本发明属于分子生物学技术领域，具体地说是一种循环肿瘤细胞表面标志分子pd-l1的检测方法。
背景技术：
程序性死亡受体-1(pd-1)是主要的免疫检查点受体，通过结合其配体程序性死亡配体-1(pd-l1)，使t细胞效应功能的下调，从而有助于维持对肿瘤细胞的耐受性。通过抗pd-1和抗pd-l1抗体阻断这些通路，可能有助于阻止这种下调从而使t细胞维持其抗肿瘤特性和介导肿瘤细胞死亡的能力。目前市场上针对pd-1和pd-l1的抑制剂主要有三种，pembrolizumab(商品名：keytruda)、nibolumab(商品名：opdivo)和atezolizumab(商品名：tecentriq)，可用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌等多种癌症的治疗。但是，并不是所有患者都能从pd-1/pd-l1抑制剂治疗过程中受益，pd-1/pd-l1抑制剂目前只在少部分的癌症病人身上可以产生持久控制肿瘤的效果。因此，检测病人是否有pd-l1阳性表达，能够有效帮助病人选择合适的药物用于治疗。目前，pd-1/pd-l1的检测方法主要是基于细胞蛋白水平的检测，在临床中，主要采用免疫组化的方法，利用手术或穿刺后取得的肿瘤组织进行切片染色。免疫组化的结果与病理医师的经验密切相关。除了染色技术外，抗体的特异性也尤其重要。而目前我国pd-l1的检测比较混乱，一是染色技术和条件的不统一；二是染色抗体的多样；三是病理评价标准尚未统一，这些都导致了国内患者使用免疫组化评价pd-l1水平的价值降低。另外，由于免疫组化必须取得组织进行检测，无论是通过手术或者穿刺的手法，都是一种有创操作，会对病人造成伤害。因此，我们迫切需要一种新的无创的、评价方法和标准较为稳定的pd-l1检测方法。
循环肿瘤细胞是由原发灶脱落，进入血循环后，在远处器官或原发脏器定居，形成转移灶。循环肿瘤细胞ctc检测作为液体活检的热门领域，在肿瘤诊断、治疗和监控等方面的临床表现已逐渐崭露头角，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，临床应用价值极其显著。因此，若能提供一种检测循环肿瘤细胞表面pd-l1的方法，将具有非常重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的就是要解决上述现有技术的不足而提供一种循环肿瘤细胞表面标志分子pd-l1的检测方法，该检测方法简便、快速、经济，无创，灵敏度高，特异性好，能够解决现有技术检测pd-l1的不足。
本发明的技术方案具体介绍如下。
一种循环肿瘤细胞表面标志分子pd-l1的检测方法，包括以下步骤：
(1)将全血用红细胞裂解液处理，分离出有核细胞，并用甲醛进行固定；
(2)先通过肿瘤免疫荧光标志物细胞角蛋白抗体anti-ck进行阳性筛选，用pd-l1一抗孵育所有细胞，然后用标记有fitc荧光基团的pd-l1二抗孵育，再用细胞核荧光染料dapi标记出所有细胞；
(3)采用高通量多色成像分析，选择cy5、fitc和dapi的滤光片，观察通道表面荧光颜色，最终实现对循环肿瘤细胞表面标志分子pd-l1的检测。
本发明中，步骤(2)的具体反应条件如下：
a.向细胞固定后的培养皿中加入含4-6％脱脂奶粉的pbs溶液，4℃避光孵育40-70min；
b.吸除脱脂奶粉pbs溶液后，沿壁加入pbst清洗若干次；
c.向封闭液中加入肿瘤免疫荧光标志物细胞角蛋白抗体anti-ck和pd-l1一抗，抗体来源为abcam公司，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜；
d.吸除混合液，向封闭液中加入标记有fitc荧光基团的pd-l1二抗，抗体来源为abcam公，混匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育40-70minh；
e.吸除抗体，用pbst清洗若干次，加入dapi，常温避光孵育20-40min。
本发明中，条件b中，pbst中含0.02wt％tween-20的pbs。
本发明中，步骤(3)中，观察通道表面荧光颜色，显蓝色的则dapi+，不显蓝色则dapi-，显绿色则pd-l1+，不显绿色则pd-l1-，显红色则ck+，不显红色则ck-；根据荧光显色，将dapi+且ck+的点认为是循环肿瘤细胞ctc，若该循环肿瘤细胞ctc上存在pd-l1+，那么该循环肿瘤细胞ctc为pd-l1+ctc。
本发明同现有技术相比，首次将ctc检测和pd-l1标志物检测结合起来，通过对血液进行红细胞裂解，利用纳米技术使剩余有核细胞(主要是ctc和淋巴细胞)全部平铺富集在纳米基底上固定，然后用细胞核荧光染料dapi标记出所有细胞，之后通过肿瘤免疫荧光标志物细胞角蛋白抗体anti-ck进行阳性筛选，由于ctc表面具有pd-l1的特异性表达，用pd-l1一抗孵育所有细胞，再用标记有fitc荧光基团的二抗孵育，最后通过高通量技术扫描，最终实现对循环肿瘤细胞表面标志分子pd-l1的检测，该检测方法简便、快速、经济，无创，灵敏度高，特异性好，解决了现有技术检测pd-l1的不足。
附图说明
图1为检测循环肿瘤细胞pd-l1阳性表达的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作以下进一步说明。
实施例1
图1为检测循环肿瘤细胞pd-l1阳性表达的示意图。图1a为蓝色荧光通道，使用dapi标记细胞核，显蓝色的则dapi+，说明是个完整的细胞，不显蓝色则dapi-，不是完整的细胞；图1b为绿色荧光通道，标记pd-l1蛋白，显绿色则pd-l1+，不显绿色则pd-l1-；图1c为红色荧光通道，标记ck蛋白，显红色则ck+，不显红色则ck-。图1d为三个通道的合成。
本实施例以检测临床肝癌样本循环肿瘤细胞表面pd-l1表达一例，具体包括以下步骤：
1)全血处理：
a.向2ml全血中加入200μl1×红细胞裂解液，室温放置15min，期间均匀摇晃。
b.200rcf离心5分钟，吸除上清，保留细胞。
c.向离心管中加入2ml1％fpbs(v(fbs):v(pbs)＝1:99)，混匀后于200rcf离心5分钟，去上清。
2)细胞全富集：
a.加入1mlfpbs混匀后转入处理好的培养皿中，将培养皿置于37℃摇床中培养45min。
b.培养后将培养皿置于4℃冰箱中，静置1min。
3)细胞固定：
a.吸除fpbs，向培养皿中加入4％甲醛后置于4℃静置1min。
b.吸除甲醛，加入1ml甲醇，置于-20℃20min。
c.吸除甲醇，每次用2mlpbs清洗三次。(注：每次加入液体时，沿培养皿壁加入，避免将细胞冲起。
4)封闭及抗体孵育：
a.向培养皿中加入1ml5％(m/v)含0.02％tween-20的脱脂奶粉(用pbs配制)，4℃避光孵育1h。
b.吸除脱脂奶粉后，沿壁加入2mlpbst(含0.02％tween-20的pbs)清洗4次，每次5min。
c.向500μl封闭液中加入1μlanti-ck(购自abcam公司)，再加入2μlpd-l1一抗(购自abcam公司)，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜。
d.吸除混合液，向500μl封闭液中加入5μl标记有fitc荧光基团的pd-l1二抗(购自abcam公司)，混匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育1h。
e.吸除抗体，用pbst清洗三次，加入1ml细胞核染料dapi(4,6-联眯-2-苯基吲哚)，常温避光孵育30min。
5)扫描：吸除抗体，用2mlpbst清洗三次，加入1mlpbs扫描。
对上述临床肝癌样本，采用高通量多色成像分析，选择cy5、fitc和dapi的滤光片，观察通道表面荧光颜色，显蓝色的则dapi+，不显蓝色则dapi-，显绿色则pd-l1+，不显绿色则pd-l1-，显红色则ck+，不显红色则ck-，根据荧光显色，将dapi+且ck+的“点”认为是ctc，如果该ctc上存在pd-l1+，那么该ctc为pd-l1+ctc(图1)，否则，则不是。该检测方法简便、快速、经济，无创，灵敏度高，特异性好。
本发明并不受上述实施方式的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。