本发明关于生物检测技术领域，尤其涉及一种毛发中巴比妥类药物定量检测方法。
背景技术：
巴比妥类镇静催眠药属于巴比妥酸的衍生物，其应用范围可以从轻度镇静到完全麻醉，还可以用作抗焦虑药、安眠药、抗痉挛药，但长期使用则会导致成瘾性。虽然巴比妥类药物目前在临床上已很大程度上被苯二氮
现有技术中对巴比妥的检验对象多为血液、尿液和唾液，检测结果受药物半衰期影响较大，肝药酶诱导剂或抑制剂、肾功能等均会对检测结果造成影响，并且所得检测结果仅能反应采样时的巴比妥浓度，当用药发生数周或数月之前时，无法根据血液、尿液和唾液的检测结果追溯用药时间。毛发中虽然也会存在代谢，但巴比妥是酸性药物，不易进入头发，不易检出，对毛发样品的前处理涉及酸水解、碱消化、酶消化法、液液萃取、固相萃取等步骤，过程繁琐，回收率低、检出限高。
技术实现要素：
针对现有技术中对毛发中巴比妥类药物检测结果不能追溯用药时间、毛发提取操作繁琐、回收率低、检出限高等技术问题，本发明提供了一种毛发中巴比妥类药物定量检测方法。
以及，本发明还提供了一种追溯巴比妥类药物用药时间的方法。
以及，本发明还提供了上述方法用于法医判断迷奸案件作案时间的应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种毛发中巴比妥类药物定量检测方法，用液氮研磨和甲醇超声提取对毛发样品进行前处理，用高分辨液相色谱/质谱联用分析方法进行巴比妥类药物检测。
相对于现有技术而言，本发明的检测对象为毛发，与现有技术对血液、尿液、唾液等生物检材相比，毛发检材的检出时限长，可反映几周至数月的用药情况，并且抗腐败、易于采取、保存和重复取样。采用液氮研磨的方法，使毛发样品在低于其脆化点的温度条件下被粉碎处理，同时能够有效避免研磨过程的过热问题，增加目标物在处理过程中的稳定性、提高回收率，而且显著缩短了样品前处理时间。再进行甲醇超声提取后，可进一步提高回收率。该前处理方法操作快速简单、回收率高，尤其适用于巴比妥类酸性药物的分离提取。高分辨液相色谱/质谱联用方法中的高分辨液相色谱能够同时检测多种物质，且检出限低，可以对多种巴比妥类药物进行精确定量检测，使结论更为可靠。
以及，本发明实施例还提供了一种追溯巴比妥类药物用药时间的方法，包括以下步骤：将待测毛发样品进行分段，用上述方法对每段所述毛发样品进行检测，得到每段所述毛发样品中巴比妥类药物的含量，根据所述含量推测巴比妥类药物的用药时间。毛发是从毛囊中生长出的特化死细胞，不进行新陈代谢，因此巴比妥类药物通过毛囊的代谢进入毛发中后，在毛发中的残留时间会很长。以头发为例，成年健康人的头发生长速度约为1cm/月，因此可以通过每段头发中巴比妥类药物的浓度来进行推测，追溯巴比妥类药物的用药时间，而现有技术中对血液、尿液、唾液等进行检测只能反映出采样时间的用药情况，并不能进行用药时间的追溯。
以及，本发明实施例还提供了上述方法用于法医判断迷奸案件作案时间的应用。通过上述方法，根据每段头发中的巴比妥含量以及头发的生长速度，即可追溯作案时间，判断单次或长期巴比妥类药物的用药频度和用药史。
附图说明
图1为巴比妥多反应监测色谱图；
图2为苯巴比妥多反应监测色谱图；
图3为异戊巴比妥多反应监测色谱图；
图4为司可巴比妥多反应监测色谱图；
图5为内标阿普巴比妥多反应监测色谱图；
图6为巴比妥二级质谱图；
图7为苯巴比妥二级质谱图；
图8为异戊巴比妥二级质谱图；
图9为司可巴比妥二级质谱图；
图10为内标阿普巴比妥二级质谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种毛发中巴比妥类药物定量检测方法，用液氮研磨和甲醇超声提取对毛发样品进行前处理，用高分辨液相色谱/质谱联用分析方法进行巴比妥类药物检测。
相对于现有技术而言，本发明缩短了操作时间，显著提高了毛发中巴比妥类药物的回收率和稳定性。
进一步地，该方法包括以下步骤：
步骤a、将毛发样本进行清洁处理，得到待测样本；
步骤b、将所述待测样本进行液氮研磨得到粉碎样本，采用甲醇对所述粉碎样本进行超声提取，得到待测溶液；
步骤c、用高分辨液相色谱/质谱联用分析方法对步骤b所述待测溶液进行检测，获取毛发中巴比妥类药物的高分辨液相色谱/质谱联用的检测数据，计算毛发中巴比妥类药物的含量。
以上操作步骤简单，易于操作，检测不受检测时间的影响，既可以检测现取检材，也可以对保留数周至数月的检材进行检验。
具体的，上述步骤a中，所述清洁处理的具体操作为：将毛发样本，依次经过1wt％洗洁精溶液、纯化水、丙酮、纯化水的洗涤后，置于室温晾干。非极性溶剂丙酮作为去除污染的溶剂，具有不膨胀毛发的优点，可避免极性溶剂因膨胀毛发而促进结合物过早溶出，影响检测结果。
上述步骤b中，所述液氮研磨的具体操作为：将所述待测样本置于液氮温度中预冷2.5～3.5min，以9～12次/s的频率研磨1.5～2.5min后，静置50～80s，再次预冷，重复操作1～2次。经过该过程的研磨后，待测样本会碎成接近粉末的状态，有利于提高后续甲醇提取的提取效率，提高回收率。本发明优选采用冷冻研磨机进行液氮研磨的操作，将毛发置于冷冻研磨机的研磨管，通过撞子快速的撞击在液氮低温环境下进行研磨，得到接近粉末状态的粉碎样本。
所述甲醇超声提取的具体操作为：向粉碎样本中加入相当于粉碎样本重量80～120倍的甲醇，超声25～35min后，在3～5℃条件下离心9～12min，取上清液，在氮气流下吹干，用流动相和内标溶液的混合溶液溶解后，得待测溶液；其中，所述离心的转速为11000～13000rpm；所述混合溶液中，所述流动相和所述内标溶液的体积比为9∶1，所述流动相为步骤c中所述高分辨液相色谱/质谱联用分析方法中所述高分辨液相色谱的色谱条件中的流动相，所述内标溶液为阿普巴比妥甲醇溶液。
上述步骤c中所述高分辨液相色谱/质谱联用分析方法中，所述高分辨液相色谱的色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相a为8～12mmol/l乙酸铵缓冲液，流动相b为乙腈，进行线性梯度洗脱，所述线性洗脱梯度如下：
优选的色谱柱、内标以及流动相，具有较高的灵敏度和准确性、重现性。优选的缓冲液浓度和洗脱梯度可以使不同的巴比妥类药物及内标有更佳的出峰时间、峰形和分离效果，便于比较观察，提高检测的准确度。
进一步优选的，所述质谱的分析测定模式为多反应离子监测模式，该模式具有特异性强、灵敏度高、准确度高、重现性好、线性动态范围宽、自动化高通量的优点，可以获得更准确的检测结果。
本发明实施例还提供一种追溯巴比妥类药物用药时间的方法，将待测毛发样品进行分段，用上述方法对每段所述毛发样品进行检测，得到每段毛发样品中巴比妥类药物的含量，根据所述含量推测巴比妥类药物的用药时间。从而能够追溯单次或长期巴比妥类药物的用药频度和用药史。
上述追溯巴比妥类药物用药时间的方法通过追溯单次或长期巴比妥类药物的用药史，来用于法医判断迷奸案件作案时间，在迷奸类案件的法医毒物鉴定中有较高的应用价值
为了更好的说明本发明实施方式，下面通过实施例做进一步的举例说明。
实施例1
本发明实施例提供了一种毛发中巴比妥类药物定量检测方法，具体如下：
1、毛发样本的前处理：(1)清洁处理：准确称取待测毛发样本50mg，后经1wt％洗洁精、纯水、丙酮及纯水洗涤，室温晾干，从发根处分段剪取后保存备检。(2)用冷冻研磨机对每段去除污染后的毛发样本进行液氮研磨处理，使毛发样本成为粉碎样本，液氮研磨程序为：预冷2.5～3.5min，以9～12次/s的频率研磨1.5～2.5min后，静置50～80s，再次预冷，重复操作1～2次。(3)分离处理：在充分研磨后的毛发样本中加入4～6ml甲醇，超声处理25～35min后，在3～5℃条件下、以11000～13000rpm的转速离心9～12min，取上清液，在氮气流下吹干，用流动相，取上清液，氮气流下吹干，90μl流动相(10mmol/l乙酸铵缓冲液：乙腈的体积比为19∶1)和10μl内标溶液(阿普巴比妥甲醇溶液)复溶后备检。
3、标准曲线的制备：采用美国cerlliant公司的巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥标准溶液(1mg/ml)进行梯度稀释以制备系列浓度(1000ng/ml、400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、20ng/ml、10ng/ml)的标准溶液样品待检。
4、高分辨液相色谱/质谱联用分析：thermoscientificqexactivefocus型高分辨液相色谱/质谱联用仪(美国thermofisher公司)；色谱柱：thermoscientifichypersilgoldc18色谱柱(100×2.1mm,1.9μm)；柱温：22℃；流动相a：10mmol/l乙酸铵缓冲液，流动相b：乙腈；线性洗脱梯度如下：
流速：300μl/min；进样量：10μl；离子源：电喷雾电离源(esi-)；测定模式：多反应离子监测(mrm)模式扫描。源喷射电压3200v；雾化温度320℃；辅助气体加热器温度300℃，碰撞能38v；一级分辨率35000；二级分辨率17500。
5、方法学验证结果
5.1、高分辨液相色谱/质谱联用分析：如表1、图1-2所示，巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥和内标阿普巴比妥的色谱保留时间分别为4.45min、5.62min、6.36min、6.62min和5.45min；母离子分别为：183.07752、231.07797、225.12511、237.12515和209.09428；二级碎片离子分别为：140.07207、85.00452，188.07214、85.00438，182.11923、85.00434，194.11917、85.00447和166.08759、85.00433。
表1巴比妥类药物和内标阿普巴比妥色谱及质谱参数
5.2、线性范围及检出限：如表2所示，该方法检测巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥在20pg/mg-2000pg/mg范围内线性关系良好(r2>0.99)，检出限均为10pg/mg。
表2线性范围及检出限
5.3、回收率及精密度：应用上述方法，通过标准曲线测定三种不同浓度(20pg/mg、40pg/mg、200pg/mg)巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥标准溶液的浓度，来确定回收率及日内(n＝6)和日间(n＝3)精密度。根据下式计算变异系数(coefficientofvariation，cv)：变异系数cv(％)＝σ/μ×100。其中σ是标准偏差，μ是平均浓度。结果如表3所示。
5.4、基质效应(matrixeffect)：配制2组标准曲线。第1组用流动相配制成含系列浓度待测组分和内标的标准曲线，第2组标准曲线是将不同来源的空白毛发样品经提取后加入与第1组相同系列浓度的待测组分和内标后制成的标准曲线。比较2组标准曲线的斜率，以确定基质效应。结果显示，两组标准曲线斜率的相对标准偏差均小于5％，说明不存在基质效应的影响。
表3回收率及精密度测定结果
实施例2
采用实施例1的方法对一例迷奸案送检的毛发样本进行检测。
首先，采用毛发中巴比妥类药物定量检测方法对案发后第2天取样的受害者血液样本进行了检测，结果在血液样本中检出异戊巴比妥成分，其含量为：7.36ng/ml。由于在嫌疑人车内搜出的“迷药”中检出的物质为氯硝安定，未检出异戊巴比妥成分，且嫌疑人拒绝承认犯罪事实，故在案发后90天采取了受害者的头发样本对初次检验结果进行验证。结果在2-3cm毛发发段样本中检出异戊巴比妥成分，其含量为：91.20pg/mg；1-2cm毛发发段样本中检出异戊巴比妥成分，其含量低于定量限；0-1cm及3-4cm毛发发段样本中均未检出异戊巴比妥成分。故毛发中所检出的成分与血液检测结果一致，且按毛发1cm/月的平均生长速度计算，发段样本中异戊巴比妥含量的规律与案发时间吻合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。