本发明涉及一种中药的质量检测方法，具体涉及一种三七中皂苷的薄层扫描测定方法。
背景技术：
：三七为五加科人参属植物三七的块根。三七自古以活血散瘀功效著名，能抗血小板聚集和抗血栓形成，现代药理研究表明三七对心、脑血管等血液系统、神经系统、代谢和免疫系统具有很好的调节作用。三七有效物质为皂苷类化合物，迄今已从三七中分离得到70余种三萜皂苷，其中以三七皂苷r1，人参皂苷rb1，rg1和re等含量较高。目前人参皂苷rb1、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷re和re的定量测定方法多采用hplc法，但因其为末端吸收，灵敏度低，测定时间长，且检测成本高、速度慢，限制了hplc法在检测三七皂苷活性成分中的应用。技术实现要素：发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，经过大量实验筛选，采用薄层扫描法测定三七中皂苷类化合物。该方法检测灵敏度高，稳定性好，检测速度快，成本低，可以同时检测三七中4种以上三七皂苷的有效成分，对控制三七的质量和保证疗效具有重要意义。技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：一种三七中皂苷的薄层扫描测定方法，包括以下步骤：(1)混合对照品溶液的配制取人参皂苷rb1、三七皂苷r1，人参皂苷rg1和人参皂苷re对照品适量，分别精密称定，置于容量瓶中，加甲醇制成混合对照品溶液，备用；(2)供试品溶液的制备取三七细粉，置索式提取器中，加乙醚加热回流提取，弃去乙醚液，药渣挥去溶剂，加甲醇加热回流至无色，提取液挥干，残渣加甲醇适量，并转移至量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液，备用；(3)线性关系的考察精密吸取上述步骤(1)不同体积的混合对照品溶液，分别点于薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，晾干，至366nm下检视后，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶带固定，按薄层扫描法进行扫描，测得对照品吸收度积分值，以人参皂苷rb1、三七皂苷r1，人参皂苷rg1和人参皂苷re进样量为横坐标x，峰面积积分值为纵坐标y，进行线性回归，得到回归方程；(4)含量测定精密吸取步骤(2)的供试品溶液，点于硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，晾干，至366nm下检视后，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶带固定，按薄层扫描法进行扫描，测得供试品吸收度积分值，然后根据步骤(3)回归方程计算人参皂苷rb1、三七皂苷r1，人参皂苷rg1和人参皂苷re的含量。作为优选方案，以上所述的三七中皂苷的薄层扫描测定方法，步骤(1)混合对照品溶液的配制：取人参皂苷rb1、三七皂苷r1，人参皂苷rg1和人参皂苷re对照品适量，分别精密称定，置于25ml容量瓶中，加甲醇制成浓度分别为0.504mg/ml、0.501mg/ml、0.492mg/ml、0.498mg/ml混合对照品溶液，备用。作为优选方案，以上所述的三七中皂苷的薄层扫描测定方法，步骤(2)供试品溶液的制备方法为：取三七细粉0.2g，置索式提取器中，加乙醚80ml，加热回流提取1小时，弃去乙醚液，药渣挥去溶剂，加甲醇80ml，加热回流至无色，提取液挥干，残渣加甲醇适量，并转移至10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液，备用。作为优选方案，以上所述的三七中皂苷的薄层扫描测定方法，步骤(3)线性关系的考察：精密吸取上述步骤(1)混合对照品溶液各1、2、4、6、8、10μl，分别点于薄层板上，以体积比为13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水，在10℃以下放置12h的下层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰，晾干，至366nm下检视后，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶带固定，以700nm作为参比波长，在510nm波长下按薄层扫描法进行扫描，测得对照品吸收度积分值，以人参皂苷rb1、三七皂苷r1，人参皂苷rg1和人参皂苷re进样量为横坐标x，峰面积积分值为纵坐标y，进行线性回归，得回归方程如下：作为优选方案，以上所述的三七中皂苷的薄层扫描测定方法，其特征在于，步骤(4)含量测定：精密吸取步骤(2)的供试品溶液2μl，点于硅胶g薄层板上，以体积比为13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水，10℃以下放置12h的下层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰，晾干，至366nm下检视后，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶带固定，以700nm作为参比波长，在510nm波长下按薄层扫描法进行扫描，测得供试品吸收度积分值，根据步骤(3)回归方程计算人参皂苷rb1、三七皂苷r1，人参皂苷rg1和人参皂苷re的含量。一、薄层扫描条件筛选实验：1、现有技术三七项的鉴别方法处理三七样品，采用展开剂展开后薄层斑点较多，分离度不好，采用薄层扫描时出现色谱峰相互交叉，定量不精确。本发明在现有技术的基础上，通过大量实验优选，在三七样品处理时，先用乙醚进行提取，除去部分极性较低的成份后，再加甲醇回流提取人参皂苷类成分，并且不同的展开剂，对三七成分的展开效果不同，本发明通过过大量实验筛选，采用不同极性比例的试剂，筛选了石油醚、苯、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇和水等不同组份的和体积比的展开剂，进行大量筛选，得到最佳的展开剂(以体积比为13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水，10℃以下放置12h的下层液为展开剂)，进行薄层色谱分析，薄层色谱斑点少，分离度良好，定量精准。2、在样品预提取、展开晾干后，喷10％硫酸乙醇溶液110℃烘至显色清晰后，本发明通过大量实验发现，需要立即用等大的透明玻璃板覆盖，并且周围要用透明胶封严，以免斑点氧化褪色，从而可提高检测的灵敏度和准确度。3、在样品薄层扫描是选用的波长进行不同波长的比较，波长低于350nm扫面色谱峰面积极低，与基线很难区分，最终确认采用510nm检测，参比波长为700nm时检测色谱峰较高，基线分离较好，因此最终确认检测波长510nm，参比波长700nm。有益效果：本发明提供的三七中皂苷的薄层扫描测定方法和现有技术相比具有以下优点：本发明通过大量实验筛选出薄层扫描法，本发明可同时测定三七细粉中人参皂苷rg1、三七皂苷r1，人参皂苷rb1和人参皂苷re的含量，本发明通过大量实验筛选供试品溶液的制备、展开条件和显色方法等，使人参皂苷rb1、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷re和人参皂苷re的色谱斑点分离良好，扫描色谱峰稳定、可测，检测速度快，且成本低，可克服现有技术hplc存在的末端吸收，灵敏度低，检测成本高的缺点。附图说明图1为三七薄层色谱图。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。实施例1一种三七中皂苷的薄层扫描测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)混合对照品溶液的配制取人参皂苷rb1、三七皂苷r1，人参皂苷rg1和人参皂苷re对照品适量，分别精密称定，置于25ml容量瓶中，加甲醇制成浓度分别为0.504mg/ml、0.501mg/ml、0.492mg/ml、0.498mg/ml混合对照品溶液，备用；(2)供试品溶液的制备取6批三七细粉各0.2g，置索式提取器中，加乙醚80ml，加热回流提取1小时，弃去乙醚液，药渣挥去溶剂，加甲醇80ml，加热回流至无色，提取液挥干，残渣加甲醇适量，并转移至10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液，备用；(3)线性关系的考察精密吸取上述步骤(1)混合对照品溶液各1、2、4、6、8、10μl，分别点于薄层板上，以体积比为13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水，在10℃以下放置12h的下层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰，晾干，至366nm下检视后，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶带固定，以700nm作为参比波长，在510nm波长下按薄层扫描法进行扫描，测得对照品吸收度积分值，以人参皂苷rb1、三七皂苷r1，人参皂苷rg1和人参皂苷re进样量为横坐标x，峰面积积分值为纵坐标y，进行线性回归，得回归方程如下：回归方程线性系数r线性范围人参皂苷rb1y＝1120.1x+271.29r＝0.99850.504～5.04μg三七皂苷r1y＝2105.2x+135.20r＝0.99910.501～5.04μg人参皂苷rg1y＝1085.1x+71.03r＝0.99820.492～4.92μg人参皂苷rey＝1825.3x+61.68r＝0.99820.498～4.98μg(4)含量测定精密吸取步骤(2)的6批三七粉的供试品溶液各2μl，点于同一硅胶g薄层板上，以体积比为13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水，10℃以下放置12h的下层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰，晾干，至366nm下检视后，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶带固定，以700nm作为参比波长，在510nm波长下按薄层扫描法进行扫描，测得6批三七供试品吸收度积分值，然后根据步骤(3)回归方程，分别计算人参皂苷rb1、三七皂苷r1，人参皂苷rg1和人参皂苷re的含量，检测结果见下表1。表16批三七中皂苷的含量测定结果实施例2方法学考察1、精密度试验精密吸取实施例1混合对照品溶液2μl，分别点于2块薄层板上，各点6份，按实施例1方法进行测定，结果人参皂苷rb1、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷re的rsd分别为1.87％、1.02％、1.56与1.34％，表明仪器精密度良好。2、稳定性试验精密吸取实施例1样品供试液(批号：160601)2μl，按实施例1方法于0、10、20、40、60min测定，结果，人参皂苷rb1、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷re峰面积rsd分别为1.64％、1.96％、1.72％和1.25％。结果表明样品60min内测定稳定。本发明能够在60min内测定稳定，相比现有技术只能在30分钟测定稳定取得了更明显的技术进步。3、重复性试验取实施例1样品供试液(批号：160601)5份，按实施例1方法测定。测得5份三七细粉中人参皂苷rb1、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷re峰面积rsd分别为峰面积rsd分别为1.53％、1.05％、1.86％与1.29％，结果表明此方法重复性良好。4、加样回收试验精密称定三七粉(批号：160601，含人参皂苷rb131.25mg/g、三七皂苷r150.72mg/g、人参皂苷rg159.86mg/g、人参皂苷re49.85mg/g)样品0.1g，精密加入人参皂苷rb1对照品3mg、三七皂苷r1对照品5mg、人参皂苷rg1对照品6mg和人参皂苷re对照品5mg，同实施例1的供试品液的制备方法制备样品供试液，平行6份，按上述方法测定，计算回收率，结果见表2。回收率％＝(测得量－样品中待测物的量)/加入对照品的量×100％表2加样回收实验结果(n＝6)本发明提供的薄层色谱扫描法能同时准确检测三七中4个皂苷类化合物，分析速度快，无末端吸收的干扰，精密度高，灵敏度高，稳定性和准确度高，可以客观、全面、准确地评价三七的质量，对准确控制三七的质量具有重要意义。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12