一种中药制剂中吡咯里西啶生物碱的液/质分析样品前处理法的制作方法

本发明属于分析化学中样品预处理技术领域，涉及一种中药颗粒剂和糖浆剂中毒性吡咯里西啶生物碱的富集和净化方法，是由样品酸水提取液、碱性无机盐溶液、亲水性醇和疏水性有机溶剂组成的多相萃取系统，富集毒性吡咯里西啶生物碱，有效去除脂肪酸、蛋白质和糖类等成分。该方法是对现有方法的重要补充，其回收率明显优于正丁醇或氯仿/水萃取体系；又解决了SPE难以处理富脂肪、蛋白质、糖类等高粘度和易不可逆吸附样品和仪器耗材昂贵的问题。

背景技术：

吡咯里西啶生物碱(pyrrolizidine alkaloids,PA)是重要的一类植物性肝毒成分，因上世纪50年代的人畜误食致死事件，而得到国际社会的广泛关注。PA主要分布于菊科(千里光属和泽兰属)、紫草科(紫草属)、豆科(猪屎豆属)植物中[Mattocks AR.Chemistry and toxicology of pyrrolizidine alkaloids[M].New york:Academic Press 1986:1-26.]。在我国，人们接触吡咯里西啶生物碱的途径主要有两个方面，一方面是以上述三科植物为主要成分的中药制剂，如中药返魂草、款冬花等，通常以颗粒剂、止咳糖浆等中药制剂形式用于治疗痰多，气喘，咯痰不爽，劳嗽咳血等多种疾病；另一方面，家畜如采食含有PAs的牧草或PA植物及其种子污染的饲料，会在动物产品如奶、峰蜜中残留，带来低剂量长期暴露的危险，因此，无论是中药制剂亦或是食品都需要对其中毒性吡咯里西啶生物碱进行有效监测。

中药制剂PA含量往往较低，仅0.00001％-0.001％，并含有大量的可能干扰液质联用分析的物质，如脂肪酸、蛋白质、糖类等，因此，对样品中PA的回收率和样品的净化水平要求较高。强阳离子交换树脂固相萃取法(SCX-SPE)是目前最常用的PA净化的方法，但中药制剂中的脂肪酸、蛋白质，尤其是大量的制剂辅料，如蔗糖、乳糖、糊精、炼蜜等对SPE法影响较大，易造成SPE小柱堵塞，重复性较差，此外，该方法操作复杂，成本较高。另一方面，PA类化合物富集的难度主要来自其极强的亲水特性，无论是在碱性条件下的分子态或是酸性条件下的离子态在常用的萃取溶剂，如氯仿、正丁醇中的溶解度有限，致使萃取回收率不高。

技术实现要素：

为了克服上述缺陷，本发明提供一种中药制剂中吡咯里西啶生物碱的液/质分析样品前处理法，即中药制剂经酸水超声提取后，利用提取液、碱性无机盐溶液、亲水性醇和疏水性有机溶剂组建多相萃取系统，对中药颗粒剂和糖浆剂中的PA有效萃取富集，同时去除脂肪酸、蛋白质、糖类等干扰物，有效降低液/质分析中的基质效应。吡咯里西啶生物碱类化合物在酸水溶液中以离子态形式存在，具有极强的亲水性，在碱性溶液中成分子态，极性降低而被萃取进入亲水性有机溶剂中，酸水提取液中的脂肪、蛋白质、糖类因相似相溶原理而分别被萃入疏水有机层、富盐层以及形成不溶固体中间层和沉淀层。

本发明的技术方案：

本发明提供一种多相萃取体系前处理吡咯里西啶生物碱的方法，所述的体系由四组分构成：A组分：样品酸水提取液，中药颗粒剂和糖浆剂精密称定，加入10～20倍体积(ml/g)的酸溶液，酸水溶液优选至0.5～1％的盐酸、甲酸或乙酸等无机酸，超声(功率250W，频率40kHz)提取，加入1/10体积的10％氨水，摇匀，提取液无需离心和过滤处理。B组分可选自碳酸钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠和磷酸钾、磷酸钠等强碱弱酸盐饱和溶液；C组分可选自甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇等亲水性醇类中的一种；D组分正己烷和乙酸乙酯混合溶液，体积比在10:0～4:6之间选择。

将全部A组分置具塞锥分液漏斗中，分别用等体积的C和D组分(富脂肪样品)或B组分(富蛋白质和糖类样品)洗涤A组分提取用锥形瓶，洗涤液转入上述分液漏斗中，加入B组分(富脂肪样品)或C和D组分(富蛋白质和糖类样品)，静置于桌面。待分层10～30min后，将上、中、下相分开，中相45℃以下减压蒸发至干，残渣用含0.5％甲酸的甲醇溶液除盐，过滤(0.22um滤膜)，滤液直接用于液相色谱-质谱联用仪分析。萃取操作在低于溶剂易挥发的温度下进行。

本技术的优点：中药制剂(颗粒剂和糖浆剂)酸水提取液，用10％氨水调pH至碱性，无需离心和过滤处理，直接与上述B、C和D组分混合进行多相萃取操作。体系分相后脂肪溶解于上层有机溶剂中，PA溶解于中层亲水有机溶剂中，蛋白质在中层和下层之间形成固体中间层，糖类溶解在下层富盐相中，有时会在下层底部形成固相不溶物层，这个体系被称为多相萃取系统。与强阳离子交换树脂固相萃取相比成本更低，操作简单，不需要特殊仪器。在碱性条件下PA以分子态溶解于中层亲水有机溶剂中，在富含疏水有机溶剂的上相和亲水有机溶剂的中相之间，PA分配系数小于0.01，在亲水有机溶剂的中相和富含磷酸氢二钾的下相间，PA分配系数大于100，一次萃取操作回收率大于70％，有效去除脂溶性成分、蛋白质、糖类及其他不溶性辅料成分。

附图说明

图1为肺宁颗粒中吡咯里西啶生物碱类化合物的EIC图；

图2为肺宁颗粒酸水提取液与多相萃取液的TIC图比较；

图3为川贝雪梨膏中克氏千里光碱(吡咯里西啶生物碱)的EIC图；

图4为千柏鼻炎片中吡咯里西啶生物碱类化合物的TIC和EIC图。

具体实施方式

下面结合实例对由中药制剂酸水提取液、无机盐溶液、亲水性醇、疏水性有机溶剂组成的多相萃取体系，富集中药制剂(颗粒剂和糖浆剂)中毒性吡咯里西啶生物碱作进一步描述，但不构成对本发明的任何限制。

本发明中所述的肺宁颗粒、千柏鼻炎片、川贝雪梨膏均购于当地药店。

实施例1

采用中药制剂酸水提取液/磷酸二氢钾溶液/乙醇/正己烷-乙酸乙脂(10：10：10：6-4)体系前处理肺宁颗粒中毒性PA。

A组分：取肺宁颗粒约1g，精密称定，置具塞锥形瓶(250ml)中，精密加入10ml的0.5％盐酸溶液，密塞，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)提取15min，放冷，再称定重量，用0.5％盐酸溶液补足减失的重量；精密加入10ug/ml野百合生物碱100ul(0.5％盐酸溶液配制)；加入10％氨水1～2ml，摇匀。

B组分：取磷酸氢二钾(三水磷酸氢二钾)50g，加入去离子水30ml，密塞，超声(功率250W，频率40kHz)溶解5-15min，放冷，加入少量磷酸氢二钾，超声(功率250W，频率40kHz)溶解5-15min，放冷，直至少量磷酸氢二钾不溶解，过滤除掉未溶解的固体得到滤液。

C组分：乙醇(分析纯)。

D组分：正己烷和乙酸乙酯混合溶液，体积比在6:4。

将全部A组分置具塞锥分液漏斗(60ml)中，分别用C和D组分各10ml，洗涤A组分提取用锥形瓶，洗涤液置上述分液漏斗中，加入B组分10ml，静置于桌面。待分层10～30min后，将上、中、下相分开，中相45℃减压蒸发至干，加入0.5％甲酸的甲醇溶液2ml，超声(功率250W，频率40kHz)助溶5～10min，过滤(0.22um滤膜)，滤液可直接用于液相色谱-质谱联用仪分析。

液质分析条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.5％甲酸为流动相B，0-10min，5-40％A梯度洗脱；采用质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)；正离子模式；扫描范围m/z 100～1000；干燥器温度350℃；干燥器流速9L/min；雾化器压力：40psig；毛细管电压3500V；Fragmentor电压：200V；shimmer电压：65V；工作站Agilent MassHunter。

在肺宁颗粒中提取到5个吡咯里西啶生物碱类化合物[M+H]⁺峰，m/z分别为370.1865，366.1921，352.0798，352.0798，342.1515和一个非吡咯里西啶生物碱类生物碱m/z 384.2020，结果见附图1。各化合物质谱响应峰面积与内标野百合生物碱的质谱峰面积相比可相对定量上述生物碱，以每克样品中含有的野百合生物碱计，表1为不同来源肺宁颗粒的吡咯里西啶生物碱相对定量结果。将实施例1中肺宁颗粒液样品经多相萃取处理后的TIC图与仅经酸水提取的样品TIC图相比，本发明多相萃取方法有效降低样品的复杂程度，结果见附图2。

表1为不同来源肺宁颗粒的吡咯里西啶生物碱相对定量结果(ug/g)

实施例2

采用中药制剂酸水提取液/磷酸氢二钾/异丙醇/正己烷-乙酸乙脂(10：10：10：6-4)体系前处理川贝雪梨膏中毒性吡咯里西啶生物碱。

A组分：取橘红止咳糖浆约1g，精密称定，置具塞锥形瓶(250ml)中，精密加入10ml的0.05M盐酸溶液，密塞，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)提取15min，放冷，再称定重量，用0.05M盐酸溶液补足减失的重量，摇匀。

B组分：取磷酸氢二钾(三水磷酸氢二钾)50g，加入去离子水30ml，密塞，超声(功率250W，频率40kHz)溶解5-15min，放冷，加入少量磷酸氢二钾，超声(功率250W，频率40kHz)溶解5-15min，放冷，直至少量磷酸氢二钾不溶解，过滤除掉未溶解的固体得到滤液。

C组分：异丙醇(分析纯)。

D组分：正己烷和乙酸乙酯混合溶液，体积比在6:4。

将全部A组分置具塞锥分液漏斗(60ml)中，加入10％氨水1～2ml摇匀，分别用C和D组分各10ml，洗涤A组分提取用锥形瓶，洗涤液置上述分液漏斗中，加入B组分10ml，静置于桌面。待分层10-30min后，将上、中、下相分开，中相45℃减压蒸发至干，加入0.5％甲酸的甲醇溶液2ml，超声(功率250W，频率40kHz)助溶5～10min，过滤(0.22um滤膜)，滤液可直接用于液相色谱-质谱联用仪分析。

液质分析条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.5％甲酸为流动相B，0-10min，5-40％A梯度洗脱；采用质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)；正离子模式；扫描范围m/z 100～1000；干燥器温度350℃；干燥器流速9L/min；雾化器压力：40psig；毛细管电压3500V；Fragmentor电压：200V；shimmer电压：65V；工作站Agilent MassHunter。

在中药制剂酸水提取液/磷酸氢二钾/异丙醇/正己烷-乙酸乙脂(10：10：10：6-4)组成的萃取体系中，内标化合物野百合生物碱提取回收率达90％以上(附图3)，而在氯仿/水萃取体系中，其回收率为30％左右。液质联用分析提取到吡咯里西啶生物碱类化合物克氏千里光碱的[M+H]⁺峰，m/z 366.1573，该生物碱来源于成方中的款冬花药材；附图3。

实施例3

采用样品提取液/磷酸氢二钾/异丙醇/正己烷-乙酸乙脂(10：10：10：10-0)体系前处理千柏鼻炎片中毒性吡咯里西啶生物碱。

A组分：取千柏鼻炎片5片研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶(250ml)中，精密加入10ml的0.05M盐酸溶液，密塞，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)提取15min，放冷，再称定重量，用0.05M盐酸溶液补足减失的重量，摇匀。

B组分：取磷酸氢二钾(三水磷酸氢二钾)50g，加入去离子水30ml，密塞，超声(功率250W，频率40kHz)溶解5-15min，放冷，加入少量磷酸氢二钾，超声(功率250W，频率40kHz)溶解5-15min，放冷，直至少量磷酸氢二钾不溶解，过滤除掉未溶解的固体得到滤液。

C组分：异丙醇(分析纯)。

D组分：正己烷(分析纯)。

将全部A组分置具塞锥分液漏斗(60ml)中，加入10％氨水1～2ml，摇匀，分别用C和D组分各10ml，洗涤A组分提取用锥形瓶，洗涤液置上述分液漏斗中，加入B组分10ml，摇匀，静置于桌面。待分层10-30min后，将上、中、下相分开，中相45℃减压蒸发至干，加入0.5％甲酸的甲醇溶液2ml，超声(功率250W，频率40kHz)助溶5～10min，过滤(0.22um滤膜)，滤液可直接用于液相色谱-质谱联用仪分析。

液质分析条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.5％甲酸为流动相B，0-10min，5-40％A梯度洗脱；采用质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)；正离子模式；扫描范围m/z 100～1000；干燥器温度350℃；干燥器流速9L/min；雾化器压力：40psig；毛细管电压3500V；Fragmentor电压：200V；shimmer电压：65V；工作站Agilent MassHunter。

利用中药制剂酸水提取液/磷酸氢二钾/异丙醇/正己烷-乙酸乙脂(10∶10∶10∶10-0)体系，在千柏鼻炎片样品中提取到m/z为366.1650的阿多尼弗林碱，该吡咯里西啶生物碱来源于千柏鼻炎片成方中的千里光药材；同时该样品中还提取到多个其他生物碱类化合物，主要是来至成方中麻黄药材的麻黄碱和伪麻黄碱成分。