异性均较差。另外只有当肿瘤发展到一定体积，血液中肿瘤抗原的浓度才能够达到相对可以检测的程度。但此时也许已经错过了肿瘤发展的早期阶段。另外，随着肿瘤的发生发展，其肿瘤抗原的种类和数量也会发生变化，其作为疾病指标也会实时变化，不是一个优良的指标。2.microrna。与肿瘤抗原类似，血液中的microrna也会随肿瘤的形成的发展而发生变化。肿瘤细胞中的microrna会随外泌体被运送到血液循环中，并稳定存在。目前有很多利用microrna进行肺癌早筛早诊的报道，但是这些报道中筛出的microrna彼此之间的重复度非常低。另外，血液中抽提microrna是一项技术含量高，稳定性差的技术，而且对抽提出的microrna进行定量是个难题。目前还没有公认的可以作为内参的标准来对microrna进行定量。因此，microrna作为肺癌检测还有很多技术问题和原则性问题需要解决。以上2种生物标记物在肺部炎症中也有升高，也造成了临床上的高误诊率。3.ctdna/ctc。ctdna是游离于细胞外的肿瘤dna，ctc是游离于实体瘤之外存在于血液中的肿瘤细胞，检测到ctdna或ctc往往意味着患癌风险的增加。然而，与microrna或肿瘤抗原类似，ctdna或ctc的含量与肿瘤的发生发展直接相关，即当其达到相应的检测限以上时，肿瘤可能已经发展到了较后阶段。ctdna的应用场景更适合肿瘤发生后的指导用药，ctc更适用于治疗后的复发监控，它们对于肿瘤的早期筛查的效用可能有限。4.其他检测方法，如呼出气中有机物的质谱检查、痰液检测、唾液检测的方式，虽然具有一定的组织特异性，但是其全面性有限，另外这些检测方式也需要肿瘤发展到较后阶段，不利于早期筛查。因此，找到能够提供关于肺癌以及与该疾病相关联的特征的诊断性的标记物具有重大的临床意义。近来，出现了对临床实践具有重大影响的标记物——自身抗体。自身抗体(aab，autoantibody)：在疾病发生发展过程中，细胞会表达一些异常蛋白，这些异常情况包括蛋白突变、异常修饰、从空间的角度组织分布上的异常表达、从时间角度的异常表达、表达量异常等等，这些蛋白被生物体体液免疫系统识别，并生成对应于自身而非外源成分的抗体，这样的抗体叫做自身抗体。从原理上，自身抗体本身就具有早期发现癌症的优势。肿瘤早期发生的肿瘤免疫机理可以分为3个阶段：免疫抑制、免疫平衡和肿瘤生长。癌细胞发生初期，免疫系统仍旧可以识别这一异常细胞的表达，并对其进行杀灭，肿瘤一直处于被压制的状态，不能成长变大，这一阶段称为肿瘤抑制。随着免疫系统对肿瘤细胞的选择和肿瘤细胞自身逐渐发展出免疫抑制，肿瘤细胞与免疫系统达到一个动态平衡，肿瘤细胞初步在体内稳定下来。紧接着，随着时间的延长，肿瘤细胞一方面在免疫系统的压力下经历了更久的选择，另一方面随着瘤体的形成具备更完备的免疫抑制环境，肿瘤开始生长变大再后期甚至出现转移。前述的很多肿瘤早期筛查相关的生物标志物，都是在肿瘤成长之后才容易检测。而自身抗体在肿瘤形成的第一阶段——免疫抑制阶段就开始形成。在此阶段，不可能通过ct/胸透等方式发现小结节，因为小结节还未形成。但是在这一阶段起，免疫系统就已经识别并对肿瘤异常蛋白生成对应抗体。另外，由于自身抗体属于体液免疫，因此抗体在血液中的浓度会一直维持在较为稳定的水平，比其他肿瘤标志物随着肿瘤的生长发生而发生变化更适合作为肿瘤标志物。因此，对于肺癌早筛早诊来说，自身抗体检测比其他检测方法具备天然的优势。利用自身抗体进行肺癌早筛早诊，国际上已经有一款非常著名的检测试剂盒——来自于oncoimmune的earlycdtlungcancerdetectionkit。这个试剂盒通过对7个自身抗体的检测对早期肺癌进行筛查。然而，遗憾的是，这个试剂盒的检测特异性虽然能高达90％，其灵敏度仅30％，会有70％的肺癌患者被漏诊。国内也有一款通过自身抗体进行肺癌早诊的试剂盒，就是凯保罗公司的肺癌早期诊断试剂盒，虽然其报道的灵敏度有60％，但经过我们的试剂验证，其灵敏度也就只有30％-40％之间。这样的灵敏度不被临床医生认可。因此，还需要找到以与所述肺癌具有更强相关性而对肺癌具有预测性的自身抗体，从而改善现有的肺癌早期诊断工具。技术实现要素：本发明人现在发现了用于肺癌诊断，特别是肺癌早期诊断的生物标志物及其组合，特别是抗原蛋白和/或抗原蛋白组合，并且使用本发明所提供生物标志物组(特别是抗原蛋白和/或抗原蛋白组合)对肺癌患者检测的灵敏度和特异性都优于目前报道的抗原组合的效果。具体来说，本发明提供的生物标志物组包括一组自身抗原，通过抗原抗体相互作用检查个体血液中含有其对应的自身抗体的含量来诊断肺癌。其中检测抗原所用的方法包括蛋白芯片、免疫荧光分析、金标免疫分析、酶联免疫反应(elisa)、时间分辨荧光免疫分析、电化学发光免疫分析、流式荧光和液相芯片等等。在本发明的一个方面，本发明提供的生物标志物包括以下27个抗原蛋白中的至少个：表1：更具体地，本发明通过蛋白芯片的方式，对57个肿瘤抗原进行筛选，得到了多个肿瘤抗原蛋白的组合，通过数据计算，拟定每个抗原蛋白的阈值。经过验证，在本发明提供的多个抗原蛋白中，有任一抗原蛋白高于阈值，均可判定患者患癌。最终得到灵敏度和特异性符合诊断要求的自身抗体检测用抗原蛋白组合。具体而言，本发明对于抗原蛋白阈值的确定是通过如下方式：将蛋白芯片数据中每种蛋白的3个技术重复数据取平均，经中位值数据归一后，利用ibmspssstatistics19软件获取蛋白的roc曲线和最优阈值。在具体的实施方式中，使用本发明提供的生物标志物对肺癌的判定：在蛋白芯片平台上，27个生物标志物(抗原蛋白)中有任一抗原蛋白的信号高于阈值，即判定此患者为肺癌。更具体而言，所述阈值如下：表2：抗原蛋白阈值抗原蛋白阈值bmi10.56mmp70.83hud2.52c-反应蛋白1.32magea119.02α-烯醇化酶12.50细胞周期蛋白d11.55ptbp30.97p530.95ttc140.99膜联蛋白i2.48birc39.68braf2.06magea41.57pgam13.34ubqln23.54rpsa4.21edb10.98cage6.57ny-eso-16.88bard17.38gbu4-51.4314-3-34.30pgp9.53.17sox20.42p624.05gage70.98优选地，所述蛋白芯片是huprottm人类蛋白质定制芯片。进一步地，本发明按三个角度对数据进行过滤：灵敏度≥80％且特异性≥80％(意义：约登系数较高)；灵敏度≥60％且特异性≥90％(意义：高特异性)；或者灵敏度≥85％且特异性≥60％(意义：高灵敏度)，将所有数据整合在一起，限定每个生物标志物组中抗原蛋白数不超过10个。计算在每个角度中每种蛋白在组合中出现的次数，蛋白出现次数除以每个角度中蛋白的总数得到每种蛋白在每个角度的组合中的比重。将比重≥60％的蛋白选出，分析每种蛋白在三个角度中比重≥60％的条件下出现的次数，并排序，选取前6名的蛋白bmi1、mmp7、hud、c-反应蛋白、magea1、α-烯醇化酶为核心蛋白，列出其所有的排列组合，共63组(表3)。约登指数(youdenindex)：也称正确指数，是评价筛查试验真实性的方法，假设其假阴性(漏诊率)和假阳性(误诊率)的危害性同等意义时，即可应用约登指数。约登指数是灵敏度与特异度之和减去1。表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力。指数越大说明筛查实验的效果越好，真实性越大。灵敏度/特异性数值的标准：国内凯保罗公司的肺癌早期诊断试剂盒的数据：灵敏度40％-60％特异性90％；国外的earlycdt-lungcancerdetectionkit实际数值为灵敏度30％-40％，特异性80％-90％。本发明进行筛选的设定数值高于这两个现有技术中的产品，从而筛选出更好的可用于肺癌诊断，特别是肺癌早期诊断的生物标志物组。表3本发明在一方面，提供了用于肺癌诊断，特别是肺癌早期诊断的生物标志物组，其包括表1所示27个抗原蛋白中的至少1个，或至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，或至少6个，或至少7个，或至少8个，或至少9个，或至少10个，或至少11个，或至少12个，或至少13个，或至少14个，或至少15个，或至少16个，或至少17个，或至少18个，或至少19个，或至少20个，或至少21个，或至少22个，或至少23个，或至少24个，或至少25个，或至少26个，或者全部27个。优选地，所述生物标志物组用于蛋白芯片、免疫荧光分析、金标免疫分析、酶联免疫反应、时间分辨荧光免疫分析、电化学发光免疫分析、流式荧光或液相芯片。在该方面的一个实施方案中，在蛋白质芯片上对来自患者血液中的所述抗原蛋白进行检测，所述生物标志物组的任一组中的至少任一抗原蛋白的信号高于该抗原蛋白在表2中所示的阈值时，即判定此患者为肺癌。优选地，所述蛋白芯片是huprottm人类蛋白质定制芯片；优选地，所述生物标志物组的任一组中的所有抗原蛋白的信号高于该抗原蛋白在所述表中所示的阈值时，即判定此患者为肺癌。在一个具体的实施方式中，本发明提供了生物标志物组，其中至少一个抗原蛋白选自表4：表4一个具体的实施方式中，本发明提供了生物标志物组，其包括所述抗原蛋白中的2-10个，并且至少2个抗原蛋白是选自表5的组中的2个抗原蛋白：表5并且，优选地所述生物标志物组包括所述抗原蛋白中的3-10个。在该实施方式中，优选地所述生物标志物组在诊断中具有灵敏度≥80％且特异性≥80％；灵敏度≥60％且特异性≥90％；或者灵敏度≥85％且特异性≥60％。在一个具体的实施方式中，本发明提供了生物标志物组，其包括所述抗原蛋白中的3-10个，并且至少3个抗原蛋白是选自表6的组中的3个抗原蛋白：表6并且，优选地所述生物标志物组包括所述抗原蛋白中的4-10个。在该实施方式中，优选地所述生物标志物组在诊断中具有灵敏度≥80％且特异性≥80％；灵敏度≥60％且特异性≥90％；或者灵敏度≥85％且特异性≥60％。在一个具体的实施方式中，本发明提供了生物标志物组，其包括所述抗原蛋白中的4-10个，并且至少4个抗原蛋白是选自表7的组中的4个抗原蛋白：表7α-烯醇化酶、bmi1、c-反应蛋白、hudα-烯醇化酶、bmi1、c-反应蛋白、mmp7α-烯醇化酶、bmi1、c-反应蛋白、magea1α-烯醇化酶、bmi1、hud、mmp7α-烯醇化酶、bmi1、hud、magea1α-烯醇化酶、bmi1、mmp7、magea1α-烯醇化酶、c-反应蛋白、hud、mmp7α-烯醇化酶、c-反应蛋白、hud、magea1α-烯醇化酶、c-反应蛋白、mmp7、magea1α-烯醇化酶、hud、mmp7、magea1bmi1、c-反应蛋白、hud、mmp7bmi1、c-反应蛋白、hud、magea1bmi1、c-反应蛋白、mmp7、magea1bmi1、hud、mmp7、magea1c-反应蛋白、hud、mmp7、magea1并且，优选地所述生物标志物组包括所述抗原蛋白中的5-10个。在该实施方式中，优选地所述生物标志物组在诊断中具有灵敏度≥80％且特异性≥80％；灵敏度≥60％且特异性≥90％；或者灵敏度≥85％且特异性≥60％。在一个具体的实施方式中，本发明提供了生物标志物组，其包括所述抗原蛋白中的5-10个，并且至少5个抗原蛋白是选自表8的组中的5个抗原蛋白：表8magea1、mmp7、bmi1、c-反应蛋白、hudmagea1、mmp7、bmi1、c-反应蛋白、α-烯醇化酶magea1、mmp7、bmi1、hud、α-烯醇化酶magea1、mmp7、c-反应蛋白、hud、α-烯醇化酶magea1、bmi1、c-反应蛋白、hud、α-烯醇化酶mmp7、bmi1、c-反应蛋白、hud、α-烯醇化酶并且，优选地所述生物标志物组包括所述抗原蛋白中的6-10个。在该实施方式中，优选地所述生物标志物组在诊断中具有灵敏度≥80％且特异性≥80％；灵敏度≥60％且特异性≥90％；或者灵敏度≥85％且特异性≥60％。在一个具体的实施方式中，本发明提供了生物标志物组，其包括所述抗原蛋白中的6-10个，并且至少6个抗原蛋白是选自表9的组中的9个抗原蛋白：表9magea1、mmp7、bmi1、c-反应蛋白、hud、α-烯醇化酶并且，优选地所述生物标志物组包括所述抗原蛋白中的7-10个。在该实施方式中，优选地所述生物标志物组在诊断中具有灵敏度≥80％且特异性≥80％；灵敏度≥60％且特异性≥90％；或者灵敏度≥85％且特异性≥60％。在一个具体的实施方式中，本发明提供了生物标志物组，其选自表10中的一组：表10在另一方面，本发明提供了本发明所述的生物标志物组在制备用于诊断肺癌试剂盒中的用途，特别是肺癌早期诊断。优选地，所述试剂盒用于蛋白芯片、免疫荧光分析、金标免疫分析、酶联免疫反应(elisa)、时间分辨荧光免疫分析、电化学发光免疫分析、流式荧光或液相芯片。在另一方面，本发明提供了本发明所述的生物标志物组在制备蛋白芯片中的用途，所述蛋白芯片用于肺癌诊断，特别是肺癌早期诊断，其中在蛋白质芯片上对来自患者血液中的所述抗原蛋白进行检测，所述生物标志物组的任一组中的至少任一抗原蛋白的信号高于该抗原蛋白在表2中所示的阈值时，即判定此患者为肺癌，优选地，所述蛋白芯片是huprottm人类蛋白质定制芯片；优选地，所述生物标志物组的任一组中的所有抗原蛋白的信号高于该抗原蛋白在表2所示阈值时，即判定此患者为肺癌。在本发明的另一个方面中，提供了用于肺癌诊断，特别是肺癌早期诊断试剂盒，其包括本发明所述的生物标志物组。优选地，所述试剂盒用于蛋白芯片、免疫荧光分析、金标免疫分析、酶联免疫反应(elisa)、时间分辨荧光免疫分析、电化学发光免疫分析、流式荧光或液相芯片。在本发明的进一步的一个方面中，提供了用于肺癌诊断，特别是肺癌早期诊断的蛋白芯片，其包括本发明所述的生物标志物组，其中在蛋白质芯片上对来自患者血液中的所述抗原蛋白进行检测，所述生物标志物组的任一组中的至少任一抗原蛋白的信号高于该抗原蛋白在表2中所示的阈值时，即判定此患者为肺癌，优选地，所述蛋白芯片是huprottm人类蛋白质定制芯片；优选地，所述生物标志物组的任一组中的所有抗原蛋白的信号高于该抗原蛋白在所述表所示阈值时，即判定此患者为肺癌。在本发明的一个方面中，本发明的另一目的是提供了用于诊断个体中肺癌的方法，其包括在从来自个体的血液样品中进行本发明所述生物标志物的检测，并且其中一种或多种生物标志物(抗原蛋白)的存在表明存在肺癌。更具体而言，当在从来自个体的血液样品中检测的本发明所述的一种或多种生物标志物(抗原蛋白)的量达到具体的阈值，则表明存在肺癌。在该方面的一个实施方案中，本发明中检测抗原所用的方法包括蛋白芯片、免疫荧光分析、金标免疫分析、酶联免疫反应(elisa)、时间分辨荧光免疫分析、电化学发光免疫分析、流式荧光和液相芯片等等。在该方面的一个实施方案中，本发明的方法在蛋白芯片平台上进行。优选地，本发明的方法在huprottm人类蛋白质定制芯片上进行。在该方面的一个实施方案中，在蛋白质芯片上对来自患者血液中的所述抗原蛋白进行检测，所述生物标志物组的任一组中的至少任一抗原蛋白的信号高于该抗原蛋白在表2所示的阈值时，即判定此患者为肺癌。优选地，所述生物标志物组的任一组中的所有抗原蛋白的信号高于该抗原蛋白在表2中所示的阈值时，即判定此患者为肺癌。根据本发明的详细描述以及实施例，进一步的目的将是清楚的。以下实施例将被认为是本发明的说明性的，并不限制其相应的范围。附图说明图1：显示部分芯片的实验结果。图中所示，lgg/lgm为635/532双通道的双荧光结果；635#-lgm为红光635nm通道；532#-lgg为绿光532nm通道。404133为芯片编号，其他数字为候选抗原蛋白编号，test为对照，buffer为扣除背景值。图2：显示部分芯片的实验结果。图中所示，lgg/lgm为635/532双通道的双荧光结果；635#-lgm为红光635nm通道；532#-lgg为绿光532nm通道。404137为芯片编号，其他数字为候选抗原蛋白编号，test为对照，buffer为扣除背景值。图3：显示部分芯片的实验结果。图中所示，lgg/lgm为635/532双通道的双荧光结果；635#-lgm为红光635nm通道；532#-lgg为绿光532nm通道。404138为芯片编号，其他数字为候选抗原蛋白编号，test为对照，buffer为扣除背景值。图4：部分生物标志物效果图。其中，图4a是p53抗原蛋白在鉴定正常人和肺癌患者有效性的散点图。括号中c表示正常人，p表示肺癌患者。虚线位置阈值对应的灵敏度(sen)为20％，特异性(sep)为97.5％。图4b是p62抗原蛋白在鉴定正常人和肺癌患者有效性的散点图。括号中c表示正常人，p表示肺癌患者。虚线位置阈值对应的灵敏度(sen)为10％，特异性(sep)为97.5％。图4c是magea4抗原蛋白在鉴定正常人和肺癌患者有效性的散点图。括号中c表示正常人，p表示肺癌患者。虚线位置阈值对应的灵敏度(sen)为10％，特异性(sep)为97.5％。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，但对本发明的保护范围不构成任何限制。以下实施例中，如无特别说明，均为常规方法。所用试剂均可从商业途径获得。huprottm人类蛋白质定制芯片包含57个人源重组蛋白质。该芯片只适用于特定项目的血清筛选实验，用以发现的潜在的可用于诊断或其它表征的生物标志物。在此项目的血清标志物研究中，样本共80例。在实验中，每例样本分别独立地与芯片反应，以检测实验组中针对某一种或几种抗原蛋白，具有普遍性的特异性的抗结核抗体(igg或igm)，这些抗原蛋白可以作为诊断标志物来表征疾病状态。基于蛋白质芯片技术发现新的疾病标志物大致分为初筛、验证、确证等几个阶段，具体流程如下：研究设计(确定临床问题)——发现(鉴定候选生物标志物)——验证(筛选有效的生物标志物)——确认(滤选最佳生物标志物)——临床应用(开发临床测定法，评估临床测试)。实施例1使用蛋白芯片筛选1.检测原理每张huprottm人类蛋白质定制芯片可以同时检测14例血清样本，特异性的抗体(包括igg、igm或其它类型抗体)与固定于芯片上的蛋白进行结合，清洗去除未结合的抗体和其它蛋白质，再用抗人igm荧光标记二抗(cy5标记，呈现红色)和抗人igg荧光二抗(cy3标记，呈现绿色)检测，通过荧光扫描仪读取信号，信号的强弱与抗体的亲和力和数量呈正相关。其使用方法可以参考例如cdi-lab的humanproteomemicroarray说明书。2.样本及杂交基本信息(1)样本编号从1～80，40例肺癌患者血清，40例非肺癌患者血清；(2)每张芯片能同时检测14例血清,血清样本用特制的围栏隔开，能避免交叉污染；(3)在实验过程中，随机混合10例血清作为重复实验样本，评价重复性。3.实验过程准备以下溶液(1)封闭液：3ml10％bsa，加入7ml1xpbs溶液，混匀，置于冰上。(2)孵育液：1ml10％bsa，加入9ml1xpbst溶液，混匀，置于冰上。(3)清洗液：1xpbst，存放于4℃冰箱。操作步骤(1)封闭：将芯片从-80℃冰箱取出，正面朝上迅速置于清洗盒中；横向放在侧摆摇床上，35rpm，室温3h。(2)清洗：封闭完成后倒尽封闭液，再分别用1xpbs、0.5xpbs、去离子水各清洗一次，每次10min.(3)芯片夹固定：清洗完成后，干燥芯片，期间不得触碰芯片表面。干燥后固定芯片夹。(4)血清样本孵育：迅速加入预先准备好的血清孵育液，每张芯片可孵育14个血清样本，每个血清样本的上样体积为200ul，侧摆摇床20rpm，4℃过夜孵育。(样本先放在4℃层析柜冻融，以1：25比例稀释)(5)清洗：将芯片及芯片夹一同取出，吸去样本，然后迅速加入等体积的pbst，如此循环数次，保证在拆除芯片夹时血清样本间无交叉污染。拆除芯片夹后，将芯片置于加有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min。(6)二抗孵育：将芯片转移到加入了3ml二抗孵育液的孵育盒中，侧摆摇床40rpm，避光，室温60min。(7)清洗：将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面)，置于加入有清洗液的芯片清洗盒，至于水平摇床上，80rpm，清洗3次，每次10min。完成后用ddh2o清洗2次，每次10min。(8)干燥：将芯片置于芯片干燥机离心干燥.(9)扫描：按照扫描仪的操作规范和使用说明操作。(10)数据提取：将对应gal文件打开，将芯片图像和gal文件每个阵列整体对齐，按下自动对齐按钮，提取数据并保存gpr。4.芯片实验结果参见图1-3，图中所示，绿光为532nm通道，为igg；红光为635nm通道，为igm。此处为部分生物标志物的图片。5.数据预处理(1)重复性检验芯片反应过程中，我们随机挑选10支血清进行混合，混合样本记为test，作为芯片重复性评价样本。test样本共计重复6次，随机分布于芯片上。通过计算两两之间pearson相关性，用以评价芯片间重复性。(2)数据准备为了消除不同样本、不同芯片之间的系统性差异带来的误差，需要通过以下方式对所提取出的数据进行处理：a)确定各样本之间背景的差异；b)数据归一化。由于实验样本及实验操作带来的偶然性误差，芯片之间直接进行数据比较可能导致结果的不确定性，故在数据比对前对信号值归一化处理。6.数据分析：采用蛋白芯片法分析80个样本(40个肺癌vs40个非肺癌)中57个候选的抗原蛋白，并获得数据。(1)用数据中的前景值减去背景值，每种蛋白的3个技术重复取平均值；(2)利用中位值归一化方法对数据做归一化处理；(3)通过ibmspssstatistics19和graphpadprism5分析软件获取有关数据的roc曲线，不同阈值对应的灵敏度和特异性数据以及散点图。(4)利用约登系数(youdenindex)法分析最优的阈值和对应的灵敏度和特异性；(5)利用最优的阈值，从整体上分析最优的组合(思路：以最低的灵敏度损失换取更高的特异性数值，尽量减少生物标志物数量)(6)最终获得若干灵敏度≥80％且特异性≥80％(意义：约登系数较高)；灵敏度≥60％且特异性≥90％(意义：高特异性)；或者灵敏度≥85％且特异性≥60％(意义：高灵敏度)，抗原蛋白数不超过10个的组合。在图4中举例说明了部分生物标志物的结果，其中分别显示了p53抗原蛋白、p62抗原蛋白和magea4抗原蛋白在鉴定正常人和肺癌患者有效性的散点图。实施例2重复性验证：我们使用了另外的70例样本(35个肺癌，35个非肺癌)，按照实施例1的实验方案对候选的27个抗原蛋白做蛋白芯片的验证。实施例1中筛选的27个生物标志物在实施例2中灵敏度≥80％且特异性≥80％(意义：约登系数较高)；灵敏度≥60％且特异性≥90％(意义：高特异性)；或者灵敏度≥85％且特异性≥60％(意义：高灵敏度)，抗原蛋白数不超过10个的组合。部分验证结果如下：表11实施例327个蛋白抗原在其他平台上的使用1、抗原的制备：1)分析27个目标蛋白的基因和氨基酸序列，进行抗原性及表达分析，密码子优化，完成全基因合成。2)将上述获得的基因片段经酶切连接至原核真核穿梭表达载体上，转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，获得的重组质粒采用菌落pcr、酶切和测序鉴定确认包含正确的外源片段。3)提取构建正确的表达载体，经酶切线性化后，电转至酵母感受态细胞中。利用博莱霉素抗性筛选转化子，并测序验证。4)选取高拷贝的转化子进行验证性重组蛋白表达和纯化测试。5)使用优化好的条件进行100-1000ml体系的重组蛋白的表达和亲和柱/离子交换柱/分子筛纯化，获得1～3mg纯化重组蛋白，纯度>85％。2、试剂盒制备：1)用于检测自身抗体的酶联免疫试剂盒的组成a)包被不同抗原蛋白的酶标板；b)酶结合物-辣根过氧化物酶标记的羊抗人免疫球蛋白，浓度为0.1ug/ml；c)阳性质控品(标准品)：d)阴性质控品；e)血清稀释缓冲液；f)tmb显色剂；g)抗原洗涤液；h)终止液；i)封口膜；2)酶标板制备及血清样本的检测3、酶标板制备及elisa检测步骤如下:a)用含有5μg/ml的链霉亲和素(thermo)稀释到pbs，4℃包被过夜，每孔各50μl；b)倒掉溶液，把板拍干后，用250μlpbs，ph7.4洗一次；c)倒掉溶液，把板拍干，加入250μl封闭液，室温封闭1hr(室温～25度)并置于微孔板振荡仪振荡；d)倒掉溶液，把板拍干后，用250μlpbs，ph7.4洗一次；e)倒掉溶液，把板拍干后，加入相应的抗原50μl(用抗原稀释液稀释抗原到终浓度150nm)，室温孵育1.5hr置于微孔板振荡仪振荡；f)倒掉溶液，把板拍干后，用抗原洗涤液放置5分钟洗一次；g)倒掉溶液，把板拍干后，用250μlpbs，ph7.4洗两次；h)倒掉溶液，把板拍干，加入封闭液250μl，室温封闭1hr并置于微孔板振荡仪振荡；i)倒掉溶液，把板拍干后，用250μlpbs，ph7.4洗一次；j)倒掉溶液，把板拍干后，加入血清稀释缓冲液稀释的血清样本(稀释度1:110)，每孔加50μl，室温置于微孔板振荡仪振荡1hr；k)倒掉溶液，把板拍干后，用250μlpbst(含0.05％tween‐20)洗涤三次；l)加入辣根过氧化物酶标记的重组抗人免疫球蛋白g抗体(1:20000用抗体稀释液稀释)，每孔加50μl，室温置于微孔板振荡仪振荡0.5hr；m)倒掉溶液，把板拍干后，用250μlpbst(含0.05％tween‐20)洗涤三次；n)加入tmb室温显色15min，每孔加50μl；o)加入终止液，每孔加50μl；p)酶标仪于450nm波长下读板，根据标准曲线计算相应抗体浓度4、数据分析：1)抗原组合及临床表现利用生物统计学方法，选取不同的抗原组合，分析这些组合的灵敏度和特异性数据，找到5-10个最优的组合。2)标准品检测及定量方法标准品的计量-效应曲线；根据光吸收值计算对应的抗体滴度和浓度。当前第1页12