一种用加速溶剂萃取仪从鸡组织、鸡蛋及猪肉中提取哌嗪残留并衍生化的方法与流程

本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种用加速溶剂萃取仪从鸡组织、鸡蛋及猪肉中提取哌嗪残留并衍生化的方法。

背景技术：

在对动物源性食品中的兽药进行检测时，只有将药物从样本中提取出来，才可能建立起高效的检测方法。哌嗪为白色针状晶体，弱碱性，极性较大，易溶于水、甲醇、乙腈。哌嗪无紫外、荧光基团，需要与荧光试剂反应生成具有紫外或荧光的物质，以便荧光检测器的检测。国内关于鸡组织、鸡蛋及猪肉中提取哌嗪的方法主要为液-液萃取法，提取剂一般为酸性水溶液和乙腈溶液。但目前为止，采用加速溶剂萃取技术提取鸡组织、鸡蛋及猪肉中哌嗪残留并用丹磺酰氯(DNS-Cl)衍生化的方法在国内尚未见报道。加速溶剂萃取技术具有溶剂用量少、萃取速度快、效率高、回收率高、重现性好和自动化程度高等优势被广泛应用在兽药残留分析领域。哌嗪是一种六元杂环胺，属于胺类化合物，能与常用的衍生试剂(如苯甲酰氯，丹磺酰氯、邻苯二甲醛)发生取代反应。但哌嗪与DNS-Cl反应条件要求严格，如三乙胺和衍生试剂的用量、温度等，不采用加速溶剂萃取技术，与哌嗪衍生化效率低、衍生产物不稳定、提取效率低、结果重现性差。因此，本发明采用加速溶剂萃取技术提取鸡组织、鸡蛋及猪肉中哌嗪残留并用丹磺酰氯衍生化。

技术实现要素：

为了解决从鸡组织、鸡蛋及猪肉中提取哌嗪并衍生化的问题，本发明采用加速溶剂萃取(ASE)技术提取鸡组织、鸡蛋及猪肉中哌嗪残留，并用DNS-Cl与其发生衍生反应。

在试验中发现，在低温条件下或提取试剂为酸性水溶液时，用ASE提取样品后，提取液浑浊且有大量絮状物，不利于样品的衍生化；温度过高后时，哌嗪提取回收率不太理想。因此，对温度和提取试剂进行优化，最终选择温度为80℃，以2％甲酸乙腈为提取试剂，该方法样品基质影响小、提取效率高、回收率高。

哌嗪与DNS-Cl反应对反应条件的要求严格，三乙胺和衍生试剂的用量过少反应不完全，不利于结果的准确定量；用量过多浪费试剂。温度过低不利于反应的进行且耗时；温度过高易导致衍生试剂或衍生产物的分解。本发明在试验条件下，哌嗪与DNS-Cl反应生成的衍生产物带有强的荧光基团，且结构较稳定，能准确定性、定量并成功应用于液相色谱荧光检测法的分析。

本发明所采用的技术方案是：

一种用加速溶剂萃取仪从鸡组织、鸡蛋及猪肉中提取哌嗪残留并衍生化的方法，是：准确称取(2.0±0.02)g均质好的空白样品放于研钵中，并加入4.0g硅藻土研磨，为了达到最佳的萃取效率，尽可能将样品研磨成小颗粒，装入22mL的萃取池中，在1500psi，80℃条件下用ASE萃取，每个萃取池首先用正己烷静态萃取1次，弃掉萃取液；再用2％甲酸乙腈静态萃取2次，收集的萃取液；萃取液经Strata-X-C小柱净化，净化后的样品溶液用15mL离心管收集，置于氮吹仪中吹干；再氮吹后的样品用1.0mL乙腈复溶，超声10min，摇匀，移取100μL 0.12％三乙胺和600μL 1.0mg/mL丹磺酰氯溶液，用乙腈定容至2.0mL，置于50℃环境下避光反应20min，待反应结束后，涡旋1min，过0.22μm有机相针式滤器，滤液供HPLC-FLD检测。

本发明从衍生试剂种类、三乙胺的含量、衍生试剂的用量、衍生温度及衍生时间对衍生反应的条件进行优化。最终选择的最佳衍生条件为：移取100μL0.12％三乙胺和600μL 1.0mg/mL丹磺酰氯溶液，用乙腈定容至2.0mL，置于50℃环境下避光反应20min。

本发明比较了不同提取剂(2％甲酸水、2％甲酸乙腈、2％甲酸水/乙腈的不同比例)、不同提取方法(液-液萃取法和加速溶剂萃取法)对提取回收率的影响，最终选择2％甲酸乙腈溶液作为提取剂，加速溶剂萃取法提取鸡组织、鸡蛋及猪肉中哌嗪残留。哌嗪在鸡组织、鸡蛋及猪肉中添加浓度为LOQ的提取回收率均大于或等于72.86％，添加浓度为0.5MRL、1.0MRL、2.0MRL的提取回收率均大于或等于82.26％，满足兽药残留检测方法的需求。回收率详见表3。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

1.实验动物的饲养和样品采集

本试验随机选取112日龄京海黄鸡(江苏京海禽业集团有限公司)12只(公、母各半)，196日龄的京海黄鸡产蛋鸡(江苏京海禽业集团有限公司)20只，及180日龄三元(杜×长×约)杂交猪(常州康乐农牧有限公司)12头(公、母各半)，单笼或单栏饲养，饲喂不含任何药物的全价饲料(江苏京海禽业集团有限公司饲料厂和扬州市扬大饲料厂提供)，自由饮水。

饲养2周后屠宰，分别取供试鸡的肌肉、肝脏、肾脏及供试猪的肌肉作为空白样品，置于-35℃中保存。此外，京海黄鸡产蛋鸡饲养2周后，连续收集10d鸡蛋，置于4℃冰箱中暂时保存，样品采集后分别取全蛋、蛋清、蛋黄匀浆后分装，分别作为空白样品，置于-35℃中保存。

2.本发明提取与净化步骤

1)准确称取(2.0±0.02)g均质好的空白样品放于研钵中，并加入4.0g硅藻土研磨，为了达到最佳的萃取效率，尽可能将样品研磨成小颗粒，装入22mL的萃取池中，用ASE进行萃取；

2)在1500psi，80℃萃取条件下，每个萃取池首先用正己烷静态萃取1次，弃掉萃取液；再用2％甲酸乙腈静态萃取2次，收集萃取液待用。每个萃取过程15～20min；

3)将上述萃取收集的萃取液经Strata-X-C小柱净化，鸡组织、猪肉用60mg/3mL Strata-X-C柱净化(净化程序见表1)，鸡蛋用100mg/3mL Strata-X-C柱净化(净化程序见表2)。将上述洗脱液用15mL离心管收集，洗脱液置于氮吹仪中吹干，待用；

表1鸡组织及猪肉样品固相萃取程序

表2鸡蛋样品固相萃取程序

3.本发明衍生反应条件

将2中氮吹后的样品用1.0mL乙腈复溶，超声10min，摇匀，移取100μL0.12％三乙胺和600μL 1.0mg/mL丹磺酰氯溶液，用乙腈定容至2.0mL，置于50℃环境下避光反应20min，待反应结束后，涡旋1min，过0.22μm有机相针式滤器，滤液供HPLC-FLD检测。

4.液相色谱条件

色谱柱：Athena C18,4.6×250mm,5μm；流动相A：超纯水；流动相B：乙腈；梯度洗脱条件：B相在0min为95％，在2min内线性降至85％，在4.5min内线性增至88％，在7min线性增至95％，保持3min；检测器：荧光检测器，激发波长330nm，发射波长531nm；流速：1.0mL/min；进样体积：20μL；柱温：25℃。

5.回收率和精密度的测定

准确称取(2.0±0.02)g匀质好的空白样品，按2中的方法制取空白基质提取液。分别取适量哌嗪标准工作液用空白基质提取液稀释系列浓度，按2中的方法进行衍生，使其最终在各空白样品中添加浓度为LOQ、0.5MRL、1.0MRL、2.0MRL，每个添加浓度设6个平行，再供HPLC-FLD检测；其中，全蛋、蛋清、蛋黄样品除LOQ水平外，在衍生前均需提取液稀释20倍(保证样品的检测浓度在标准曲线线性范围内)；最后将检测结果带入标准曲线中求得浓度，与实际添加的分析物的浓度相比求得添加回收率。

日内精密度：在同一天不同时间点用同一台仪器和同一标准曲线对上述4个添加浓度进行测定，每个添加浓度设6个平行，求出日内RSD。

日间精密度：在7天内不同天、不同标准曲线(每天都绘制标准曲线)同一台仪器对上述4个添加浓度进行测定，每个添加浓度设6个平行，求出日间RSD。

在此条件下，本发明方法提取鸡组织、鸡蛋及猪肉中哌嗪的添加回收率及精密度见表3。

表3空白鸡组织、鸡蛋及猪肉中哌嗪添加回收率和精密度(n＝6)

注：α.最高残留限量

Note：α.Maximum Residue Limits。