基于激光诱导荧光与液相色谱联用的真菌毒素检测方法与流程

本发明涉及真菌毒素检测技术领域。更具体地说，本发明涉及一种基于激光诱导荧光与液相色谱联用的真菌毒素检测方法。

背景技术：

真菌毒素是真菌生长繁殖过程中产生的次级代谢物，主要污染粮食及油料作物，造成产品品质下降和严重的经济损失。目前粮油作物及以此为原料加工的食品和饲料中普遍存在的外源性污染毒素主要有黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素等。特别在饲料中，真菌毒素的污染还相当严重。由于真菌毒素具有性质稳定、熔点高、可溶性小、毒性强等特点，粮油原料一旦被污染，利用常规的加工技术很难去除，残留在粮油食品和饲料中的毒素，最终通过食物链传递严重危及食品安全。真菌毒素污染已成为危害食品安全的主要因素之一。

目前真菌毒素检测方法主要包括免疫分析法、色谱分析法和光谱分析法等。免疫检测方法虽然能实现对主要真菌毒素的快速测定，但是在检测结果的重现性、稳定性和准确性上存在不足。薄层层析法经济实用，但精确度低。色谱检测方法虽然准确、可靠，但是设备昂贵、检测成本高、不能满足大量样品快速检测的要求。荧光光度法常结合免疫亲和净化，能够定性或定量分析真菌毒素，具有方便、快捷、灵敏度高的特点，是AOAC国际组织和我国出入境检验检疫行业通常使用的标准检测方法。激光诱导荧光光谱分析法具有选择性强、样品用量少、方法简便、检测速度快、可实现现场检测等优点，是目前灵敏度最高的检测技术之一。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种基于激光诱导荧光与液相色谱联用的真菌毒素检测方法，该方法便捷、灵敏、准确，适用于粮油食品与饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素含量的测定，满足生产过程监控、现场检测和快速筛查需要。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种基于激光诱导荧光与液相色谱联用的真菌毒素检测方法，其通过在高效液相色谱的色谱柱后连接激光诱导荧光检测器，构成激光诱导荧光与液相联用的真菌毒素的检测装置，并采用所述检测装置测定试样中真菌毒素的色谱峰面积，根据真菌毒素的标准曲线换算得到试样中真菌毒素的含量。

优选的是，所述的基于激光诱导荧光与液相色谱联用的真菌毒素检测方法，其包括以下步骤：

步骤一、制备待检测样品；

步骤二、用稀释剂制备一系列的不同浓度的真菌毒素的标准溶液，采用所述检测装置依次对一系列真菌毒素的标准溶液进行检测，记录一系列标准溶液对于的色谱峰面积值，建立真菌毒素的浓度与色谱峰面积的关系方程式；

步骤三、将步骤一得到的样品用稀释剂溶解制得待检测供试品，采用所述检测装置对所述待检测供试品进行检测，记录所述待检测供试品对应的色谱峰面积值，将该色谱峰面积值带入步骤二中得到的关系方程式中，解出样品中真菌毒素的含量。

优选的是，所述的基于激光诱导荧光与液相色谱联用的真菌毒素检测方法，步骤一中待检测样品的制备方法具体为：

S1、取5～25g的待检测试样粉碎后与2～10g的氯化钠和20～100mL的提取剂混匀，然后经滤纸过滤后收集滤液，取10～30mL的滤液加入40～80mL的水稀释，并用玻璃纤维纸过滤，得样品提取液；其中，所述提取剂为体积浓度为40～90％的甲醇水溶液或体积浓度为40～90％的乙腈水溶液；

S2、将免疫亲和柱连接于50.0mL注射器下方，移取10～30mL的步骤S1得到的样品提取液注入注射器中，调节注射器内部的压力使得样品提取液以2～10mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2～3mL的空气通过免疫亲和柱，然后用5～20mL的去离子水淋洗免疫亲和柱两次，并使2～3mL的空气通过免疫亲和柱后用1～5mL色谱级甲醇洗脱，控制甲醇的流速为1～5mL/min，收集全部洗脱液，将洗脱液用真空泵抽干，即得。

优选的是，所述的基于激光诱导荧光与液相色谱联用的真菌毒素检测方法，其特征在于，真菌毒素为黄曲霉毒素、赭曲霉毒素或玉米赤霉烯酮。

优选的是，所述的基于激光诱导荧光与液相色谱联用的真菌毒素检测方法，黄曲霉毒素对应的所述稀释剂为体积浓度为45％的甲醇水溶液；赭曲霉毒素对应的所述稀释剂为体积比为96:102:2的乙腈、水和冰醋酸的混合溶液；玉米赤霉烯酮对应的所述稀释剂为体积比为46:46:8的乙腈、水和甲醇的混合溶液。

优选的是，所述的基于激光诱导荧光与液相色谱联用的真菌毒素检测方法，所述检测装置中激光诱导荧光检测器的激发波长为260～410nm，发射波长450～510nm。

优选的是，所述的基于激光诱导荧光与液相色谱联用的真菌毒素检测方法，所述检测装置中激光诱导荧光检测器的激发波长为260～410nm，发射波长450～510nm。

优选的是，所述的基于激光诱导荧光与液相色谱联用的真菌毒素检测方法，所述试样为食品或饲料。

本发明至少包括以下有益效果：

1、本发明以激光诱导荧光与液相色谱联用技术为核心，采用均质搅拌提取、免疫亲和净化实现真菌毒素的现场及实验室检测。所建方法具有简便快速,准确可靠,灵敏度高，重现性好、安全无污染等优点，能够满足粮油食品与饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素现场检测需要；

2、本发明样品检测实验周期约2小时，成本在60～80元/样；国标方法样品检测实验周期约3小时，成本在100～120元/样。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明在一个实施例中所述检测装置的结构示意图；

图2为本发明在另一个实施例中所述的基于激光诱导荧光与液相色谱联用的真菌毒素检测方法，的流程示意图；

图3为本发明在另一个实施例中黄曲霉毒素的标准曲线图；

图4为本发明在另一个实施例中赭曲霉毒素的标准曲线图；

图5为本发明在另一个实施例中玉米赤霉烯酮的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

在本发明的描述中，术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

如图1所示，本发明中激光诱导荧光与液相联用的真菌毒素的检测装置，主要包括光源1、荧光液相流通池2光纤光谱仪3。其中，光源1为峰值波长为360nm的激光器，光源1发射激光使真菌毒素产生本征荧光，通过液相流通池2收集本征荧光，并由光光纤谱仪将其转化成数字信号，并经计算机4处理获得结果。试样中的真菌毒素经提取、净化、浓缩后采用液相色谱分离，荧光检测器检测，记录色谱峰面积值，通过由外标法工作曲线进行定量分析。

<实施例1>

如图2所示，本发明所述的基于激光诱导荧光与液相色谱联用的真菌毒素检测方法，包括以下步骤：

步骤一、取5g的食品粉碎后与2g的氯化钠和20mL的提取剂混匀，然后经滤纸过滤后收集滤液，取10mL的滤液加入40mL的水稀释，并用玻璃纤维纸过滤，得样品提取液；将黄曲霉毒素免疫亲和柱连接于50.0mL注射器下方，移取10mL的样品提取液注入注射器中，调节注射器内部的压力使得样品提取液以2mL/min流速通过黄曲霉毒素免疫亲和柱，直至2mL的空气通过黄曲霉毒素免疫亲和柱，然后用5mL的去离子水淋洗黄曲霉毒素免疫亲和柱两次，并使2mL的空气通过黄曲霉毒素免疫亲和柱后用1mL色谱级甲醇洗脱，控制甲醇的流速为1mL/min，收集全部洗脱液，将洗脱液用真空泵抽干，得待检测样品；其中，所述提取剂为体积浓度为40％的甲醇水溶液；

步骤二、用45％的甲醇水溶液制备一系列的不同浓度的黄曲霉毒素的标准溶液，采用所述检测装置依次对一系列黄曲霉毒素的标准溶液进行检测，记录一系列标准溶液对于的色谱峰面积值，建立黄曲霉毒素的浓度与色谱峰面积的关系方程式(如图3和表1所示)；一系列的黄曲霉毒素的标准溶液的浓度分别为0.5ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL和20.0ng/mL；

表1黄曲霉毒素的浓度及色谱峰面积

步骤三、用步骤二中配置任意一种浓度的黄曲霉毒素的标准溶液的，相同体积的45％的甲醇水溶液溶解步骤一得到的样品，制得待检测供试品，采用所述检测装置对所述待检测供试品进行检测，记录所述待检测供试品对应的色谱峰面积值，将该色谱峰面积值带入步骤二中得到的关系方程式中，解出样品中黄曲霉毒素的含量；

其中，所述检测装置中激光诱导荧光检测器的激发波长为260nm，发射波长450nm。

黄曲霉毒素的最低检测浓度为0.04μg/kg。

<实施例2>

如图2所示，本发明所述的基于激光诱导荧光与液相色谱联用的真菌毒素检测方法，包括以下步骤：

步骤一、取25g的饲料粉碎后与10g的氯化钠和100mL的提取剂混匀，然后经滤纸过滤后收集滤液，取30mL的滤液加入80mL的水稀释，并用玻璃纤维纸过滤，得样品提取液；将赭曲霉毒素免疫亲和柱连接于50.0mL注射器下方，移取30mL的样品提取液注入注射器中，调节注射器内部的压力使得样品提取液以10mL/min流速通过赭曲霉毒素免疫亲和柱，直至3mL的空气通过赭曲霉毒素免疫亲和柱，然后用20mL的去离子水淋洗赭曲霉毒素免疫亲和柱两次，并使3mL的空气通过赭曲霉毒素免疫亲和柱后用5mL色谱级甲醇洗脱，控制甲醇的流速为5mL/min，收集全部洗脱液，将洗脱液用真空泵抽干，得待检测样品；其中，所述提取剂为体积浓度为90％的甲醇水溶液；

步骤二、用稀释剂制备一系列的不同浓度的赭曲霉毒素标准溶液，采用所述检测装置依次对一系列赭曲霉毒素的标准溶液进行检测，记录一系列标准溶液对于的色谱峰面积值，建立赭曲霉毒素的浓度与色谱峰面积的关系方程式(如图4和表2所示)；一系列的赭曲霉毒素的标准溶液的浓度分别为1.0ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL和50.0ng/mL；

表2赭曲霉毒素的浓度及色谱峰面积

步骤三、用步骤二中配置任意一种浓度的黄曲霉毒素的标准溶液的，相同体积的稀释剂溶解步骤一得到的待检测样品，制得待检测供试品，采用所述检测装置对所述待检测供试品进行检测，记录所述待检测供试品对应的色谱峰面积值，将该色谱峰面积值带入步骤二中得到的关系方程式中，解出样品中赭曲霉毒素的含量；

其中，所述稀释剂为体积比为96:102:2的乙腈、水和冰醋酸的混合溶液；

所述检测装置中激光诱导荧光检测器的激发波长为410nm，发射波长510nm。

赭曲霉毒素最低检测浓度为0.3μg/kg。

<实施例3>

如图2所示，本发明所述的基于激光诱导荧光与液相色谱联用的真菌毒素检测方法，包括以下步骤：

步骤一、取15g的食品粉碎后与6g的氯化钠和60mL的提取剂混匀，然后经滤纸过滤后收集滤液，取20mL的滤液加入60mL的水稀释，并用玻璃纤维纸过滤，得样品提取液；将玉米赤霉烯酮免疫亲和柱连接于50.0mL注射器下方，移取20mL的样品提取液注入注射器中，调节注射器内部的压力使得样品提取液以6mL/min流速通过玉米赤霉烯酮免疫亲和柱，直至2.5mL的空气通过玉米赤霉烯酮免疫亲和柱，然后用12mL的去离子水淋洗玉米赤霉烯酮免疫亲和柱两次，并使2.5mL的空气通过玉米赤霉烯酮免疫亲和柱后用3mL色谱级甲醇洗脱，控制甲醇的流速为3mL/min，收集全部洗脱液，将洗脱液用真空泵抽干，得待检测样品；其中，所述提取剂为体积浓度为65％乙腈水溶液；

步骤二、用稀释剂制备一系列的不同浓度的玉米赤霉烯酮的标准溶液，采用所述检测装置依次对一系列玉米赤霉烯酮的标准溶液进行检测，记录一系列标准溶液对于的色谱峰面积值，建立玉米赤霉烯酮的浓度与色谱峰面积的关系方程式(如图5和表3所示)；系列的玉米赤霉烯酮的标准溶液的浓度分别为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL和500ng/mL；

表3玉米赤霉烯酮的浓度及色谱峰面积

步骤三、用步骤二中配置任一一种浓浓度的玉米赤霉烯酮的标准溶液，相同体积的稀释剂溶剂待检测样品，得待检测供试品，采用所述检测装置对所述待检测供试品进行检测，记录所述待检测供试品对应的色谱峰面积值，将该色谱峰面积值带入步骤二中得到的关系方程式中，解出样品中玉米赤霉烯酮的含量；

其中，所述稀释剂为为体积比为46:46:8的乙腈、水和甲醇的混合溶液；

所述检测装置中激光诱导荧光检测器的激发波长为335nm，发射波长480nm。

玉米赤霉烯酮最低检测浓度为2.5μg/kg。

<实施例4>

称取5g食用油试样放入搅拌杯中，加入2-5g氯化钠及20mL浓度为50％-80％的甲醇-水溶液或60-90％的乙腈-水溶液，混匀后高速搅拌。提取液经滤纸过滤后移取10mL滤液并加入40mL水稀释，用玻璃纤维纸过滤至滤液澄清，备用。将黄曲霉毒素免疫亲和柱连接于50ml注射器下方，移取25mL样品稀释液，调节压力使溶液以2-10mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2-3mL空气通过柱体。以5-20mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体。加入1mL色谱级甲醇洗脱，控制流速为1-3mL/min，收集全部洗脱液至透明小瓶中，用真空泵抽空甲醇溶剂，得检测试样，用黄曲霉毒素相对应的稀释剂溶解检测试样，得待检测供试品，将待检测供试品注入高效液相色谱的色谱柱中，经液相分离提纯，过柱后流入荧光流通池2中，测的色谱峰面积为6537，该测量值通过标准曲线换算得到食用油样品中黄曲霉毒素实际含量为1.68μg/kg。采用GB 5009.22-2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》液相色谱法测定相同样品，食用油中黄曲霉毒素含量检测值为1.75μg/kg。说明本发明检测结果和国标方法检测结果基本一致，在国标允许误差范围内，准确可靠。

<实施例5>

称取1.5kg花生，用高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于2mm孔径试验筛，混合均匀后缩分至100g。称取25g花生试样放入搅拌杯中，加入120mL浓度为60％-90％的甲醇-水溶液或乙腈-水溶液，混匀后高速搅拌。提取液经滤纸过滤后移取20mL滤液并加入30mL水稀释，用玻璃纤维纸过滤至滤液澄清，备用。将黄曲霉毒素免疫亲和柱连接于50ml注射器下方，移取15mL样品稀释液，调节压力使溶液以2-10mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2-3mL空气通过柱体。以5-20mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体。加入2mL色谱级甲醇洗脱，控制流速为1-3mL/min，收集全部洗脱液至透明小瓶中，用真空泵抽空甲醇溶剂，得检测试样，用黄曲霉毒素相对应的稀释剂溶解检测试样，得待检测供试品，将待检测供试品注入高效液相色谱的色谱柱中，经液相分离提纯，过柱后流入荧光流通池2中，测的色谱峰面积为10365，该测量值通过标准曲线换算得到花生中黄曲霉毒素实际含量为5.12μg/kg。采用GB 5009.22-2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》液相色谱法测定相同样品，花生中黄曲霉毒素含量检测值为5.06μg/kg。说明本发明检测结果和国标方法检测结果基本一致，在国标允许误差范围内，准确可靠。

<实施例6>

称取1kg猪饲料，用四分法缩减取200g，高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于0.45mm孔径试验筛，混合均匀。称取25g饲料试样放入搅拌杯中，加入2-5g氯化钠及100mL浓度为50％-80％的甲醇-水溶液或60-90％的乙腈-水溶液，混匀后高速搅拌。提取液经滤纸过滤后移取20mL滤液并加入40mL水稀释，用玻璃纤维纸过滤至滤液澄清，备用。将黄曲霉毒素免疫亲和柱连接于50ml注射器下方，移取10mL样品稀释液，调节压力使溶液以2-10mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2-3mL空气通过柱体。以5-20mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体。加入1mL色谱级甲醇洗脱，控制流速为1-3mL/min，收集全部洗脱液至透明小瓶中，用真空泵抽空甲醇溶剂，得检测试样，用黄曲霉毒素相对应的稀释剂溶解检测试样，得待检测供试品，将待检测供试品注入高效液相色谱的色谱柱中，经液相分离提纯，过柱后流入荧光流通池2中，测的色谱峰面积为30492，该测量值通过标准曲线换算得到猪饲料中黄曲霉毒素实际含量为8.62μg/kg。采用GB/T 30955-2014《饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》液相色谱法测定相同样品，猪饲料中黄曲霉毒素含量检测值为8.76μg/kg。说明本发明检测结果和国标方法检测结果基本一致，在国标允许误差范围内，准确可靠。

<实施例7>

称取25g小麦粉试样放入搅拌杯中，加入2-5g氯化钠及100mL浓度为50％-80％的甲醇-水溶液或乙腈-水溶液，混匀后高速搅拌。提取液经滤纸过滤后移取10mL滤液并加入40mL水稀释，用玻璃纤维纸过滤至滤液澄清，备用。将赭曲霉毒素免疫亲和柱连接于50ml注射器下方，移取20mL样品稀释液，调节压力使溶液以2-10mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2-3mL空气通过柱体。以5-20mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体。加入1mL色谱级甲醇洗脱，控制流速为1-3mL/min，收集全部洗脱液至透明小瓶中用真空泵抽空甲醇溶剂，得检测试样，用赭曲霉毒素相对应的稀释剂溶解检测试样，得待检测供试品，将待检测供试品注入高效液相色谱的色谱柱中，经液相分离提纯，过柱后流入荧光流通池2中，测的色谱峰面积为3601，该测量值通过标准曲线换算得到小麦粉中赭曲霉毒素实际含量为1.25μg/kg。采用GB 5009.96-2016《食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定》液相色谱法测定相同样品，小麦粉中赭曲霉毒素含量检测值为1.15μg/kg。说明本发明检测结果和国标方法检测结果基本一致，在国标允许误差范围内，准确可靠。

<实施例8>

称取1.5kg玉米，用四分法缩减取200g，高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于2mm孔径试验筛，混合均匀。称取20g玉米粉试样放入搅拌杯中，加入2-5g氯化钠及80mL浓度为60-90％的甲醇-水溶液或乙腈-水溶液，混匀后高速搅拌。提取液经滤纸过滤后移取15mL滤液并加入45mL水稀释，用玻璃纤维纸过滤至滤液澄清，备用。将玉米赤霉烯酮免疫亲和柱连接于50ml注射器下方，移取20mL样品稀释液，调节压力使溶液以2-10mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2-3mL空气通过柱体。以5-20mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体。加入1mL色谱级甲醇洗脱，控制流速为1-3mL/min，收集全部洗脱液至透明小瓶中，用真空泵抽空甲醇溶剂，得检测试样，用玉米赤霉烯酮相对应的稀释剂溶解检测试样，得待检测供试品，将待检测供试品注入高效液相色谱的色谱柱中，经液相分离提纯，过柱后流入荧光流通池2中，测的色谱峰面积为495，该测量值通过标准曲线换算得到样品中玉米赤霉烯酮实际含量为38.91μg/kg。采用GB 5009.209-2016《食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定》液相色谱法测定相同样品，玉米中玉米赤霉烯酮毒素含量检测值为40.02μg/kg。说明本发明检测结果和国标方法检测结果基本一致，在国标允许误差范围内，准确可靠。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。