测定生物样品中丙酮酸乙酯及其代谢物丙酮酸的方法与流程

本发明属于生物医药
技术领域：
，涉及一种可靠的方法用以测定生物体例如大鼠给予丙酮酸乙酯后生物样品例如血中的丙酮酸乙酯及其代谢物丙酮酸的含量，以评估丙酮酸乙酯在体内的行为。特别地，本发明涉及一种测定生物样品例如大鼠血浆中丙酮酸乙酯及其代谢物丙酮酸的方法。本发明建立的HPLC-UV法，选择性强、操作简单、分析时间快，特别地适用于丙酮酸乙酯药代动力学或者毒代动力学研究中大批量血浆样品的分析。
背景技术：
：丙酮酸乙酯(EthylPyruvate，简称EP)是丙酮酸的酯化物，是一种具有芳香气味的油状化合物。人们最开始认识到丙酮酸乙酯的药理作用源于对丙酮酸的研究。早在1904年，Holleman[BrandK.Aerobicglycolysisbyproliferatingcells:protectionagainstoxidativestressattheexpenseofenergyyield[J].JBioenergBiomembr，1997，29(4):355-364]就发现了丙酮酸能消除内源性的H2O2，具有抗氧化作用。人们对于丙酮酸乙酯药理作用的认识也是源于它的抗氧化作用[施宏，梁伟民.丙酮酸乙酯的抗炎作用及机制[J].复旦学报(医学版)，2012，39(3)：309-312]。随着研究的深入，人们又陆续发现了丙酮酸乙酯抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤、抗脓毒等其他药理作用[乔京贵，赵中夫.丙酮酸乙酯的抗炎作用研究进展[J].长治医学院学报，2005，19(4):318-320；王浩，何义舟，罗哲.丙酮酸乙酯对肝细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制研究[J].中国临床医学，2015，22(2):195-198；梁旭阳，程宝泉，贾俊英，等.丙酮酸乙酯对人胰腺癌细胞的抑制作用[J].山东大学学报(医学版)，2011，49(5):48-53；马艳梅，霍正禄，梅冰，等.丙酮酸乙酯对脓毒症大鼠血清HMGB1表达的影响及其作用的研究[J].中国急救医学，2009，29(5)：442-445]，是一种非常具有研究前景和药用价值的小分子药物。目前，已有文献报道关于HPLC-UV法测定微囊制剂中[李延志，孙昱，张春枝.丙酮酸乙酯的微囊化与微囊中含量检测[J].安徽农业科学，2010，38(36):20518-20520]丙酮酸乙酯的含量，以及气相色谱法测定丙酮酸乙酯注射液中丙酮酸乙酯的含量[王晓云，毛发燕，王小刚.GC法测定丙酮酸乙酯的含量[J].中国药师，2016，19(5)：1021-1023；彭洁，王钊，李晓晔.GC法测定丙酮酸乙酯注射液中EP的含量[J].现代生物医学进展，2012，12(15)：2822-2825]。另已有文献报道HPLC-UV法测定发酵液中[高年发，吴迪，张健.反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定丙酮酸发酵液中丙酮酸[J].天津科技大学学报，2006，21(l)：21-24]、葡萄酒中[陈学诗，王越，安家彦.HPLC和分光光度法测定葡萄酒中丙酮酸[J].食品工业，2015，36(8)：290-292]以及壳聚糖纳米粒中[徐凤娥，赵兵新，孙树茂.反相高效液相色谱法测定壳聚糖纳米粒中丙酮酸乙酯的含量[J].中国组织工程研究，2014，18(8)：1205-1210]丙酮酸的含量。但是，目前尚未有关于测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量方法的报道。在丙酮酸乙酯的制剂开发过程中，需要对丙酮酸乙酯的体内行为进行评价，典型的临床前工作包括药代动力学和毒代动力学评价，以及后续的临床阶段的药物体内行为评价。这些体内行为评价都将涉及到生物样品例如血浆样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸的含量测定。因此，本领域仍然期待有能够客观准确的用于生物样品例如血浆样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸的测定方法，从而能够为有关丙酮酸乙酯的药品开发工作提供帮助。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种能够客观准确的用于生物样品例如血浆样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸的测定方法，从而能够为有关丙酮酸乙酯的药品开发工作提供帮助。已经出人意料的发现，本发明方法完全能够满足生物样品例如血浆样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸的测定，本发明基于此发现而得以完成。为此，本发明提供了一种测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量的方法，该方法使用紫外检测的高效液相色谱法(其在本发明中可简称为LC-UV法或者HPLC-UV法)，以生物样品中的丙酮酸含量为检测指标，用从未给予丙酮酸乙酯的生物体获得的生物样品中内源性丙酮酸含量为本底，测定从给予丙酮酸乙酯的生物体获得的生物样品中代谢性丙酮酸含量，进而测定丙酮酸乙酯在生物体内的动力学；所述高效液相色谱法包括如下项目或步骤：(1)色谱分析条件色谱柱为C18柱，并配合C18保护柱使用；流动相为0.025～0.075mol/L的KH2PO4(其中包含0.6～0.8％的H3PO4)缓冲液；流速为0.8～1.2ml/min，等度洗脱；进样量均为10～50μL；紫外检测波长为205～220nm；(2)代血浆的配制和测定精密称取牛血清白蛋白300mg，溶于生理盐水10mL中，涡旋混匀，得到空白代血浆；取空白代血浆50μL，置于1.5mL离心管中，依次加入超纯水10μL和沉淀剂乙腈150μL，涡旋3min，离心(例如12000rpm，10min)，取上清液10μL进行HPLC-UV分析测定，以确定空白代血浆中无丙酮酸干扰；(3)丙酮酸标准溶液的配制和测定精密称取丙酮酸对照品50.0mg于10mL容量瓶中，用超纯水溶解、定容、摇匀，配制成浓度为5.0mg/mL的储备液，4℃冰箱冷藏保存；精密量取一定体积的储备液，用水稀释成浓度为25、50、100、250、500、1000和2500μg/mL的系列标准溶液；取空白代血浆50μL，置于1.5mL离心管中，加入丙酮酸系列标准溶液10μL，配制成相当于浓度为5、10、20、50、100、200、500μg/mL的代血浆样品，加入沉淀剂乙腈150μL，涡旋3min，离心(例如12000rpm，10min)，取上清液10μL进行HPLC-UV分析测定，根据色谱响应值与丙酮酸加样量确定标准曲线；(4)未给予丙酮酸乙酯生物体的生物样品中丙酮酸含量的测定取未给予丙酮酸乙酯的生物体(例如大鼠)生物样品血浆50μL，置于1.5mL离心管中，依次加入超纯水10μL和乙腈沉淀剂150μL，涡旋3min，离心(例如12000rpm，10min)，取上清液10μL进行HPLC-UV分析测定，根据色谱响应值与标准曲线确定该生物样品中内源性丙酮酸含量，作为丙酮酸的本底含量；(5)给予丙酮酸乙酯生物体的生物样品中丙酮酸含量的测定取给予丙酮酸乙酯的生物体(例如大鼠)生物样品血浆50μL，置于1.5mL离心管中，依次加入超纯水10μL和乙腈沉淀剂150μL，涡旋3min，离心(例如12000rpm，10min)，取上清液10μL进行HPLC-UV分析测定，根据色谱响应值与标准曲线确定该生物样品中代谢性丙酮酸含量，作为给予丙酮酸乙酯后生物体生物样品中丙酮酸的含量；(6)根据步骤(4)和步骤(5)的结果确定生物样品中因生物体给予丙酮酸乙酯所贡献的丙酮酸含量，任选的根据生物样品取样时间确定丙酮酸乙酯在生物体内的动力学。根据本发明测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量的方法，其中所述的色谱柱是柱长20～30mm、内径4.6mm、填料粒度5μm的色谱柱。根据本发明测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量的方法，其中所述的色谱柱是的美国色谱科公司的Discovery品牌的C18柱。根据本发明测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量的方法，其中，所述的保护柱是美国Phenomenex公司的规格为的4×3.0mmI.D.C18保护柱。根据本发明测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量的方法，其中流动相KH2PO4缓冲液中包含0.6～0.8％的H3PO4。根据本发明测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量的方法，其中所述生物体选自：人、大鼠、小鼠、犬、猴等。根据本发明测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量的方法，其中所述生物样本选自：全血、血浆、尿等。根据本发明测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量的方法，其中离心是以12000rpm离心10min。根据本发明测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量的方法，其中流速为1ml/min。根据本发明测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量的方法，其中进样量为10～20μL。根据本发明测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量的方法，其中进样量为10μL。根据本发明测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量的方法，其中紫外检测波长为210nm。在本发明上述操作方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的实例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。本发明人已经发现，丙酮酸乙酯在大鼠血浆中极不稳定，HPLC-UV法监测向大鼠血浆中添加丙酮酸乙酯后丙酮酸乙酯血药浓度随时间变化的曲线，显示丙酮酸乙酯在大鼠血浆中2min代谢了50％，10min就已检测不到丙酮酸乙酯。本发明人已经发现，大鼠空白血浆中含有内源性丙酮酸，会干扰丙酮酸的含量测定，而人造代血浆对丙酮酸的测定无干扰，可以采用人造代血浆替代大鼠空白血浆进行方法学的验证。本发明人已经发现，在线性范围和最低定量限的测定中，使用丙酮酸标准系列溶液处理并进行测定，以血浆中待测物的浓度为横坐标，待测物丙酮酸的峰高为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即标准曲线。根据标准曲线测定结果显示，丙酮酸代血浆浓度测定方法的线性范围为5～500μg/mL，最低定量限为5μg/mL，完全可以满足生物体生物样品例如大鼠血浆中丙酮酸的定量检测。本发明人已经发现，在精密度与准确度测定中，使用丙酮酸质控溶液进行测定，结果显示本发明LC-UV法测定大鼠血浆中丙酮酸时具有优良的准确度与精密度。本发明人已经发现，在稳定性考察中，显示储备液和质控工作溶液等溶液具有良好稳定性，能够满足一般的测定要求。此外还发现，存在于各种血浆(包括代血浆和生物样品血浆)中的丙酮酸亦具有优良的稳定性，例如在4℃-24h、室温-6h、反复冻融3次、-20℃长期放置等这些方式处理后，样品中的丙酮酸均具有优良的稳定性。已经发现，丙酮酸乙酯在大鼠及犬血浆中非常不稳定，给药后10分钟在血浆中即无法检测到原形药物丙酮酸乙酯。因此本发明在一些试验中尝试检测其活性代谢物丙酮酸。最初本发明人试图建立LC-MS/MS法来测定丙酮酸浓度，尝试了沉淀蛋白和液液萃取的前处理方法，沉淀蛋白法制得的样品应用LC-MS/MS法进行检测时具有极强的基质抑制效应，导致无法用LC-MS/MS技术对血浆中丙酮酸含量进行准确定量。而采用液液萃取法(乙酸乙酯：异丙醇＝9:1)虽然能够测到丙酮酸，但是该方法线性关系较差，定量限高，且提取回收率不足10％，不适用于生物样品的分析。进而本发明人又改用HPLC-UV法监测血浆中丙酮酸乙酯的代谢物丙酮酸的浓度，经过不断探索，现已建立并验证了血浆中丙酮酸浓度测定的HPLC-UV法。根据本发明测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量的方法，其中随所述量的沉淀剂乙腈一起还添加氯化钙和丙二醇，二者在本发明可分别称为盐和醇；在一个实施方案中，随所述量的沉淀剂乙腈一起还添加的上述两种物质的量分别为0.2mg和10μl；在一个实施方案中，二者是溶解在一起形成盐醇溶液后与所述乙腈一起添加的。已经出人意料的发现，当组合使用上述两种额外添加剂盐和醇后可以显著的提高丙酮酸的提取回收率，而当不使用它们之一或者二者时均不能有效提高回收率。上述盐和醇无紫外吸收，不影响测定。在第一个补充的试验中进行回收率测试，照本发明实施例1之“1.5.2.丙酮酸测定大鼠血浆样品预处理”节所记载的，向从给予丙酮酸乙酯的大鼠采集的含药血浆样品中额外添加2μg/mL、20μg/mL、200μg/mL丙酮酸，接着，依次加入超纯水10μL和乙腈沉淀剂150μL，涡旋3min，离心(12000rpm)10min，取上清液10μL进行HPLC-UV分析，结合实施例1的其它步骤操作过程，根据色谱响应值进行加样回收率的的测定；结果显示，照实施例1的方法，三个加样浓度的加样回收率分别为57.2±4.8％、47.7±6.4％、53.1±5.3％，三个回收率的RSD值均在6.6～8.2％这个小于10％的理想范围内，显示这种方法虽然精密度良好但是回收率偏低，尽管在生物样品测试中有时可以免强接受，但是并不能令人满意。在第二个补充的试验中进行回收率测试，参照上述第一个补充的试验，不同的仅是在添加乙腈沉淀剂150μL的同时添加10μL盐醇溶液(其由0.2mg盐和10μl醇的比例配制得到)，测试结果显示三个加样浓度的回收率分别为92.5±8.1％、89.3±9.2％、91.5±7.3％，三者RSD均在6.3～8.6％这个理想的范围内，表明样品处理时补加上述盐醇时可以显著提高回收率。在第三个补充的试验中进行回收率测试，参照上述第二个补充的试验，不同的仅是不添加盐；在第四个补充的试验中进行回收率测试，参照上述第二个补充的试验，不同的仅是不添加醇(用水代替溶解盐)；在第五个补充的试验中进行回收率测试，参照上述第二个补充的试验，不同的仅是将其中的醇改用等量丙三醇；此第三至第五个补充试验中三个加样浓度回收率均在44～61％范围内，RSD均小于10％，显示回收率明显的偏低。此外，在上述第二至第五个补充试验中，已经发现这些补充试验的专属性、线性范围和最低定量限、精密度与准确度、溶液稳定性、代血浆样品稳定性和血浆样品稳定性等参数与实施例1基本相同。另外，经过对空白大鼠血浆的考察，本发明人发现，丙酮酸是大鼠血浆中的内源性物质，空白基质中存在一定的基线值，为了扣除基质中内源性丙酮酸对测量的影响，本发明人采用人造空白血浆(适当浓度的牛血清白蛋白[孙丽丽，孟繁华，虞林，郭继芬.液相色谱-串联质谱法测定大鼠血浆中黄体酮的浓度[J]国际药学研究杂志，2015,42(1)：107-111])替代大鼠空白血浆建立标准曲线，进行方法学的验证。为了将极性较大的丙酮酸分离出来，本发明人选用了25cm较长的C18色谱柱，优化流动相时本发明人发现，加入适量的KH2PO4能够获得较好的峰型，磷酸越多，峰位后移，相反，磷酸越少，峰位前移，均会导致无法与杂质及溶剂峰完全分离。最终，本发明人选择0.05mol/LKH2PO4(含0.7％H3PO4)缓冲水溶液作为流动相等度洗脱，在获得较好分离度的同时，亦获得了良好的色谱峰型，每个样品的分析时间为4.5min。生物样品的前处理对于待测物的测定十分重要，常用的前处理方法有沉淀蛋白和液液萃取，我们首先尝试了甲醇和乙腈做沉淀剂，发现乙腈的沉淀效果更好。由于丙酮酸的极性很大，不适合用有机溶剂进行液液萃取。此外，沉淀蛋白法操作简单，且提取回收率高。本发明人又对沉淀剂的用量进行考察，最终采用了以3倍血浆量的乙腈做沉淀剂处理血浆样品。本研究建立的HPLC-UV法，选择性强，操作简单，分析时间快，适用于丙酮酸乙酯药代动力学和/或毒代动力学研究中大批量血浆样品的分析。附图说明图1：HPLC-UV法监测向大鼠血浆中添加丙酮酸乙酯后丙酮酸乙酯血药浓度随时间变化的曲线。图2：代血浆和大鼠空白血浆中丙酮酸的色谱图(A.空白代血浆色谱图；B.空白代血浆加入丙酮酸对照品色谱图；C.空白大鼠血浆色谱图；D.大鼠肌注丙酮酸乙酯注射液后的血浆样品色谱图)。具体实施方式通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明所提供的以下实施例仅用于解释目的而不是用于，也不应被解释为以任何方式限制本发明。本领域那些技术人员将会认识到在不超越本发明的精神或范围的情况下可对以下实施例做出常规变化和修改。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。实施例1：测定生物样品中丙酮酸乙酯或其代谢产物丙酮酸含量的方法1.测定方法和过程1.1.测试物的提供提供未给予丙酮酸乙酯的大鼠血浆，提供给予丙酮酸乙酯后不同时间采取的大鼠血浆；其它物质和测试用材料根据常规要求提供。1.2.色谱分析条件丙酮酸乙酯血浆样品测定的色谱柱为EclipseXDB-C8(4.6×150mm，5μm，美国Agilent公司)，C18保护柱(4×3.0mmI.D.，美国Phenomenex公司)；流动相为水-乙腈(60:40，v/v)。丙酮酸血浆样品测定的色谱柱为DiscoveryC18柱(4.6×250mm，5μm，美国色谱科公司)，C18保护柱(4×3.0mmI.D.，美国Phenomenex公司)；流动相为0.05mol/LKH2PO4(含0.7％H3PO4)缓冲液。流速均为1ml/min，等度洗脱；进样量均为10μL；紫外检测波长均为210nm。1.3.储备液的配制，标准溶液的配制和测定丙酮酸乙酯溶液配制：精密称取丙酮酸乙酯对照品20.0mg，置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容、摇匀，配制成2.0mg/mL的储备液，于-20℃冷冻保存。精密量取一定体积的储备液，用乙腈稀释成浓度为50、100、250、500、1000、2000μg/mL的系列标准溶液。另外称取丙酮酸乙酯对照品，依同法配制浓度为80、400和1600μg/mL的质控工作溶液，于4℃冰箱保存备用。取空白代血浆50μL，置于1.5mL离心管中，加入丙酮酸乙酯系列标准溶液系列标准溶液或质控工作溶液10μL，加入沉淀剂乙腈150μL，涡旋3min，离心(12000rpm，10min)，取上清液10μL进行HPLC-UV分析测定，根据色谱响应值计算相关参数。丙酮酸对照品系列溶液配制：精密称取丙酮酸对照品50.0mg于10mL容量瓶中用超纯水定容、摇匀，配制成浓度为5.0mg/mL的储备液，4℃冰箱冷藏保存。精密量取一定体积的储备液，用水稀释成浓度为25、50、100、250、500、1000和2500μg/mL的系列标准溶液。依同法配制浓度为40、400和2000μg/mL的质控工作溶液，于4℃冰箱保存备用。取空白代血浆50μL，置于1.5mL离心管中，加入丙酮酸系列标准溶液系列标准溶液或质控工作溶液10μL，加入沉淀剂乙腈150μL，涡旋3min，离心(12000rpm，10min)，取上清液10μL进行HPLC-UV分析测定，根据色谱响应值计算相关参数。1.4.代血浆的配制和测定精密称取牛血清白蛋白300mg，溶于生理盐水10mL中，涡旋混匀，得到空白代血浆。取空白代血浆50μL，置于1.5mL离心管中，依次加入超纯水10μL和沉淀剂乙腈150μL，涡旋3min，离心(例如12000rpm，10min)，取上清液10μL进行HPLC-UV分析测定，以确定空白代血浆中无丙酮酸干扰。1.5.血浆样品的预处理1.5.1.丙酮酸乙酯测定大鼠血浆样品预处理取大鼠血浆50μL，置于1.5mL离心管中，依次加入超纯水10μL和乙腈沉淀剂150μL，涡旋3min，离心(12000rpm)10min，取上清液10μL进行HPLC-UV分析，并根据色谱响应值进行相关参数的计算。1.5.2.丙酮酸测定大鼠血浆样品预处理取大鼠血浆50μL，置于1.5mL离心管中，依次加入超纯水10μL和乙腈沉淀剂150μL，涡旋3min，离心(12000rpm)10min，取上清液10μL进行HPLC-UV分析，并根据色谱响应值进行相关参数的计算。2.测定的结果2.1.丙酮酸乙酯血浆样品测量结果实验发现，丙酮酸乙酯在大鼠血浆中极不稳定，HPLC-UV法监测向大鼠血浆中添加丙酮酸乙酯后丙酮酸乙酯血药浓度随时间变化的曲线如图1所示。由图1可知，丙酮酸乙酯在大鼠血浆中2min代谢了50％，10min就已检测不到丙酮酸乙酯。2.2.HPLC-UV法测量大鼠血浆中丙酮酸浓度方法学验证2.2.1.专属性取空白代血浆50μL，按1.5.1项方法操作，进样10μL，记录色谱图(图2A)；将丙酮酸标准溶液(相当于血浆浓度500μg/ml)10μL加入空白代血浆中，依同法操作，记录色谱图(图2B)；取空白大鼠血浆，按1.5.2项方法操作，进样10μl，记录色谱图(图2C)；取丙酮酸质控溶液(相当于400μg/ml)10μL加入大鼠空白血浆中，依同法操作，记录色谱图(图2D)。结果表明，大鼠空白血浆中含有内源性丙酮酸，会干扰丙酮酸的含量测定，而人造代血浆对丙酮酸的测定无干扰，需采用人造代血浆替代大鼠空白血浆进行方法学的验证。2.2.2.线性范围和最低定量限取代血浆50μL，加入丙酮酸标准系列溶液10μL，配制成相当于浓度为5、10、20、50、100、200、500μg/mL的代血浆样品，其余按1.5.1项方法操作，进样10μL，记录色谱图。以血浆中待测物的浓度为横坐标，待测物丙酮酸的峰高为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。根据标准曲线，丙酮酸代血浆浓度测定方法的线性范围为5～500μg/mL，最低定量限为5μg/mL，可满足大鼠血浆中丙酮酸的定量检测。2.2.3.精密度与准确度取代血浆50μL，加入丙酮酸质控溶液10μL，配制成相当于浓度为5、8、80、400μg/mL的最低定量限、低、中、高质控代血浆样品(QC)，按2.2.1项方法操作，与标准曲线同时进行测定，每一浓度进行6样本分析，连续测定3d，由标曲计算各质控点的浓度。将各质控点浓度进行方差分析，求算本法的精密度和准确度，结果如表1所示。表1：LC-UV法测定大鼠血浆中丙酮酸的准确度与精密度(n＝18)结果表明，日内精密度≤±5.46％，日间精密度≤±11.91％，RE≤±10.30％，符合相关规定要求[FDA.Guidanceforindustry：bioanalyticalmethodvalidation(draft)[EB/OL].(2012-01-30)[2016-12-13].http：//www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidance]。2.2.4.稳定性考察2.2.4.1.溶液稳定性本实验考察了储备液4℃放置的长期稳定性，结果表明，储备液4℃长期放置样品稳定(RE≤±0.35％)。考察了低、高(40、2000μg/mL)两个浓度质控工作溶液室温放置4h稳定性、4℃放置的长期稳定性，结果表明，工作溶液室温放置4h样品稳定(RE≤±0.07％)，工作溶液4℃长期放置样品稳定(RE≤±0.03％)。2.2.4.2.代血浆样品稳定性考察了低、高(8、400μg/mL)两个浓度代血浆样品，室温放置6h、处理后室温放置24h、冻融3循环稳定性。表2：代血浆中丙酮酸的稳定性研究(n＝6)标示浓度(μg/mL)处理样品4℃24h血浆室温放置6h血浆反复冻融3次8.08.51±0.448.76±0.1968.72±0.127400408.4±34.3379.1±10.78404.6±3.226结果表明，室温放置6h代血浆样品稳定(RE≤±9.49％)，处理后室温放置24h样品稳定(RE≤±6.37)，冻融3循环代血浆样品稳定(RE≤±10.17％)。2.2.4.3.血浆样品稳定性考察了低、高(8、400μg/mL)两个浓度大鼠血浆样品，室温放置6h、处理后室温放置24h、冻融3循环、-20℃长期放置稳定性。表3：血浆中丙酮酸的稳定性研究(n＝6)标示浓度(μg/mL)处理样品4℃24h血浆室温放置6h血浆反复冻融3次-20℃长期放置8.09.70±0.3158.54±0.538.34±1.048.25±0.84400470.6±42396.1±32.0360.4±3.45401.5±15.9结果表明，大鼠血浆样品室温放置6h稳定(RE≤±6.75)，处理后室温放置24h不稳定(RE≥±21.25％)，冻融3循环样品稳定(RE≤±9.91)，-20℃长期放置样品稳定(RE≤3.10％)。本发明在实验最初阶段，本发明人首先应用LC-MS/MS技术测定大鼠血浆中丙酮酸乙酯及丙酮酸的含量，经沉淀蛋白法处理的样品基质抑制强，质谱检测不到待测物浓度；经液液萃取法处理的样品线性关系差且提取回收率不足10％。虽然LC-MS/MS技术是测量生物样品中药物浓度的常用方法，但是在测定丙酮酸乙酯或丙酮酸时质谱检测器不适用于二者的准确定量。考虑到丙酮酸是大鼠体内的内源性物质，大鼠空白血浆样品中含有一定量的丙酮酸，本发明人在对实际大鼠血浆样品进行测定时，会扣除大鼠血浆样品中的内源性丙酮酸。在进行HPLC-UV测生物样品丙酮酸乙酯及其代谢物的浓度的方法学验证时，本发明人采用人造代血浆来代替大鼠空白血浆。本发明旨在建立测定大鼠血浆中丙酮酸及丙酮酸乙酯浓度的HPLC-UV法，有助于今后丙酮酸乙酯的新药开发和临床研究工作。以上通过本发明较佳实施例对本发明的精神作了详细阐述。本领域技术人员理解，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均落在本发明的保护范围内。参考资料：国家食品与药品监督管理局：《化学药品非临床药代动力学研究技术指导原则》，2005.3。当前第1页1 2 3