本发明涉及循环肿瘤细胞识别技术领域，更具体地说，涉及一种循环肿瘤细胞的检测识别方法和系统。
背景技术：
循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell，ctc)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，来源于实体肿瘤病灶。大部分ctc在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者的死亡风险。ctc于2007年被美国临床肿瘤学会纳入肿瘤标志物；多项临床研究表明患者ctc数量与肿瘤转移、个体化治疗、疗效监测及预后等密切相关。
现有的一种检测识别循环肿瘤细胞的系统是cellsearch系统，其是基于免疫磁性分离原理发展起来的一种半自动化的检测仪器。cellsearch系统依据肿瘤细胞表面的上皮细胞粘附分子(epithelialcelladhesionmolecule，epcam)呈阳性而血液细胞不表达epcam的特性，将epcam抗体包被于磁珠表面，在抗原抗体反应下，这些富含磁珠的epcam抗体会与循环肿瘤细胞结合。其中，利用cellsearch系统进行循环肿瘤细胞检测识别的方法包括:准备样品即使用包被有epcam抗体的磁珠对表达epcam的细胞进行富集，将细胞固定，并用dapi荧光核染料、cd45荧光抗体和ck8、ck18以及ck19荧光抗体标记细胞；用半自动四色荧光显微镜对标记后的样品进行识别分析，以得到血液中循环肿瘤细胞的数量。
但是，利用cellsearch系统进行循环肿瘤细胞的检测识别时，在样品准备阶段的操作步骤较多，这样会导致循环肿瘤细胞的损失和损坏，会严重影响检测的灵敏度、准确度和检测效率。此外，由于上述方法要求用于标记的荧光剂与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物，因此，会导致被标记循环肿瘤细胞的活性发生改变，且样品表面容易残留大量游离的荧光分子，影响检测的灵敏度。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种循环肿瘤细胞的检测识别方法和系统，以提高循环肿瘤细胞检测的灵敏度、准确度和检测效率。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种循环肿瘤细胞的检测识别系统，包括光源模块、椭球面反射镜、光电转换模块和图像识别模块；
所述光源模块用于出射激光，并将所述激光聚焦在样品台上的待测样品上；所述待测样品为经过过滤和非荧光染色的血液涂片；所述待测样品中循环肿瘤细胞所在的平面与所述椭球面反射镜的一个焦点所在的平面重合，且所述激光聚焦在所述焦点上；
所述椭球面反射镜用于将所述待测样品散射的激光反射至所述光电转换模块的受光面；所述光电转换模块受光面与所述椭球面反射镜另一个焦点所在的平面重合；
所述光电转换模块用于将采集的光信号转换为电信号，并将所述电信号传输至所述图像识别模块；
所述图像识别模块用于根据所述电信号生成所述待测样品的图像，并对所述图像中的循环肿瘤细胞进行识别。
优选地，所述光源模块包括光源和物镜；
所述光源用于出射激光；
所述物镜用于将所述激光聚焦在样品台上的待测样品上。
优选地，所述光源模块还包括依次设置在所述光源和所述物镜之间的偏振片组和扩束镜；
所述偏振片组包括至少两个偏振片，所述偏振片组用于对所述光源出射的激光的光强进行调整；
所述扩束镜用于对所述激光进行扩束，以使激光光束填满所述物镜的入射光瞳。
优选地，所述光电转换模块为光电倍增管；
所述检测识别系统还包括设置在所述光电倍增管受光面的小孔光阑；
所述椭球面反射镜反射的激光经过所述小孔光阑后照射到所述光电倍增管的受光面。
优选地，还包括样品台驱动模块；
所述样品台驱动模块用于驱动所述样品台以及待测样品以恒定的速度沿一个方向移动，同时以恒定的角速度在中心轴上旋转，以使聚焦在所述待测样品表面的光斑在所述待测样品表面沿阿基米德螺旋线移动；
所述光电转换模块按照预设的时间节点序列采集光信号，以得到间隔相等的多个采样点。
优选地，所述时间节点序列是根据公式
一种循环肿瘤细胞的检测识别方法，应用于如上任一项所述的循环肿瘤细胞的检测识别系统，包括：
光源模块出射激光，并将所述激光聚焦在样品台上的待测样品上，所述待测样品为经过过滤和非荧光染色的血液涂片；
椭球面反射镜将所述待测样品散射的激光反射至光电倍增管的受光面；
所述光电倍增管将采集的光信号转换为电信号，并将所述电信号传输至图像识别模块；
所述图像识别模块根据所述电信号生成所述待测样品的图像，并对所述图像中的循环肿瘤细胞进行识别。
优选地，光源模块出射激光之前还包括：
制作血液涂片。
优选地，所述制作血液涂片包括：
对血液样品进行过滤，并保留所述血液样品中的循环肿瘤细胞；
采用过滤后的所述血液样品制成血液涂片；
采用非荧光染料对所述血液涂片进行染色。
优选地，还包括：
样品台驱动模块驱动所述样品台以及待测样品以恒定的速度沿一个方向移动，同时以恒定的角速度在中心轴上旋转，以使聚焦在所述待测样品表面的光斑在所述待测样品表面沿阿基米德螺旋线移动；
光电转换模块按照预设的时间节点序列采集光信号，以得到间隔相等的多个采样点。
与现有技术相比，本发明所提供的技术方案具有以下优点：
本发明所提供的循环肿瘤细胞的检测识别方法和系统，光源模块出射激光，并将激光聚焦在样品台上的待测样品上。由于待测样品的位置与椭球面反射镜的一个焦点的位置重合，光电倍增管受光面的位置与椭球面反射镜的另一个焦点的位置重合，因此，椭球面反射镜会将待测样品散射的激光反射至光电转换模块的受光面；光电转换模块将受光面采集的光信号转换为电信号，图像识别模块根据电信号生成待测样品的图像，并对图像中的循环肿瘤细胞进行识别。
由于待测样品只是经过过滤和非荧光染色的血液涂片，没有进行生物特异性富集，因此，不仅可以降低检测成本，而且与现有技术相比，在样品准备阶段的步骤较少，循环肿瘤细胞的损失和损坏都较少，从而可以提高检测的灵敏度、准确度和检测效率；并且，由于血液涂片时采用非荧光染料进行的染色，因此，样品表面不会残留大量游离的荧光分子，从而进一步提高了检测的灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的循环肿瘤细胞的检测识别系统的结构示意图；
图2为本发明实施例提供的椭球面反射镜的反射示意图；
图3(a)为不均匀分布的采样点的示意图；
图3(b)为本发明实施例提供的均匀分布的采样点的示意图；
图4(a)为本发明实施例提供的待测样品的扫描图像的示意图；
图4(b)为图4(a)的局部放大图；
图5为本发明实施例提供的循环肿瘤细胞的检测识别方法的流程图。
具体实施方式
正如背景技术所述，由于cellsearch系统要求用于标记的荧光剂与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物，因此，会导致被标记循环肿瘤细胞的活性发生改变，且样品表面容易残留大量游离的荧光分子，影响检测的灵敏度。
虽然现有技术中也研究开发了多种免荧光标记的光学生物传感技术，但是，这些传感技术大多结构复杂、生物涂片制作难度大、检测效率低，因此，难以推广和应用。
基于此，本发明提供了一种循环肿瘤细胞的检测识别系统，以克服现有技术存在的上述问题，包括光源模块、椭球面反射镜、光电转换模块和图像识别模块；
所述光源模块用于出射激光，并将所述激光聚焦在样品台上的待测样品表面；所述待测样品为经过过滤和非荧光染色的血液涂片；所述待测样品的位置与所述椭球面反射镜的一个焦点的位置重合；所述椭球面反射镜用于将所述待测样品散射的激光反射至所述光电转换模块的受光面；所述光电转换模块受光面的位置与所述椭球面反射镜的另一个焦点的位置重合；所述光电转换模块用于将采集的光信号转换为电信号，并将所述电信号传输至所述图像识别模块；所述图像识别模块用于根据所述电信号生成所述待测样品的图像，并对所述图像中的循环肿瘤细胞进行识别。
本发明还提供了一种循环肿瘤细胞的检测识别方法，其特征在于，应用于如上所述的循环肿瘤细胞的检测识别系统，包括：
光源模块出射激光，并将所述激光聚焦在样品台上的待测样品上，所述待测样品为经过过滤和非荧光染色的血液涂片；椭球面反射镜将所述待测样品散射的激光反射至光电倍增管的受光面；所述光电倍增管将采集的光信号转换为电信号，并将所述电信号传输至图像识别模块；所述图像识别模块根据所述电信号生成所述待测样品的图像，并对所述图像中的循环肿瘤细胞进行识别。
本发明提供的循环肿瘤细胞的检测识别方法和系统，由于待测样品只是经过过滤和非荧光染色的血液涂片，没有进行生物特异性富集，因此，不仅可以降低检测成本，而且与现有技术相比，在样品准备阶段的步骤较少，循环肿瘤细胞的损失和损坏都较少，从而可以提高检测的灵敏度、准确度和检测效率；并且，由于血液涂片时采用非荧光染料进行的染色，因此，不会影响被标记的循环肿瘤细胞的活性，且样品表面也不会残留大量游离的荧光分子，从而进一步提高了检测的灵敏度。
以上是本发明的核心思想，为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种循环肿瘤细胞的检测识别系统，主要应用于外周血中循环肿瘤细胞的检测识别，该检测识别系统为椭球共聚焦暗场旋转扫描成像系统，如图1所示，包括光源模块1、椭球面反射镜2、光电转换模块3和图像识别模块(图中未示出)。
其中，光源模块1用于出射激光，并将激光聚焦在样品台上的待测样品4上。该待测样品4为经过过滤和非荧光染色的血液涂片。该待测样品4中循环肿瘤细胞所在的平面与椭球面反射镜2的一个焦点所在的平面重合，且激光聚焦在该焦点上，光电转换模3的受光面与椭球面反射镜2另一个焦点所在的平面重合。
椭球面反射镜2用于将待测样品4散射的光线反射至光电转换模块3的受光面；光电转换模块3用于将采集的光信号转换为电信号，并将电信号传输至图像识别模块4；图像识别模块4用于根据电信号生成待测样品4的图像，并对图像中的循环肿瘤细胞进行识别。
如图2所示，在直角坐标系中，椭球面反射镜2可以表示为：
由于待测样品4是透明的，因此，需要消除来自待测样品4背面的散射噪声。由于对于椭球面反射镜2而言，其理想成像的位置只有一对焦点f1和f2，因此，本发明中通过精密调整样品台的高度以及光斑落在待测样品4表面的位置，使得待测样品4中的循环肿瘤细胞所在平面与焦点f1所在平面重合，并使得激光的光斑聚焦在焦点f1上，从而可以避免待测样品4背面的散射信号被聚焦，进而可以实现单层扫描的目的。
本实施例中，如图1所示，光源模块1包括光源10和物镜11、依次设置在光源10和物镜11之间的偏振片组12和扩束镜13。光源10用于出射激光；物镜11用于将激光聚焦在样品台上的待测样品4表面。偏振片组12包括至少两个偏振片，该偏振片组用于对光源10出射的激光的光强进行调整；扩束镜13用于对激光进行扩束，以使激光光束填满物镜11的入射光瞳。
优选地，本实施例中的光源10为激光二极管，其出射的激光为405nm波长的光束。物镜11为3.47厘米焦距的物镜，其聚焦在待测样品4表面的光斑的直径大约为20微米。偏振片组12包括两个偏振片，通过调整两个偏振片之间的角度可以调整入射到扩束镜13的激光的光强。
进一步地，本实施例中的光电转换模块3为光电倍增管。该检测识别系统还包括设置在光电倍增管受光面的小孔光阑5；椭球面反射镜2反射的激光经过小孔光阑5后照射到光电倍增管的受光面。优选地，小孔光阑5的小孔直径为5μm。
本实施例中，利用小孔光阑5对光线进行空间滤波，可以排除空间中的颗粒散射以及光路中的其他杂质散射引入的高频噪声，从而可以提高检测识别系统的采样效率和扫描分辨率。
此外，本实施例中的检测识别系统还包括样品台驱动模块(图中未示出)。该样品台驱动模块用于驱动样品台以及样品台上的待测样品4以恒定的速度v沿一个方向移动，同时以恒定的角速度ω在中心轴上旋转，以使聚焦在待测样品4表面的光斑在待测样品4表面沿阿基米德螺旋线移动，即待测样品4表面的各个采样点构成阿基米德螺旋线。
当光源10出射的激光会聚在待测样品4的一个位置处时，图像识别模块4获得的是待测样品4一个采样点的图像，当聚焦在待测样品4表面的光斑在待测样品4表面沿阿基米德螺旋线移动时，图像识别模块4可以获得多个采样点的图像，并根据多个采样点的图像获得整个待测样品4即血液涂片的图像，进而可以对整个待测样品4中的循环肿瘤细胞进行识别，以获得整个待测样品4中的循环肿瘤细胞的数量。
需要说明的是，如果样品台驱动模块仅驱动样品台以及样品台上的待测样品4以恒定的速度v沿一个方向移动，同时以恒定的角速度ω在中心轴上旋转，那么，随着样品台的移动，如图3a所示，相邻的两个采样点a之间的间隔会越来越大，会导致检测区域采样的不均匀性，从而降低检测结果的准确性。
假设用t来表示时间，则相邻的两个采样点a之间的距离δs可以表示为：
优选地，样品台以一个恒定的1000赫兹的频率沿一个方向持续旋转，从而采集得到一系列随时间变化的散射信号。由高速旋转的磁盘，静态模式转换为高频信号，从而有效地了避免了静态模式中的1/f噪声。例如，对空白样品进行扫描，背景散射噪声可以降低到0.0046v。
本实施例中，在采用检测识别系统进行循环肿瘤细胞的检测识别之前，需要先制作待测样品4即血液涂片。制作血液涂片的过程为：先使用8μm孔径的聚碳酸酯膜过滤外周血样品以筛选循环肿瘤细胞。对外周血样品进行过滤后，较小的红细胞和血小板被滤掉，较大的白细胞和循环肿瘤细胞留在聚碳酸酯膜上。采用过滤后的外周血样品制成血液涂片后，对血液涂片进行染色，具体地，使用银染和瑞氏吉姆萨染色的方法对血液涂片进行染色。
如图4(a)和4(b)所示，由于肿瘤细胞体积是正常细胞的3倍以上，细胞核大，核畸形怪状，染色后的颜色较深，因此，对血液涂片进行染色以及扫描后，图像识别模块4可以从血液涂片的图像中识别出循环肿瘤细胞，并对循环肿瘤细胞的数量进行统计，以便根据循环肿瘤细胞的数量对肿瘤转移情况进行判断。
本实施例提供的循环肿瘤细胞的检测识别系统，由于待测样品只是经过过滤和非荧光染色的血液涂片，没有进行生物特异性富集，因此，不仅可以降低检测成本，而且与现有技术相比，在样品准备阶段的步骤较少，循环肿瘤细胞的损失和损坏都较少，从而可以提高检测的灵敏度、准确度和检测效率；并且，由于血液涂片时采用非荧光染料进行的染色，因此，不会影响被标记的循环肿瘤细胞的活性，且样品表面也不会残留大量游离的荧光分子，从而进一步提高了检测的灵敏度。
本实施例中，通过以椭球面反射镜和小孔光阑为核心的椭球共聚焦暗场扫描成像系统进行循环肿瘤细胞的检测识别，系统结构简单，分辨率较高，检测过程中的噪声较低，检测信号的精确度和对比度都较高；
本实施例中，采用空间均匀性的方式进行采样，而不是采用等时间间隔的方式进行采样，因此，可以使得采样点在待测样品上的分布更均匀，从而可以提高采样效率。
本发明实施例还提供了一种循环肿瘤细胞的检测识别方法，应用于如上所述的循环肿瘤细胞的检测识别系统，如图5所示，包括：
s501：光源模块出射激光，并将所述激光聚焦在样品台上的待测样品表面，所述待测样品为经过过滤和非荧光染色的血液涂片；
s502：椭球面反射镜将所述待测样品散射的激光反射至光电倍增管的受光面；
s503：所述光电倍增管将采集的光信号转换为电信号，并将所述电信号传输至图像识别模块；
s504：所述图像识别模块根据所述电信号生成所述待测样品的图像，并对所述图像中的循环肿瘤细胞进行识别。
其中，光源模块出射激光光束之前还包括：制作血液涂片。
进一步地，制作血液涂片的过程包括：
对血液样品进行过滤，并保留所述血液样品中的循环肿瘤细胞；
采用过滤后的所述血液样品制成血液涂片；
采用非荧光染料对所述血液涂片进行染色。
具体地，先使用8μm孔径的聚碳酸酯膜过滤外周血样品以筛选循环肿瘤细胞。对外周血样品进行过滤后，较小的红细胞和血小板被滤掉，较大的白细胞和循环肿瘤细胞留在聚碳酸酯膜上。采用过滤后的外周血样品制成血液涂片后，对血液涂片进行染色，具体地，使用银染和瑞氏吉姆萨染色的方法对血液涂片进行染色。
然后，参考图1，将血液涂片即待测样品4放置在样品台上，调整样品台的高度以及光斑落在待测样品4表面的位置，使得待测样品4中的循环肿瘤细胞所在平面与焦点f1所在平面重合，并使得激光的光斑聚焦在焦点f1上，同时保证光电转换模3的受光面与椭球面反射镜2另一个焦点f2所在的平面重合。
之后，光源10出射激光，激光经过偏振片组12和扩束镜13后入射到物镜11，物镜11将激光聚焦在样品台上的待测样品4上，椭球面反射镜2将待测样品4散射的光线反射至光电转换模块3的受光面；光电转换模块3将采集的光信号转换为电信号，并将电信号传输至图像识别模块4；图像识别模块4用于根据电信号生成待测样品4一个采样点的图像。
在检测识别的过程中，样品台驱动模块会驱动样品台以及待测样4以恒定的速度v沿一个方向移动，同时以恒定的角速度ω在中心轴上旋转，以使聚焦在待测样品4上的光斑在待测样品4表面沿阿基米德螺旋移动；光电转换模块3按照预设的时间节点序列采集光信号，以得到间隔相等的多个采样点。图像识别模块根据多个采样点的电信号生成的图像生成待测样品4的图像，并对图像中的循环肿瘤细胞进行识别，以获得整个待测样品中的循环肿瘤细胞的数量，以便根据循环肿瘤细胞的数量对肿瘤转移情况进行判断。
基于此，本实施例提供的检测识别方法，还包括：
样品台驱动模块驱动所述样品台以恒定的速度沿一个方向移动，同时以恒定的角速度在中心轴上旋转，以使聚焦在所述待测样品表面的光斑在所述待测样品表面沿阿基米德螺旋移动；
光电转换模块按照预设的时间节点序列采集光信号，以得到间隔相等的多个采样点。
本实施例提供的循环肿瘤细胞的检测识别方法，由于待测样品只是经过过滤和非荧光染色的血液涂片，没有进行生物特异性富集，因此，不仅可以降低检测成本，而且与现有技术相比，在样品准备阶段的步骤较少，循环肿瘤细胞的损失和损坏都较少，从而可以提高检测的灵敏度、准确度和检测效率；并且，由于血液涂片时采用非荧光染料进行的染色，因此，不会影响被标记的循环肿瘤细胞的活性，且样品表面也不会残留大量游离的荧光分子，从而进一步提高了检测的灵敏度。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。