中药中吡咯里西啶生物碱的萃取法的制作方法

中药中吡咯里西啶生物碱的疏水性有机溶剂/亲水性醇/盐三液相萃取法

背景技术：

吡咯里西啶生物碱(pyrrolizidine alkaloids,PA)是重要的一类植物性肝毒成分，其造成的急性中毒临床表现为肝脏的静脉闭塞症，慢性毒性的典型特征为肝的纤维化坏死等。因上世纪50年代的人畜误食致死事件，而得到国际社会的广泛关注。该类成分主要分布于菊科(千里光属和泽兰属)、紫草科(紫草属)、豆科(猪屎豆属)植物中[Mattocks AR.Chemistry and toxicology of pyrrolizidine alkaloids[M].New york:Academic Press 1986:1-26.]。在我国上述三科的很多植物都作药用，2010版药典一部中现存9种药材品种，包括千里光、款冬花、佩兰、野马追、紫草、蜂蜜、返魂草、一点红和滇紫草，并涉及包括千柏鼻炎片、肺宁颗粒、紫草软膏在内的数十种成方制剂[汤俊，服部征雄，《中国药典》含吡咯里西啶生物碱的中药品种与用药安全，药学学报，2011，46(7)：762-772]。目前只有“千里光”规定药材中的吡咯里西啶生物碱类化合物阿多尼弗林碱 (adonifoline)的含量不得超过0.004％，而大多数品种缺乏该类成分的安全限量检查，其潜在的用药风险可能被忽视，所以明确这些药材和成方制剂中是否含有PA，是关系到用药安全的重要问题。

PA在药材中含量差异极大，从痕量到干重的19％，给PA的分析和制备带来了巨大的困难。目前，从富含PA的药材提取液中萃取PA的方法主要为酸水提取液调碱后的有机溶剂萃取法和阳离子交换树脂固相萃取法(SPE)等。有机溶剂萃取法因操作简单、重复性好、成本低而应用较多，然而，PA的极性强，无论是在碱性条件下的分子态或是酸性条件下的离子态在常用的萃取溶剂，如正己烷、乙酸乙脂、氯仿、正丁醇中的溶解度都有限，致使萃取回收率不高。SPE 法处理后样品纯度相对高，但回收率较低，操作复杂，成本较高，作为大规模的药材分析和制备的前处理技术并不合适。

1990年，Greve和Kula首次报道了由亲水性醇、水和无机盐组成的新型双水相体系，该体系与传统的双水相体系相比，具有极性更强，黏度更低、且廉价、环保等优点。尽管亲水性醇/盐双水相溶剂体系在国内外的研究才刚刚起步，但在强极性中药药效物质和化工产品的萃取富集及蛋白质、多糖等杂质的除去方面已表现出广阔的研究价值和应用空间。如谭天伟院士在国内首先报道了应用乙醇/磷酸盐体系萃取甘草中的甘草酸钾(biotechnology Letter 24(2002) 1417-1420)；修志龙教授将该体系成功应用于发酵液中1，3-丙二醇等化工产品的萃取分离(Separation and Purification Technology 66(2009)：472-478)。我们在已有研究基础上，将疏水性有机溶剂加入到亲水性醇/盐双水相体系中组建由有机溶剂相/亲水性醇相/无机盐相组成的三液相体系，该体系具有极宽的极性覆盖范围，对中药及成方制剂中的PA有非常好的萃取富集效果，同时可有效去除非极性和强极性杂质。目前，疏水性有机溶剂/亲水性醇/盐三液相萃取体系在中药及成方制剂PA的萃取分离方面尚未见文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对目前从药材和成方制剂中萃取PA存在的分离能力小，总体收率低、成本高等问题，提供一种由疏水性有机溶剂、亲水性醇、无机盐、药材酸水提取液或酸水分散液上清液组成的三液相萃取方法从中药材和成方制剂中分离PA。

本发明的技术方案：

中药材和成方制剂经打粉预处理，用10-20倍体积的0.05M盐酸超声提取1h，除去药渣。也可以是其它方式提取样品浸膏、干粉等的10-20倍体积0.05M盐酸分散液的上清液。

选取适用于目标化合物分离的疏水性有机溶剂、亲水性醇、盐与药材提取液组成三液相体系，所述的溶剂体系由四组分构成：A组分可选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、正己烷等疏水性有机溶剂或其组合；B组分可选自甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇等亲水性醇；C组分可选自碳酸钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠和磷酸钾、磷酸钠等强碱弱酸盐；D组分为药材提取液。优选体系由正己烷-乙酸乙脂-乙醇 -磷酸氢二钾-药材提取液组成。

在正己烷-乙酸乙脂-乙醇-磷酸氢二钾-药材提液组成的溶剂体系中，它们的体积比可以在(10-4)：(0-6)：10：10：(5-10)的范围内配制，例如4：6：10： 10：10；6：4：10：10：10；10：0：10：10：10；5：5：10：10：5等。

萃取操作在低于溶剂易挥发的温度下进行。为了保证PA尽可能多的分配在中相，蛋白、多糖、核酸及制药辅料分配在下相，可以向三液相体系中加入10％氨水调PH至9-10，使PA以分子态存在。

本发明的中药中吡咯里西啶生物碱的萃取法，是疏水性有机溶剂/亲水性醇/ 盐三液相萃取法，是将疏水性有机溶剂、亲水性醇、饱和无机盐溶液加入到药材水提取液或分散液中，混合后静止分成上相、中相和下相三液相；体系中的疏水性有机溶剂为正己烷或正己烷和乙酸乙酯的混合有机溶剂，正己烷、乙酸乙酯、亲水性醇、饱和无机盐溶液和药材提取液的体积比可以在(4-10)： (0-6):10:10：(5-10)的范围内配制。

体系中的亲水性醇为乙醇、甲醇、异丙醇、丙醇中的一种。

无机盐为磷酸氢二钾、磷酸钾、碳酸钠、磷酸氢二钠强碱弱酸盐中的一种或二种以上，无机盐为饱和溶液。

药材提取液为药材0.05M盐酸提取液，料液比为1g：(10-20)mL；药材体积浓度的75％乙醇提取液浸膏的0.05M盐酸分散液，分散液的料(药材)液比为1g： (10-20)mL的上清液。

体系配置温度和萃取温度一致，应低于有机溶剂的易挥发温度，约为20-35℃。

无机盐存在的体系下相(水相)pH约为9-10。

本发明的萃取方法最优选的步骤如下：首先取30g干燥药材或成方制剂打粉，浸膏或干粉等直接加入300mL0.05M盐酸，常温超声提取1h，过滤除去药渣；用去离子水配制磷酸二氢钾饱和溶液；将正己烷、乙酸乙脂、乙醇、饱和磷酸二氢钾和药材提取液以6：4：10：10：10体积比配制于分液漏斗中，摇匀后静止分层。待平衡1-4小时后，将上、中、下相分开，中层即为富含PA相。采用两倍体积甲醇沉淀除盐，滤液经45℃减压旋蒸后即得到粗PA。

本发明的萃取方法，其中PA一次萃取操作回收率>90％，可有效去除中药材和成方制剂中的脂溶性成分和多糖等辅料成分。

本发明最优选的萃取方法是经过筛选得到的，具有优良的PA富集效果，该方法列在本发明实施例中。

本技术的优点：该类体系与传统的疏水性有机溶剂/水两相体系相比，极性更强，黏度更低，分层时间显著缩短，可以有效避免乳化现象，有利于极性PA富集。选择疏水性有机溶剂/亲水性醇/无机盐/药材提取液三液相体系萃取的方法，可将中药材和成方制剂中的PA有效富集于体系的中相，在富含正己烷和乙酸乙脂的上相和富含乙醇的中相中，PA分配系数<0.01，在富含乙醇的中相和富含磷酸氢二钾的下相中，PA分配系数大于100，一次萃取操作回收率>90％，有效去除中药材和成方制剂中的脂溶性成分和多糖等辅料成分。与阳离子交换树脂固相萃取相比回收率更高、成本更低。此外，多数亲水性醇的沸点低于水，可通过蒸馏或精馏的方式将其有效回收，从而省去了传统双水相体系(PEG-无机盐体系等)的反萃步骤，大幅度地降低萃取剂的损失和操作成本。

附图说明

图1为LC-MS分析佩兰萃取相中PA a)佩兰提取液，b)正己烷/提取液 (1：1)，c)乙酸乙酯/提取液(1：1)，d)正丁醇/提取液(1：1)，e)PCX-SPE 处理，f)正己烷-乙酸乙酯-乙醇-饱和磷酸氢二钾-提取液(6：4：10：10：10)，pH9-10。

具体实施方式

本发明中药材佩兰、返魂草和野马追均购至当地药店。

实施例1

采用正己烷-乙酸乙脂-乙醇-饱和磷酸二氢钾-药材提取液(6：4：10：10： 10)体系萃取佩兰中PA。

首先取佩兰干燥药材15g打粉，加入300mL0.05M盐酸，常温超声提取1h，过滤，除去药渣，即得PA提取液；

去离子水配制磷酸二氢钾饱和溶液；

将正己烷、乙酸乙脂、乙醇、饱和磷酸二氢钾、PA提取液(100mL)以6： 4：10：10：10体积比配制分液漏斗中，摇匀后静止分层。待平衡2h后，形成上相、中相和下相三相，上相为富含黄酮、萜类等弱极性成分层，体积为80mL，中相富含PA，体积为150mL，下相为富含蛋白子、核酸、多糖等强极性成分层，体积为170mL。富含PA的中层用两倍体积甲醇沉淀除盐，滤液经45℃减压旋转蒸发得PA。其回收率可达90％。

实施例2

采用正己烷-乙酸乙脂-乙醇-饱和磷酸二氢钾-提取液(4：6：10：10：10)体系萃取返魂草中PA。

首先取返魂草15g，加入300mL0.05M盐酸，常温超声溶解，过滤，除去药渣，即得PA提取液；

去离子水配制磷酸二氢钾饱和溶液；

将正己烷、乙酸乙脂、乙醇、饱和磷酸二氢钾、PA提取液(100mL)以4： 6：10：10：10体积比配制分液漏斗中，摇匀后静止分层。待平衡2h后，形成上相、中相和下相三相，上相为富含黄酮、萜类等弱极性成分层，体积为60mL，中相富含PA，体积为160mL，下相为富含蛋白子、核酸、多糖等强极性成分层，体积为170mL。富含PAs中层用两倍体积甲醇沉淀除盐，滤液经45℃减压旋转蒸发得PA。其回收率可达90％。

实施例3

采用正己烷-乙酸乙脂-乙醇-饱和磷酸二氢钾-提取液(8：2：10：10：10) 体系萃取野马追中PA。

首先取野马追干燥药材15g打粉，加入300mL0.05M盐酸，常温超声提取 1h，过滤，除去药渣，即得PA提取液；

去离子水配制磷酸二氢钾饱和溶液；

将正己烷、乙酸乙脂、乙醇、饱和磷酸二氢钾、PA提取液(100mL)以8： 2：10：10：10体积比配制分液漏斗中，摇匀后静止分层。待平衡2h后，形成上相、中相和下相三相，上相为富含黄酮等弱极性成分层，体积为100mL，中相富含PA层，体积为150mL，下相为富含蛋白子、核酸、多糖等强极性成分层，体积为150mL。富含PA中层用两倍体积甲醇沉淀除盐，滤液经45℃减压旋转蒸发得PA。其回收率可达90％。