本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种高效检测鸡组织、鸡蛋及猪肉中哌嗪残留的分析方法。
背景技术：
目前，国内外哌嗪检测方法有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-串联质谱，但柱前衍生-超高效液相色谱荧光检测法(uplc-fld)检测动物源性组织与食品中哌嗪残留的方法均还未见报道。因此，本发明首次建立鸡组织、鸡蛋及猪肉中哌嗪残留柱前衍生-超高效液相色谱荧光检测法。该方法洗脱程序简单，溶剂消耗少，分析效率更高，灵敏度和精密度更好，更适合在大批量样品分析中应用与推广。
技术实现要素：
为了能高效、准确的检测哌嗪在鸡组织(肌肉、肾脏、肝脏)、鸡蛋(全蛋、蛋清、蛋黄)及猪肉中的残留，本发明提供了一种柱前衍生-超高效液相色谱荧光检测(uplc-fld)方法。该方法能高效、准确的检测鸡组织、鸡蛋及猪肉中哌嗪的残留，且满足中国农业部、欧盟(eu)兽药残留检测方法的要求。
将鸡组织(肌肉、肾脏、肝脏)、鸡蛋(全蛋、蛋清、蛋黄)及猪肉样品通过加速溶剂萃取(ase)和固相萃取(spe)技术提取、净化后，经丹磺酰氯(dns-cl)衍生，再用超高效液相色谱荧光检测法(uplc-fld)检测。色谱条件：以acquityuplchsst3(2.1×100mm,1.8μm)为色谱柱；水-乙腈(15∶85，v∶v)体系为流动相；检测器为荧光检测器，激发波长330nm，发射波长531nm；流速为0.2ml/min；进样体积为10μl；柱温为25℃；外标法定量。
本发明中采用acquityuplchsst3(2.1×100mm,1.8μm)色谱柱，以水-乙腈(15∶85，v∶v)体系为流动相，流速为0.2ml/min，色谱峰峰型尖锐(即灵敏度高)，分析物保留时间适中，无其他杂质峰干扰。
本发明在分析效率、溶剂消耗、回收率、精密度、灵敏度及重现性角度，与其他检测方法进行比较，发现本方法分析效率更高、流动相消耗少、回收率、准确度和灵敏度高，重现性好。
附图说明
图1丹磺酰氯标准品超高效液相色谱图。
图2哌嗪标准品(50μg/kg)超高效液相色谱图。
图3空白鸡肌肉衍生产物超高效液相色谱图。
图4鸡肌肉中添加50μg/kg哌嗪标准品衍生产物超高效液相色谱图。
图5空白鸡肾脏衍生产物超高效液相色谱图。
图6鸡肾脏中添加50μg/kg哌嗪标准品衍生产物超高效液相色谱图。
图7空白鸡肝脏衍生产物超高效液相色谱图。
图8鸡肝脏中添加50μg/kg哌嗪标准品衍生产物超高效液相色谱图。
图9空白鸡全蛋衍生产物超高效液相色谱图。
图10鸡全蛋中添加50μg/kg哌嗪标准品衍生产物超高效液相色谱图。
图11空白鸡蛋清衍生产物超高效液相色谱图。
图12鸡蛋清中添加50μg/kg哌嗪标准品衍生产物超高效液相色谱图。
图13空白鸡蛋黄衍生产物超高效液相色谱图。
图14鸡蛋黄中添加50μg/kg哌嗪标准品衍生产物超高效液相色谱图。
图15空白猪肉衍生产物超高效液相色谱图。
图16猪肉中添加50μg/kg哌嗪标准品衍生产物超高效液相色谱图。
图17空白鸡肌肉基质中添加哌嗪标准曲线(n＝7)。
图18空白鸡肾脏基质中添加哌嗪标准曲线(n＝7)。
图19空白鸡肝脏基质中添加哌嗪标准曲线(n＝7)。
图20空白鸡全蛋基质中添加哌嗪标准曲线(n＝7)。
图21空白鸡蛋清基质中添加哌嗪标准曲线(n＝7)。
图22空白鸡蛋黄基质中添加哌嗪标准曲线(n＝7)。
图23空白猪肉基质中添加哌嗪标准曲线(n＝7)。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
1.实验家禽的饲养和样品采集
本试验随机选取112日龄京海黄鸡(江苏京海禽业集团有限公司)12只(公、母各半)，196日龄的京海黄鸡产蛋鸡(江苏京海禽业集团有限公司)20只，及180日龄三元(杜×长×约)杂交猪(常州康乐农牧有限公司)12头(公、母各半)，单笼或单栏饲养，饲喂不含任何药物的全价饲料(江苏京海禽业集团有限公司饲料厂和扬州市扬大饲料厂提供)，自由饮水。
饲养2周后屠宰，分别取供试鸡的肌肉、肝脏、肾脏及供试猪的肌肉作为空白样品，置于-35℃中保存。此外，京海黄鸡产蛋鸡饲养2周后，连续收集10d鸡蛋，置于4℃冰箱中暂时保存，样品采集后分别取全蛋、蛋清、蛋黄匀浆后分装，分别作为空白样品，置于-35℃中保存。
2.本发明提取与净化步骤
1)准确称取(2.0±0.02)g均质好的空白样品放于研钵中，并加入4.0g硅藻土研磨，为了达到最佳的萃取效率，尽可能将样品研磨成小颗粒，装入22ml的萃取池中，用ase进行萃取；
2)在1500psi，80℃萃取条件下，每个萃取池首先用正己烷静态萃取1次，弃掉萃取液；再用2％甲酸乙腈静态萃取2次，收集萃取液待用。每个萃取过程15～20min；
3)将上述萃取收集的萃取液经strata-x-c小柱净化，鸡组织、猪肉用60mg/3mlstrata-x-c柱净化(净化程序见表1)，鸡蛋用100mg/3mlstrata-x-c柱净化(净化程序见表2)。将上述洗脱液用15ml离心管收集，洗脱液置于氮吹仪中吹干，待用；
4)将氮吹后的样品用1.0ml乙腈复溶，超声10min，摇匀，移取100μl0.12％三乙胺和600μl1.0mg/ml丹磺酰氯溶液，用乙腈定容至2.0ml，置于50℃环境下避光反应20min，待反应结束后，涡旋1min，过0.22μm有机相针式滤器，滤液供uplc-fld检测。
表1鸡组织及猪肉样品固相萃取程序
表2鸡蛋样品固相萃取程序
3试验条件
色谱柱：acquityuplchsst3,2.1×100mm,1.8μm；流动相a：超纯水；流动相b：乙腈，其比例为15∶85(v∶v)；检测器：荧光检测器，激发波长330nm，发射波长531nm；流速：0.2ml/min；进样体积：10μl；柱温：25℃。
4定量方法
4.1标准曲线的绘制
分别准确称取10份(2.0±0.02)g匀质好的鸡肌肉、鸡肾脏、鸡肝脏、猪肉及鸡全蛋、蛋清、蛋黄空白样品，按2中的方法对上述空白样品进行前处理，制备空白基质提取液，备用。
分别移取适量的空白鸡肌肉、鸡肾脏、鸡肝脏及猪肉基质提取液将标准工作液稀释成一系列浓度，按2中的方法进行衍生，使得最终对应在空白鸡肌肉、鸡肾脏、鸡肝脏及猪肉中哌嗪的添加浓度为loq、5.0、10.0、50.0、100.0、150.0、200.0μg/kg。
分别移取适量空白鸡全蛋、蛋清及蛋黄基质提取液将标准工作液稀释成一系列浓度，按2中的方法进行衍生，使得最终对应在空白鸡全蛋、蛋黄、蛋清样品中哌嗪的添加浓度为loq、10.0、20.0、50.0、100.0、150.0、200.0μg/kg。
将上述处理的各浓度样品在优化好的hplc-fld方法下进行分析。以哌嗪标准工作液在不同空白基质中添加浓度为自变量(x)，以哌嗪衍生产物峰面积为应变量(y)，以此制作标准曲线。
表3鸡组织、鸡蛋及猪肉中哌嗪线性范围、回归方程和决定系数
由表3和附图17～23可见，哌嗪在空白鸡组织(肌肉、肾脏、肝脏)及猪肉基质中添加浓度在loq～200.0μg/kg范围内，哌嗪衍生产物峰面积与哌嗪浓度呈良好的线性关系；在空白鸡蛋(全蛋、蛋清、蛋黄)基质中哌嗪添加浓度在loq～400.0μg/kg范围内，哌嗪衍生产物峰面积与浓度也呈良好的线性关系；其中，线性范围、线性回归方程及决定系数r2见表3。如果分析的浓度超过样品的线性范围，需将分析的浓度稀释至该范围内，检测出的结果乘以稀释倍数得到原样品的浓度。
4.2回收率及精密度的测定
准确称取(2.0±0.02)g匀质好的空白样品，按2中的方法制取空白基质提取液。分别取适量哌嗪标准工作液用空白基质提取液稀释系列浓度，按2中的方法进行衍生，使其最终在各空白样品中添加浓度为loq、0.5mrl、1.0mrl、2.0mrl，每个添加浓度设6个平行，再供uplc-fld检测；其中，全蛋、蛋清、蛋黄样品除loq水平外，在衍生前均需提取液稀释20倍(保证样品的检测浓度在标准曲线线性范围内)；最后将检测结果带入标准曲线中求得浓度，与实际添加的分析物的浓度相比求得添加回收率。
丹磺酰氯标准品超高效液相色谱图见图1；哌嗪标准品(50μg/kg)超高效液相色谱图见图2；空白鸡肌肉衍生产物超高效液相色谱图见图3；鸡肌肉中添加50μg/kg哌嗪标准品衍生产物超高效液相色谱图见图4；空白鸡肾脏衍生产物超高效液相色谱图见图5；鸡肾脏中添加50μg/kg哌嗪标准品衍生产物超高效液相色谱图见图6；空白鸡肝脏衍生产物超高效液相色谱图见图7；鸡肝脏中添加50μg/kg哌嗪标准品衍生产物超高效液相色谱图见图8；空白鸡全蛋衍生产物超高效液相色谱图见图9；鸡全蛋中添加50μg/kg哌嗪标准品衍生产物超高效液相色谱图见图10；空白鸡蛋清衍生产物超高效液相色谱图见图11；鸡蛋清中添加50μg/kg哌嗪标准品衍生产物超高效液相色谱图见图12；空白鸡蛋黄衍生产物超高效液相色谱图见图13；鸡蛋黄中添加50μg/kg哌嗪标准品衍生产物超高效液相色谱图见图14；空白猪肉衍生产物超高效液相色谱图见图15；猪肉中添加50μg/kg哌嗪标准品衍生产物超高效液相色谱图见图16。
日内精密度：在同一天不同时间点用同一台仪器和同一标准曲线对上述4个添加浓度进行测定，每个添加浓度设6个平行，求出日内rsd。
日间精密度：在7天内不同天、不同标准曲线(每天都绘制标准曲线)同一台仪器对上述4个添加浓度进行测定，每个添加浓度设6个平行，求出日间rsd。
在此条件下，本发明方法提取鸡组织、鸡蛋及猪肉中哌嗪的添加回收率及精密度见表4。
表4空白鸡组织、鸡蛋及猪肉中哌嗪添加回收率和精密度(n＝6)
注：α.最高残留限量
4.3检测限及定量限的确定
准确称取(2.0±0.02)g匀质好的空白样品，按2中的方法制取空白基质提取液。用空白基质提取液逐级稀释低浓度的哌嗪标准工作液，按2中的方法衍生，再检测，重复进样6次，计算信噪比(s/n)。当s/n≥3时对应的哌嗪浓度即为检测限(lod)，当s/n≥10时对应的哌嗪浓度，且该浓度下满足准确度和精密度的要求(一般要求回收率大于70％，相对标准偏差rsd≤20％)即为定量限(loq)。
根据上述6个平行空白样品的添加回收试验，得到在现有条件下，哌嗪在鸡肌肉、鸡肾脏、鸡肝脏、鸡全蛋、鸡蛋清、鸡蛋黄中的lod分别为0.50、1.20、0.80、1.25、1.40、1.05、0.62μg/kg，loq分别为1.80、3.50、2.40、3.50、4.20、3.50、1.85μg/kg。
4.4重复性试验
取100μl哌嗪标准工作液(1.0μg/ml)6份，分别置于10ml离心管中，加入0.12％三乙胺100μl，1.0mg/ml丹磺酰氯600μl，用乙腈定容至2.0ml，置于50℃环境下分别避光反应20min，反应结束后，恢复至室温，涡旋1min，供hplc-fld检测，得出保留时间和峰面积，计算保留时间和峰面积的rsd值。
表5保留时间和峰面积的重现性(n＝6)
由表5可知，在6次测定结果中，哌嗪衍生产物保留时间的rsd为0.10％，峰面积的rsd为0.18％。