本发明涉及测试计量分析领域，具体而言，涉及一种生物制品疫苗甲醛残留量的测定方法。
背景技术：
：甲醛作为亲电试剂，可与多种带负电荷的生物大分子发生反应，形成可逆的加合物或不可逆的交联物，如dna、rna和多糖。甲醛本身对机体具有较高的毒性，是公认的致癌、致畸和基因毒性物质，在我国有毒化学品优先控制名单上高居第二位。ramon等[1]和glenny等[2]发现，经福尔马林处理后的白喉毒素的毒性可明显降低，其机制可能为甲醛与蛋白质的氨基结合，使蛋白质凝固，进而有效的降低毒素毒性。自此之后，甲醛作为灭活剂被用于多种疫苗生产中。残留的甲醛随疫苗注入机体后，会对机体产生一系列刺激性反应，因此需对疫苗中甲醛残留量进行严格控制。乙酰丙酮法是甲醛测定的传统方法，其基于分光光度法进行甲醛测定，仪器价格低，普及程度高，是甲醛测定的最常用的检验方法。该方法的原理在于甲醛在醋酸-醋酸铵缓冲溶液中，与乙酰丙酮反应生成黄色化合物3,5-二乙酰基-1,4-二氢吡啶，该化合物在410nm波长处有最大吸光度值，通过比色定量可计算疫苗中甲醛残留量。然而，现有技术中目前尚未找到有关生物制品疫苗中甲醛残留量标准流程化方法，并且其相关不确定度的确定方法也未见报道，因而难以对工作人员提供充分提供技术方法指导。有鉴于此，特提出本发明。[1]ramong.surlatoxineetsurranatoxinediphtheriques[j].anninstpasteur,1924,38(1):1-10.[2]glennyat,hopkinsbe.diphtheriatoxoidasanimmunizingagent[j].brjexppathol,1923,4(5):283-288.技术实现要素：本发明涉及一种生物制品疫苗甲醛残留量的测定方法，包括：a)用5.0ml刻度移液管取被检疫苗样品5.0ml，置50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，强烈振摇，静止分层，下层液如果不澄清，滤过，弃去初滤液，取澄清续滤液，得到供试品溶液；b)用刻度移液管取已标定的甲醛溶液配成每l.0ml含甲醛1.0mg的溶液，精密量取上述稀释溶液5.0ml置50ml容量瓶中，用10ml刻度移液管加20％吐温-80乙醇溶液10ml，再加水至刻度，摇匀，得到对照品溶液；其中，步骤a)和b)无先后顺序；c)用1.0ml刻度移液管精密吸取所述供试品溶液和所述对照品溶液各0.5ml，分别加醋酸-醋酸铵缓冲液10ml、乙酰丙酮试液10ml，置60℃水浴锅恒温水浴15分钟，冷水冷却5分钟，放置20分钟后，按紫外-可见分光光度法《中华人民共和国兽药典》附录，用紫外分光光度计在410nm的波长处测定吸收度，计算即得；计算公式为：甲醛溶液(40％)含量％(g/ml)＝0.0025×(供试品溶液的吸收度÷对照品溶液的吸收度)×100％；所述方法还包括测定结果的不确定度评定方法，包括如下步骤：按照下述公式计算测定结果的合成标准不确定度：u＝[u2(供试品)+u2(对照品)+u2(甲醛标定)+u2(醋酸-醋酸铵)+u2(乙酰丙酮)]1/2；式中，u(供试品)、u(对照品)、u(甲醛标定)、u(醋酸-醋酸铵)、u(乙酰丙酮)分别对应供试品溶液配制与检测、对照品溶液配制与检测、甲醛溶液标定、醋酸-醋酸铵缓冲液配制、乙酰丙酮试液配制产生的不确定度分量；甲醛残留量测定的扩展不确定度＝2u。本发明提供了规范化的疫苗产品甲醛残留量的测定方法，并提供了其不确定度的分析方法。该不确定度的分析方法主要用于评价不同实验室间能力比对，确证实验室间检验是否存在误差，结果是否准确、有效、是否达到满意；其次用于同一实验室的人员比对试验，确证检验人员之间是否存在误差，结果是否达到满意；有些客户或供应商要求检验时必须有不确定度数据，方可认可实验室的检验能力；可以作为检验室检验能力的重要评价依据，可提高兽用疫苗的质量监管水平，对质量的可控性具有一定的指导意义。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本发明涉及一种生物制品疫苗甲醛残留量的测定方法，包括：a)用5.0ml刻度移液管取被检疫苗样品5.0ml，置50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，强烈振摇，静止分层，下层液如果不澄清，滤过，弃去初滤液，取澄清续滤液，得到供试品溶液；b)用刻度移液管取已标定的甲醛溶液配成每l.0ml含甲醛1.0mg的溶液，精密量取上述稀释溶液5.0ml置50ml容量瓶中，用10ml刻度移液管加20％吐温-80乙醇溶液10ml，再加水至刻度，摇匀，得到对照品溶液；其中，步骤a)和b)无先后顺序；c)用1.0ml刻度移液管精密吸取所述供试品溶液和所述对照品溶液各0.5ml，分别加醋酸-醋酸铵缓冲液10ml、乙酰丙酮试液10ml，置60℃水浴锅恒温水浴15分钟，冷水冷却5分钟，放置20分钟后，按紫外-可见分光光度法《中华人民共和国兽药典》附录，用紫外分光光度计在410nm的波长处测定吸收度，计算即得；计算公式为：甲醛溶液(40％)含量％(g/ml)＝0.0025×(供试品溶液的吸收度÷对照品溶液的吸收度)×100％；所述方法还包括测定结果的不确定度评定方法，包括如下步骤：按照下述公式计算测定结果的合成标准不确定度：u＝[u2(供试品)+u2(对照品)+u2(甲醛标定)+u2(醋酸-醋酸铵)+u2(乙酰丙酮)]1/2；式中，u(供试品)、u(对照品)、u(甲醛标定)、u(醋酸-醋酸铵)、u(乙酰丙酮)分别对应供试品溶液配制与检测、对照品溶液配制与检测、甲醛溶液标定、醋酸-醋酸铵缓冲液配制、乙酰丙酮试液配制产生的不确定度分量；甲醛残留量测定的扩展不确定度＝2u。本发明所提供方法尤其适用于病毒疫苗中甲醛残留量的检测，所述疫苗优选为减毒活疫苗、全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、重组载体疫苗或核酸疫苗。优选的，如上所述的方法，在步骤a)中，当所述被检疫苗样品为油乳剂疫苗时，在用5.0ml刻度移液管取被检疫苗样品5.0ml，置50ml量瓶中之后、加水稀释至刻度之前还包括：用20％吐温-80乙醇溶液l0ml，分次洗涤吸管，洗液并入50ml量瓶中，摇匀。优选的，如上所述的方法，所述供试品溶液配制与检测产生的不确定度分量u(供试品)＝[u2(样稀释)+u2(样测定)+u2(z)+u2(s)]1/2；其中，式中u(z)为所述紫外线分光光度计引入的不确定度分量；u(s)为所述水浴锅引入的不确定度分量；u(样稀释)为被检疫苗样品稀释至50ml容量瓶时引入的不确定度分量；u(样测定)为在步骤c)中对被检疫苗样品进行测定时引入的不确定度分量。具体的，所述供试品溶液配制与检测产生的不确定度分量由以下方面组成：供试品稀释引入的不确定度；供试品测定引入的不确定度；仪器设备引入的不确定度。1.供试品稀释引入的不确定度1.15ml移液管取液引入的不确定度1.1.1测量人员示值误差引入的不确定度分量：具体方法：用移液管取液的重复性来实验，对同一5ml移液管进行10次注射用水取液，通过称量水的质量测定取液体积，属于a类实验；具体数据如下表：计算：采用贝塞尔公式计算10次取液体积测量的实验标准偏差：则测量人员示值误差引入的不确定度：u1＝s＝0.0185(ml)1.1.2移液管校准引入的不确定度分量：方法：根据移液管校准证书上显示最大允许误差为：-0.020ml为三角分布，则包含因子k＝√6，属于b类不确定度；则由校准引入的不确定度为：u2＝0.020/√6＝0.0081(ml)1.1.3温度影响变化引入的不确定度分量：检验室的温度变化范围为：(20±3)℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，移液管取液过程中由温度效应产生的体积变化值为：＝±(5×3×2.1×10-4)＝±0.0032(ml)，包含因子k＝√3则由温度影响变化引入的不确定度为:u3＝0.0032/√3＝0.0018(ml)综上所述:则移液管取液引入的合成标准不确定度为：u＝(u12+u22+u32)1/2＝0.02027(ml)则移液管取液引入相对合成标准不确定度为：u(移液管)＝0.02027/5＝0.00411.2容量瓶定容引入的不确定度1.2.1测量人员示值误差引入的不确定度分量具体方法：可用容量瓶定容的重复性来实验，对同一50ml容量瓶进行10次注射用水定容，通过称量水的质量测定取液体积，属于a类实验，具体数据如下表：计算：采用贝塞尔公式计算10次取液体积测量的实验标准偏差：则测量人员示值误差引入的不确定度：u1＝s＝0.0419(ml)1.2.2容量瓶校准引入的不确定度分量：方法：根据容量瓶校准证书可知最大允许误差为：0.03ml为三角分布，包含因子k＝√6，属于b类不确定度；则由校准引入的不确定度为：u2＝0.03/√6＝0.0122(ml)。1.2.3温度影响变化引入的不确定度分量：检验室的温度变化范围为：(20±3)℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，移液管取液过程中由温度效应产生的体积变化值为：±(50×3×2.1×10-4)＝±0.0315ml，包含因子k＝√3则由温度影响变化引入的不确定度为：u3＝0.0315/√3＝0.0181(ml)综上所述：则容量瓶定容引入的合成标准不确定度为：u＝(u12+u22+u32)1/2＝(0.04192+0.01222+0.01812)1/2＝0.0472(ml)则容量瓶定容引入的相对标准不确定度为：u(容量瓶)＝0.0472/50＝0.00091.310ml移液管取液引入的不确定度1.3.1测量人员示值误差引入的不确定度分量：具体方法：可用移液管取液的重复性来实验，对同一10ml移液管进行10次注射用水取液，通过称量水的质量测定取液体积，属于a类实验具体数据如下表：计算：采用贝塞尔公式计算10次取液体积测量的实验标准偏差：则测量人员示值误差引入的不确定度：u1＝s＝0.0380(ml)1.3.2移液管校准引入的不确定度分量方法：根据移液管的校准证书可知最大允许误差为：-0.03(ml)，包含因子k＝√6，为三角分布，,属于b类不确定度；则由校准引入的不确定度为：0.03/√6＝0.01221.3.3温度影响变化引入的不确定度分量：检验室的温度变化范围为：(20±3)℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1。移液管取液过程中由温度效应产生的体积变化值为：±(10×3×2.1×10-4)＝±0.0063ml，包含因子k＝√6，则由温度影响变化引入的不确定度为：0.0063/√6＝0.0036(ml)，则10ml移液管取液引入的合成标准不确定度为：u＝(u12+u22+u32)1/2＝0.04007(ml)则10ml移液管取液引入的相对标准不确定度为：u＝0.04007/10＝0.0040综上所述样品溶液稀释引入的合成不确定度为：当所述被检疫苗样品为油乳剂疫苗时：u(样稀释)＝[u2(5ml移液管)+u2(容量瓶)+u2(10移液管)]1/2；以下以油乳剂疫苗计算，u(样稀释)＝0.0058。当所述被检疫苗样品为非油乳剂疫苗时：u(样稀释)＝[u2(5ml移液管)+u2(容量瓶)]1/2；2样品测定引入的不确定度2.11ml移液管取液引入的不确定度2.1.1测量人员示值误差引入的不确定度分量：具体方法：可用移液管取液的重复性来实验，对同一1ml移液管进行10次注射用水取液，通过称量水的质量测定取液体积，属于a类，具体数据如下表：计算：采用贝塞尔公式计算10次取液体积测量的实验标准偏差：则测量人员示值误差引入的不确定度：u1＝s＝0.0066(ml)2.1.2移液管校准引入的不确定度分量方法：根据移液管的校准证书可知最大允许误差为：0.003ml，包含因子k＝√6，为三角分布，属于b类不确定度；则由校准引入的不确定度为：u2＝0.003/√6＝0.00122(ml)2.1.3温度影响变化引入的不确定度分量：检验室的温度变化范围为：(20±3)℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1。移液管取液过程中由温度效应产生的体积变化值为：±(1×3×2.1×10-4)＝±0.0006ml，包含因子k＝√3。则由温度影响变化引入的不确定度为：u3＝0.0006/√6＝0.0003；则1ml移液管取液引入的合成标准不确定度为：u＝(u12+u22+u32)1/2＝0.0067(ml)则1ml移液管取液引入的相对标准不确定度为：u(1ml移液管)＝0.0067/1＝0.006710ml移液管取液引入的相对标准不确定度为，因已评估则直接给出数据：u(10移液管)＝0.00402.2样品重复性测量引入的不确定度方法：采用对同一样品重复测定10次，用分光光度计分别测得吸收度测得结果如下：计算:10次结果的标准偏差为：其相对标准不确定度为：0.00074/0.188＝0.00393紫外分光光度计引入的不确定度根据校验证书上可知：紫外分光光度计引入的不确定度u(z)＝3.0％/√3＝0.017324水浴锅引入的不确定度根据校验证书上可知不确定度为：则水浴锅引入的不确定度为：u(s)＝0.2/2＝0.1样品测定引入的不确定度为：u(样测定)＝0.0095综上所述：样品溶液配制引入的不确定度为：u(供试品)＝[u2(样稀释)+u2(样测定)+u2(z)+u2(s)]1/2＝0.1019优选的，如上所述的方法，所述对照品溶液配制与检测产生的不确定度分量u(对照品)＝[u2(对照稀释)+u2(对照测定)+u2(z)+u2(s)]1/2；其中，式中u(z)为所述紫外线分光光度计引入的不确定度分量；u(s)为所述水浴锅引入的不确定度分量；u(对照稀释)为用刻度移液管取已标定的甲醛溶液配成每l.0ml含甲醛1.0mg的溶液，精密量取上述稀释溶液5.0ml置50ml容量瓶中时引入的不确定度分量；u(对照测定)为在步骤c)中对对照品进行测定时引入的不确定度分量。具体的，所述对照品溶液配制与检测产生的不确定度分量由以下方面组成：对照品稀释引入的不确定度；对照品测定引入的不确定度；仪器设备引入的不确定度。1对照品稀释引入的不确定度1.15ml移液管引入的不确定度：因已评估则直接给出数据：u(5ml移液管)＝0.00411.250ml容量瓶引入的不确定度因已评估则直接给出数据：u(50ml容量瓶)＝0.00091.310ml移液管引入的不确定度因已评估则直接给出数据：u(10ml移液管)＝0.00401.4100ml容量瓶引入的不确定度(取已标定的甲醛溶液配成每l.0ml含甲醛1.0mg的溶液时使用)：可用重复性来实验，对同一100ml容量瓶进行10次注射用水取液，通过称量水的质量测定取液体积，属于a类实验。具体数据如下表：计算：采用贝塞尔公式计算10次取液体积测量的实验标准偏差：则测量人员示值误差引入的不确定度：u1＝s＝0.0447(ml)1.4.2容量瓶校准引入的不确定度分量方法：根据容量瓶的校准证书可知最大允许误差为：0.05ml，包含因子k＝√6，为三角分布，属于b类不确定度；,则由校准引入的不确定度为：u2＝0.05/√6＝0.02041.4.3温度影响变化引入的不确定度分量：检验室的温度变化范围为：(20±3)℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1。容量瓶由温度效应产生的体积变化值为：±(100×3×2.1×10-4)＝±0.063ml包含因子k＝√3，则由温度影响变化引入的不确定度为：u3＝0.063/√3＝0.0363则100ml容量瓶引入的合成标准不确定度为：u＝(u12+u22+u32)1/2＝0.0610(ml)则100ml容量瓶引入的相对标准不确定度为：0.0610/100＝0.0061综上所述：对照品稀释引入的不确定度为：u(对照品稀释)＝(0.00412+0.00092+0.00402+0.0061)1/2＝0.06122对照品测定引入的不确定度2.1对照品重复测定引入的不确定度方法：采用对同一对照品重复测定10次，用分光光度计分别测得吸收度，测得结果如下计算：10次结果的标准偏差为：其相对标准不确定度为：0.00081/0.777＝0.001042.210ml移液管引入的不确定度因已评估则直接给出数据：u(10ml移液管)＝0.00402.31ml移液管引入的不确定度因已评估则直接给出数据：u(1ml移液管)＝0.0067综上所述：对照品测定引入的不确定度为：u(对照品测定)＝(0.001042+0.00402+0.00402+0.00672)1/2＝0.00883紫外分光光度计引入的不确定度根据校验证书上可知：紫外分光光度计引入的不确定度，上述已评估可以直接数据：u(z)＝0.017324水浴锅引入的不确定度根据校验证书上可知不确定度为：则水浴锅引入的不确定度，为上述已评估可以直接数据：u(s)＝0.1综上所述：对照品溶液配制引入的不确定为：u(对照配制)＝u(对照品)＝[u2(对照稀释)+u2(对照测定)+u2(z)+u2(s)]1/2＝0.1188优选的，如上所述的方法，在步骤b)中，所述甲醛溶液的标定方法为：取甲醛溶液约1.5ml，采用去皮法精密称定，置锥形瓶中，加水10ml，与溴麝香草酚蓝指示液2滴，滴加1.0mol/l的氢氧化钠滴定液至溶液呈蓝色，加过氧化氢试液25ml，再精密加入1.0mol/l氢氧化钠滴定液25ml，瓶口置一玻璃小漏斗，在水浴上加热15分钟，不时振摇，冷却，用水洗涤漏斗，加溴麝香草酚蓝指示液2滴，用1.0mol/l盐酸滴定液滴定至溶液显黄色，并将滴定结果用空白试验校正；其中，所述盐酸滴定液为用无水碳酸钠作基准物质标定盐酸溶液得到；优选的，盐酸滴定液(1mol/l)标定方法为：精密称取在270℃～300℃干燥至恒重的基准试剂无水碳酸钠约1.8g，加水50ml使溶解，加甲基红-溴甲酚绿混合指示剂液10滴，用本液滴定至溶液由绿色转变为暗红色时，煮沸2分钟，冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗红色。同时做空白试验。每l.0ml的1.0mol/l的氢氧化钠滴定液相当于30.03mg的甲醛。优选的，如上所述的方法，所述甲醛溶液标定产生的不确定度分量u(甲醛标定)＝[u2(盐酸标准溶液)+u2(甲醛溶液质量)]1/2；其中，式中u(盐酸标准溶液)为盐酸标准溶液配制过程中引入的不确定度分量；u(甲醛溶液质量)为配制所述甲醛溶液时，称取甲醛溶液质量过程中引入的不确定度分量。具体的，所述甲醛溶液标定产生的不确定度分量由以下方面组成：1滴定管体积引入的不确定度滴定体积空白和样品采用同一根滴定管测量是相关量，但是最终体积是空白与样品的差值，其系统误差相抵消，因此其产生的不确定度接近0。则滴定管体积引入的不确定度＝0。2盐酸标准溶液的浓度引入的不确定度标定重复性引入的不确定度；无水碳酸钠质量引入的不确定度；滴定管体积引入的不确定度；无水碳酸钠摩尔质量引入的不确定度。2.1标定重复性引入的不确定度分量相同条件下对同一盐酸标准溶液进行10次标定，其标定结果如下：计算：采用贝塞尔公式计算标准偏差：则相对标准偏差的不确定度为：0.0042/0.5020＝0.00832.2无水碳酸钠质量引入的不确定度2.2.1主要是称量的重复性引入的不确定度分量对无水碳酸钠进行10次称量，称量结果如下所示：计算：采用贝塞尔公式计算10次标准偏差：则不确定度为：u1＝0.49mg2.2.2天平校准引入的不确定度分量由天平说明书可知，最大允许误差为：1.5mg包含因子k＝√3则天平校准引入的不确定度为：u2＝1.5/√3＝0.8660mg2.2.3天平分辨力引入的不确定度分量由天平校准证书可知分辨力为：0.1mg，区间半宽为：0.05mg则天平分辨力引入的不确定度为：u3＝0.05/√3＝0.0288mg综上所述：无水碳酸钠重复性引入合成的标准的确定度为：u＝(u21+u22+u23)1/2＝0.9954mg其无水碳酸钠质量相对合成标准不确定度为：u(碳酸钠)＝0.9954mg/0.8005g＝0.00122.3滴定管体积引入的不确定度为：02.4无水碳酸钠摩尔质量引入的不确定度根据查2005年iupac发布的相对原子质量表可得：钠原子的相对质量为22.98976928(3)g/mol碳原子的相对质量为12.0107(8)g/mol氧原子的相对质量为15.9994(3)g/mol可知三种原子的相对质量最大允许误差分别为：0.000000003g/mol；0.0008g/mol；0.0003g/mol均匀分布则上述三种原子相对质量的标准不确定度类别包含因子计算结果钠原子标准不确定度√31.73×10-9碳原子标准不确定度√30.00046氧原子标准不确定度√30.00017则其无水碳酸钠摩尔质量的标准不确定度为：u＝[1/2(mna2co3)2]1/2＝0.000525其相对标准不确定度:0.000525/52.9942＝0.0000099067分析其相对标准不确定度为较小，故在合成时可忽略不计。综上所述:盐酸标准溶液的浓度引入的合成标准不确定度为：u(盐酸标准溶液)＝(0.00832+0.00122)1/2＝0.008383称取甲醛溶液质量引入的不确定度分量：方法：用电子天平进行称量，采用去皮法进行称量，样品的质量(m样)＝瓶与样品的质量(m2)—瓶的质量(m1)瓶的质量(m1)引入的不确定度称量重复性引入的不确定度分量：取一瓶对其进行10次重复测定，属于a类实验测得结果如下：计算：采用贝塞尔公式计算10次标准偏差：则不确定度为：u1＝0.0096mg天平称量不准引入的不确定度分量:天平校准证书可知最大允许误差为：0.15mg，k＝√3则天平称量不准引入的不确定度：u2＝0.15/√3＝0.0866mg天平的可读性(分辨力)引入的不确定度分量天平显示的分辨力为：0.01mg,区间半宽为：0.005mg，k＝√3则天平的可读性(分辨力)引入的不确定度为：u3＝0.005/√3＝0.0028mg综上所述:称量瓶的质量(m1)引入合成标准不确定度为：u(m1)＝(u21+u22+u23)1/2＝0.0871mg瓶与样的质量(m2)引入的不确定度分量称量重复性引入的不确定度分量:取样品对其进行10次重复测定，属于a类实验测得结果如下：计算：采用贝塞尔公式计算10次标准偏差：则不确定度为：u1＝0.1195mg天平称量不准引入的不确定度分量：天平校准证书可知最大允许误差为：0.15mg，k＝√3则天平称量不准引入的不确定度：u2＝0.15/√3＝0.0866mg天平的可读性(分辨力)引入的不确定度分量天平显示的分辨力为：0.01mg,区间半宽为：0.005mg，k＝√3则天平的可读性(分辨力)引入的不确定度为：u3＝0.005/√3＝0.0028mg综上所述：瓶与样的质量(m2)引入合成标准不确定度为：u(m2)＝(u21+u22+u23)1/2＝0.1476mg样品质量为：76.7988-75.2452＝1.5536g,样品质量的合成标准不确定度：u＝(u2(m1)+u2(m2))1/2＝0.1713mg综上所述：称取甲醛溶液质量的合成标准不确定度为：0.1713/1.5536＝0.00011综上所述：标定甲醛溶液引入的不确定度：u＝(u2(盐酸标准溶液)+u2(甲醛溶液质量))1/2＝0.00838优选的，如上所述的方法，在步骤c)中，所述醋酸-醋酸铵缓冲液的配置方法为：取分析纯醋酸12.9ml，在100ml容量瓶中加水定容得醋酸液；取分析纯醋酸铵173.4g转入1000ml量筒中加水至1000ml得醋酸铵液；用50ml量筒取所述醋酸液40ml，在1000ml容量瓶中加所述醋酸铵液定容即得。优选的，如上所述的方法，所述醋酸-醋酸铵缓冲液配制产生的不确定度分量u(醋酸-醋酸铵)＝0.1119。具体的，所述醋酸-醋酸铵缓冲液(ph6.25)配制产生的不确定度分量由以下方面组成：配制(1)液醋酸液引入的不确定分量；配制(2)液醋酸铵液引入的不确定分量；(1)液+(2)液引入的不确定分量。1配制(1)液引入的不确定分量100ml容量瓶引入的不确定度：根据校准证书可知：最大允许误差为0.02；符合三角分布，则k＝√6则不确定度为：0.02/√6＝0.00812配制(2)液引入的不确定分量；2.11000ml量筒引入的不确定度：根据校准证书可知：最大允许误差为0.1，符合三角分布，k＝√6则不确定度为：0.1/√6＝0.04082.2天平引入的不确定度由校准证书可知天平的不确定为：u＝0.1，k＝2则相对标准不确定度为：0.1/2＝0.05综上所述：合成标准不确定度为：u＝(0.04082+0.052)1/2＝0.06453(1)液+(2)液引入的不确定分量。3.11000ml容量瓶引入的不确定度：根据校准证书可知：最大允许误差为0.1，k＝√6符合三角分布，则不确定度为：0.1/√6＝0.04083.250ml量筒引入的不确定度：根据校准证书可知：最大允许误差为0.2，k＝√6符合三角分布，则不确定度为：0.2/√6＝0.0816则引入的合成不确定度为：u＝(0.04082+0.08162)1/2＝0.0912综上所述：醋酸-醋酸铵缓冲液配制引入的不确定度：u(醋酸-醋酸铵)＝(0.00812+0.06452+0.09122)1/2＝0.1119优选的，如上所述的方法，在步骤c)中，所述乙酰丙酮试液的配置方法为：用10ml量筒称取分析纯乙酰丙酮7.0ml，用25ml量筒称取乙醇14ml，在1000ml容量瓶中将二者混合并加水定容。优选的，如上所述的方法，所述乙酰丙酮试液配制产生的不确定度分量u(乙酰丙酮)＝0.0883。具体的，所述乙酰丙酮试液配制产生的不确定度分量由以下方面组成：10ml量筒引入的不确定度分量：由校准证书可知：最大允许误差为-0.15ml，包含因子k＝√6为三角分布，属于b类不确定度；0.15/√6＝0.061225ml量筒引入的不确定度分量：由校准证书可知：最大允许误差为-0.12ml，包含因子k＝√6为三角分布，属于b类不确定度；0.12/√6＝0.04891000ml容量瓶引入的不确定度分量：由校准证书可知：最大允许误差为0.10ml，包含因子k＝√6为三角分布，属于b类不确定度；0.10/√6＝0.0408乙酰丙酮试液配制引入的不确定度：u(乙酰丙酮)＝(0.06122+0.04892+0.04082)1/2＝0.0883综上所述，按照上述情形进行计算，甲醛残留量测定的相对合成标准不确定度为：u＝[u2(供试品)+u2(对照品)+u2(甲醛标定)+u2(醋酸-醋酸铵)+u2(乙酰丙酮)]1/2＝0.2118；甲醛残留量测定的扩展不确定度为：u＝k×0.2118＝0.4236＝0.42。应用例应用例1：两个不同单位检验同一批重组禽流感病毒灭活疫苗甲醛残留量测定。实验室1检验结果为：0.07％(y1)，甲醛残留量不确定度为：0.43(u1)。实验室2检验结果为：0.06％(y2)，甲醛残留量不确定度为：0.42(u2)。根据：|y1-y2|≤(u12+u22)1/2判定两实验室间检验是否存在误差，最终判定结果是否满意。应用例2：同一实验室不同检验人员检验同一批重组禽流感病毒灭活疫苗甲醛残留量测定。检验人员1：检验结果为：0.07％(y1)。检验人员2：检验结果为：0.06％(y2)。甲醛残留量不确定度为：0.42(u)根据|y1-y2|≤√2u判定检验人员之间是否存在误差，最终判定结果是否满意。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12