本发明涉及一种模拟丝绸文物样的方法，尤其涉及一种碱老化桑蚕丝模拟丝绸文物样的方法，属于文物模拟领域。
背景技术：
桑蚕丝是一种天然高分子蛋白质纤维，我国是最早养蚕缫丝织绸的国家，但桑蚕丝的起源问题一直笼罩在迷雾中。解决我国桑蚕丝起源的问题不仅仅是探索华夏文明起源的需要，而且也是为“我国是世界上公认的丝绸起源地”这一说法提供更加信服的证据。桑蚕丝的常规检测方法主要有傅里叶红外光谱、拉曼光谱、x-射线衍射等，但桑蚕丝长期处于墓葬或遗址环境中会受到多种因素影响，从而出现蛋白质降解及大分子链断裂等问题，采用传统的一些方法很难检测到丝素蛋白的存在。当前蛋白质检测的先进技术是基于抗体-抗原的elisa法，目前已出现了桑蚕丝素蛋白的多克隆抗体，可以检测出含量较小的桑蚕丝素蛋白。但目前出土的丝织品表现方式主要以泥化丝织品为主，这类织物往往已经降解为短链纤维或者肽段，甚至降解为氨基酸等小分子，它们的微痕迹遗存于土壤中。而实验室能获得的土样一般仅有几克，从这些泥化样中提取出来的丝素蛋白往往只能满足一两次的elisa实验。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种碱老化桑蚕丝模拟丝绸文物样的方法，本发明方法利用氢氧化钠对桑蚕丝进行碱老化，筛选出了最接近文物样的碱老化样。该样品在今后利用不同抗体对未知丝绸文物样进行检测时，可以作为文物样的替代样，用于抗体最佳稀释倍数的筛选和抗体特异性、灵敏度测试等实验，一定程度上解决了文物样在大量不同、重复实验中样品不足的问题。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种碱老化桑蚕丝模拟丝绸文物样的方法，包括如下制备步骤：
a)取10-15g桑蚕丝生丝置于烧杯中，加入1000-1500ml浓度为0.5％的na2co3溶液，在94-98℃水浴中加热30min，倒掉烧杯中的溶液，并重复进行一次上述操作，然后将烧杯中剩余的桑蚕丝用去离子水冲洗3遍，置于60℃的烘箱中烘干备用；
b)取1-1.5g步骤a)所得的桑蚕丝置于烧杯中，剪碎后加入100-150ml浓度为2.5mol/l的naoh溶液，在25℃下置于10转/秒的磁力搅拌器上，匀速搅拌1小时后，加入冰醋酸调节ph至7；
c)将步骤b)所得的溶液过滤，用分子截留量为8000的透析袋进行透析，每隔4-6小时换一次水，透析3天后，将透析袋内剩余溶液冷冻干燥并研磨，得到碱老化1小时的桑蚕丝素蛋白粉末；
d)重复步骤b)、步骤c)，分别制备获得碱老化3小时、6小时、9小时、12小时以及24小时的桑蚕丝素蛋白粉末；
e)分别取1-2mg步骤c)、步骤d)所制得的桑蚕丝素蛋白粉末以及研磨好的丝绸文物样，将其分别放入15ml的离心管中,每支离心管中加入10mlph为9.6的碳酸盐缓冲溶液，震荡均匀后得到澄清的包被液；
f)取一块96孔酶标板，每孔加入100μl步骤e)中所得包被液，所述酶标板中的每列加五个孔，该五个孔中均加入同一种包被液，列与列之间使用不同的包被液，其分别按照空白对照，阴性对照，阳性对照，碱老化1小时，碱老化3小时，碱老化6小时，碱老化9小时，碱老化12小时，碱老化24小时，丝绸文物样的顺序完成布板；
g)对步骤f)中布置好的96孔板进行间接酶联免疫测试，其具体步骤为：每孔加入200μl的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤3次，然后每孔加入200μl的1wt％的牛血清蛋白溶液，37℃下孵育2h，进行封闭处理；每孔加入200μl的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤3次，然后每孔加入100μl的兔抗丝素蛋白一抗，37℃下孵育1h；每孔加入200μl的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤3次，然后每孔加入100μl的hrp标记的山羊抗兔抗体，37℃下孵育1h；每孔加入200μl的ph7.4缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤5次，然后每孔加入50μl的tmb显色的剂a液，再加入50μl的tmb显色剂的b液，摇晃均匀，避光反应10min，然后每孔加入100μl的h2so4终止反应，测试其在450nm处的吸光度，记为od450nm。
作为一种改进，步骤e)中所述的ph9.6的碳酸盐缓冲溶液，其配制方法为：称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠，加入到800ml去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶进行定容，调节溶液的ph为9.6。
作为一种改进，所述空白对照为采用1wt％的牛血清蛋白溶液代替兔抗丝素蛋白一抗加入，所述阴性对照为采用碳酸盐缓冲溶液进行包被，所述阳性对照为采用未老化丝素蛋白配得的溶液进行包被。
作为一种改进，步骤g)中所述的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液的配制方法为：称取0.27g磷酸二氢钾，1.42g磷酸氢二钠，8g氯化钠和0.2g氯化钾，加入到800ml去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶进行定容，调节溶液的ph为7.4。
与现有技术对比本发明的有益效果：
1)采用氢氧化钠对桑蚕丝进行老化，与传统的湿热老化方法相比，达到相同老化程度所需时间极大缩短，从数个月降低到数小时，且碱老化结束以后立刻将ph调节为中性，精确控制老化时间，若不调节ph，则会出现透析过程中样品被二次老化的情况，使实验的准确性和说服力下降，同时在碱老化过程中采用磁力搅拌器匀速搅拌，将脱胶后的桑蚕丝先剪碎再加入氢氧化钠溶液，可减少在搅拌过程中样品相互缠绕的程度，同时提高了老化的均匀程度，若不剪碎和搅拌，则容易出现样品老化不均匀的现象，使重复实验结果偏差较大；
2)采用的丝绸文物样已被鉴定出来自桑蚕丝织物，并且相关实验均已完成，为残留的文物样，对此残留样再次利用，充分挖掘了样品的剩余价值；
3)选择出最接近文物样的碱老化样，该样品在今后利用不同抗体对未知丝绸文物样进行检测时，可以作为文物样的替代样，用于抗体最佳稀释倍数的筛选和抗体特异性、灵敏度测试等实验，一定程度上解决了文物样在大量不同、重复实验中样品不足的问题。
附图说明
图1是本发明间接酶联免疫测试结果统计图。
具体实施方式
以下通过具体的实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式并不受以下实施例的限制。
如图1所示为本发明间接酶联免疫测试的结果统计图，其中hapj0449为文物样的数据，根据间接酶联免疫测试结果统计图，选择碱老化4小时左右的样品作为文物样的替代样品最佳，可进行相关实验。
实施例1
a)取10g桑蚕丝生丝于烧杯，加入1000ml的0.5％na2co3溶液，在94℃水浴中加热30min，倒掉烧杯中的溶液，重复进行一次上述操作，将剩余的桑蚕丝用去离子水冲洗3遍，置于60℃的烘箱中烘干备用；
b)取1g步骤a)所得的桑蚕丝于烧杯，剪碎后加入100ml浓度为2.5mol/l的naoh溶液，在25℃下置于10转/秒的磁力搅拌器上，匀速搅拌1小时后，加入冰醋酸调节ph至7；
c)将步骤b)所得的溶液过滤，用分子截留量为8000的透析袋进行透析，每隔4小时换一次水，透析3天后，将透析袋内剩余溶液冷冻干燥并研磨，得到碱老化1小时的桑蚕丝素蛋白粉末；
d)根据步骤b)和步骤c)所述，继续分别制备碱老化3小时，6小时，9小时，12小时，24小时的桑蚕丝素蛋白粉末，加碱至ph中和为7过程中的时间为碱老化时间；
e)分别取1mg步骤c)、步骤d)所制得的桑蚕丝素蛋白粉末以及研磨好的丝绸文物样，将其分别放入放入15ml离心管中,每支离心管加入10mlph为9.6的碳酸盐缓冲溶液，震荡均匀后得到澄清的包被液，所用的丝绸文物样由浙江丝绸博物馆提供，该文物样已被鉴定出来自桑蚕丝织物，并且相关实验均已完成，为残留的文物样，所述的ph9.6的碳酸盐缓冲溶液，其配制方法为：称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠，加入到800ml去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶进行定容，调节溶液的ph为9.6；
f)取一块96孔酶标板，每孔加入100μl步骤e)中所得包被液，每列加五个孔，这五个孔加入同一种包被液，列与列之间使用不同的包被液，按照空白对照，阴性对照，阳性对照，碱老化1小时，碱老化3小时，碱老化6小时，碱老化9小时，碱老化12小时，碱老化24小时，丝绸文物样的顺序完成布板，所述的空白对照为采用1wt％的牛血清蛋白溶液代替兔抗丝素蛋白一抗加入，阴性对照为采用碳酸盐缓冲溶液进行包被，阳性对照为采用未老化丝素蛋白配得的溶液进行包被；
g)对步骤f)中布置好的96孔板进行间接酶联免疫测试，其具体步骤为：每孔加入200μl的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤3次，然后每孔加入200μl的1wt％的牛血清蛋白溶液，37℃下孵育2h，进行封闭处理；每孔加入200μl的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤3次，然后每孔加入100μl的兔抗丝素蛋白一抗，37℃下孵育1h；每孔加入200μl的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤3次，然后每孔加入100μl的hrp标记的山羊抗兔抗体，37℃下孵育1h；每孔加入200μl的ph7.4缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤5次，然后每孔加入50μl的tmb显色的剂a液，再加入50μl的tmb显色剂的b液，摇晃均匀，避光反应10min，然后每孔加入100μl的h2so4终止反应。测试其在450nm处的吸光度，记为od450nm，所述间接酶联免疫测试结果，选择最接近文物样的碱老化时间，作为以后模拟丝绸文物样的参考，所述的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液的配制方法为：称取0.27g磷酸二氢钾，1.42g磷酸氢二钠，8g氯化钠和0.2g氯化钾，加入到800ml去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶进行定容，调节溶液的ph为7.4。
实施例2
a)取13g桑蚕丝生丝于烧杯，加入1300ml的0.5％na2co3溶液，在96℃水浴中加热30min，倒掉烧杯中的溶液，重复进行一次上述操作。将剩余的桑蚕丝用去离子水冲洗3遍，置于60℃的烘箱中烘干备用；
b)取1.3g步骤a)所得的桑蚕丝于烧杯，剪碎后加入130ml浓度为2.5mol/l的naoh溶液，在25℃下置于10转/秒的磁力搅拌器上，匀速搅拌1小时后，加入冰醋酸调节ph至7；
c)将步骤b)所得的溶液过滤，用分子截留量为8000的透析袋进行透析，每隔5小时换一次水，透析3天后，将透析袋内剩余溶液冷冻干燥并研磨，得到碱老化1小时的桑蚕丝素蛋白粉末；
d)根据步骤b)和步骤c)所述，继续分别制备碱老化3小时，6小时，9小时，12小时，24小时的桑蚕丝素蛋白粉末，加碱至ph中和为7过程中的时间为碱老化时间；
e)分别取1.5mg步骤c)、步骤d)所制得的桑蚕丝素蛋白粉末以及研磨好的丝绸文物样，将其分别15ml离心管中,每支离心管加入10mlph为9.6的碳酸盐缓冲溶液，震荡均匀后得到澄清的包被液，所用的丝绸文物样由浙江丝绸博物馆提供，该文物样已被鉴定出来自桑蚕丝织物，并且相关实验均已完成，为残留的文物样，所述的ph9.6的碳酸盐缓冲溶液，其配制方法为：称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠，加入到800ml去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶进行定容，调节溶液的ph为9.6；
f)取一块96孔酶标板，每孔加入100μl步骤e)中所得包被液，每列加五个孔，这五个孔加入同一种包被液，列与列之间使用不同的包被液，按照空白对照，阴性对照，阳性对照，碱老化1小时，碱老化3小时，碱老化6小时，碱老化9小时，碱老化12小时，碱老化24小时，丝绸文物样的顺序完成布板，所述的空白对照为采用1wt％的牛血清蛋白溶液代替兔抗丝素蛋白一抗加入，阴性对照为采用碳酸盐缓冲溶液进行包被，阳性对照为采用未老化丝素蛋白配得的溶液进行包被；
g)对步骤f)中布置好的96孔板进行间接酶联免疫测试，其具体步骤为：每孔加入200μl的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤3次，然后每孔加入200μl的1wt％的牛血清蛋白溶液，37℃下孵育2h，进行封闭处理；每孔加入200μl的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤3次，然后每孔加入100μl的兔抗丝素蛋白一抗，37℃下孵育1h；每孔加入200μl的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤3次，然后每孔加入100μl的hrp标记的山羊抗兔抗体，37℃下孵育1h；每孔加入200μl的ph7.4缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤5次，然后每孔加入50μl的tmb显色的剂a液，再加入50μl的tmb显色剂的b液，摇晃均匀，避光反应10min，然后每孔加入100μl的h2so4终止反应。测试其在450nm处的吸光度，记为od450nm，所述间接酶联免疫测试结果，选择最接近文物样的碱老化时间，作为以后模拟丝绸文物样的参考，所述的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液的配制方法为：称取0.27g磷酸二氢钾，1.42g磷酸氢二钠，8g氯化钠和0.2g氯化钾，加入到800ml去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶进行定容，调节溶液的ph为7.4。
实施例3
a)取15g桑蚕丝生丝于烧杯，加入1500ml的0.5％na2co3溶液，在98℃水浴中加热30min，倒掉烧杯中的溶液，重复进行一次上述操作。将剩余的桑蚕丝用去离子水冲洗3遍，置于60℃的烘箱中烘干备用；
b)取1.5g步骤a)所得的桑蚕丝于烧杯，剪碎后加入150ml浓度为2.5mol/l的naoh溶液，在25℃下置于10转/秒的磁力搅拌器上，匀速搅拌1小时后，加入冰醋酸调节ph至7；
c)将步骤b)所得的溶液过滤，用分子截留量为8000的透析袋进行透析，每隔6小时换一次水，透析3天后，将透析袋内剩余溶液冷冻干燥并研磨，得到碱老化1小时的桑蚕丝素蛋白粉末；
d)根据步骤b)和步骤c)所述，继续分别制备碱老化3小时，6小时，9小时，12小时，24小时的桑蚕丝素蛋白粉末，加碱至ph中和为7过程中的时间为碱老化时间；
e)分别取2mg步骤c)、步骤d)所制得的桑蚕丝素蛋白粉末以及研磨好的丝绸文物样，将其分别放入15ml离心管中,每支离心管加入10mlph为9.6的碳酸盐缓冲溶液，震荡均匀后得到澄清的包被液，所用的丝绸文物样由浙江丝绸博物馆提供，该文物样已被鉴定出来自桑蚕丝织物，并且相关实验均已完成，为残留的文物样，所述的ph9.6的碳酸盐缓冲溶液，其配制方法为：称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠，加入到800ml去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶进行定容，调节溶液的ph为9.6；
f)取一块96孔酶标板，每孔加入100μl步骤e)中所得包被液，每列加五个孔，这五个孔加入同一种包被液，列与列之间使用不同的包被液，按照空白对照，阴性对照，阳性对照，碱老化1小时，碱老化3小时，碱老化6小时，碱老化9小时，碱老化12小时，碱老化24小时，丝绸文物样的顺序完成布板，所述的空白对照为采用1wt％的牛血清蛋白溶液代替兔抗丝素蛋白一抗加入，阴性对照为采用碳酸盐缓冲溶液进行包被，阳性对照为采用未老化丝素蛋白配得的溶液进行包被；
g)对步骤f)中布置好的96孔板进行间接酶联免疫测试，其具体步骤为：每孔加入200μl的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤3次，然后每孔加入200μl的1wt％的牛血清蛋白溶液，37℃下孵育2h，进行封闭处理；每孔加入200μl的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤3次，然后每孔加入100μl的兔抗丝素蛋白一抗，37℃下孵育1h；每孔加入200μl的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤3次，然后每孔加入100μl的hrp标记的山羊抗兔抗体，37℃下孵育1h；每孔加入200μl的ph7.4缓冲溶液进行洗涤，每次2分钟，共洗涤5次，然后每孔加入50μl的tmb显色的剂a液，再加入50μl的tmb显色剂的b液，摇晃均匀，避光反应10min，然后每孔加入100μl的h2so4终止反应，测试其在450nm处的吸光度，记为od450nm，所述间接酶联免疫测试结果，选择最接近文物样的碱老化时间，作为以后模拟丝绸文物样的参考，所述的ph7.4的磷酸盐缓冲溶液的配制方法为：称取0.27g磷酸二氢钾，1.42g磷酸氢二钠，8g氯化钠和0.2g氯化钾，加入到800ml去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶进行定容，调节溶液的ph为7.4。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。