本发明属于生物医学或生物制药
技术领域：
：，涉及一种可溶性cd38浓度的检测方法。
背景技术：
：：cd38是一个单次跨膜的糖蛋白，常被用作细胞分化的标记分子。1996年，首次发现可溶性cd38(solublecd38，scd38)，它被认为是全长cd38分子的膜外结构域被切割释放的产物。它们存在于多种生理及病理体液和肿瘤细胞培养上清中，保留了cd38的抗原特性和催化活性1。随后的研究发现，可溶性cd38能够作为一种信号分子，具有诱导细胞增殖和迁移2、延长记忆抗体寿命3和调节母胎耐受等4等功能。cd38在多种血液癌细胞，例如多发性骨髓瘤细胞表面呈现异常高表达5，而在正常淋巴细胞、骨髓细胞以及一些非造血细胞上处于低表达状态。因此，cd38被认为是一个治疗多发性骨髓瘤的靶标，多个针对其的治疗性单克隆抗体正在研发过程中6。细胞表面cd38的表达量是多发性骨髓瘤的一个诊断指标，但是病人骨髓瘤细胞的获取需要做骨髓穿刺，具有入侵性，而且骨髓的局部抽取并不能反映病人整体骨髓瘤的负荷，所以血液诊断具有优越性。由于病人血浆是一个复杂体系，可溶性cd38含量很低，需要高灵敏方法才能进行精确检测。目前市场上检测灵敏度最高的一款cd38检测elisa试剂盒，采用传统抗体进行固相夹心酶联免疫吸附，其检测灵敏度标称93.75pg/ml。缺点：1)检测灵敏度仍然有限；2)检测特异性不强，不适合检测复杂样本；3)成本高，一个试剂盒5000元仅能做96个样品/测试。参考文献1funaro,a.etal.identificationandcharacterizationofanactivesolubleformofhumancd38innormalandpathologicalfluids.internationalimmunology8,1643-1650(1996).2deaglio,s.etal.cd38/cd31interactionsactivategeneticpathwaysleadingtoproliferationandmigrationinchroniclymphocyticleukemiacells.molecularmedicine16,87-91,doi:10.2119/molmed.2009.00146(2010).3liu,x.q.,hart,d.n.,macpherson,g.g.,good,m.f.&wykes,m.n.solublecd38significantlyprolongsthelifespanofmemoryb-cellresponses.immunology125,14-20,doi:10.1111/j.1365-2567.2008.02914.x(2008).4kim,b.j.etal.seminalcd38isapivotalregulatorforfetomaternaltolerance.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica112,1559-1564,doi:10.1073/pnas.1413493112(2015).5lin,p.,owens,r.,tricot,g.&wilson,c.s.flowcytometricimmunophenotypicanalysisof306casesofmultiplemyeloma.americanjournalofclinicalpathology121,482-488,doi:10.1309/74r4-tb90-buwh-27jx(2004).6vandedonk,n.,richardson,p.g.&malavasi,f.cd38antibodiesinmultiplemyeloma:backtothefuture.blood131,13-29,doi:10.1182/blood-2017-06-740944(2018).技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种超高灵敏度、特异性的检测可溶性cd38的方法，而且能够高通量检测。为实现上述目的，本发明的第一方面，提供了可溶性cd38的检测方法，即三明治夹心法，包括捕获抗体、检测抗体。本发明第二方面，提供了一种捕获抗体、一种检测抗体，即cd38单域抗体和cd38单域抗体萤光素酶融合蛋白，包括cd38单域抗体部分和萤火虫萤光素酶部分。本发明第三方面，提供了两种dna分子，它编码本发明所述的捕获抗体和检测抗体，或本发明所述的cd38单域抗体萤光素酶融合蛋白。本发明第四方面，提供了两种表达载体，它包含cd38单域抗体基因序列和萤火虫萤光素酶突变体的基因序列。本发明第五方面，提供了两种宿主细胞，它含有前文所述的表达载体。本发明所述cd38单域抗体1053的编码基因的cds序列，其cdna序列全长为546bp(序列1)，具体序列如下：atgaaatacctattgcctacggcagccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggccgatgtgcagctgcaggagtctggaggaggcttggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtacaggctcaggacgcaccttcaggaactatcccatggcctggttccgccaggctccaggaaaggagcgtgagtttgtagcaggtattacctgggtcggtgctagcacactctatgcagacttcgcgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttatagttgtgcagcaggtcgcggtatagtggctggtaggatcccagctgagtatgccgactggggccagggcacccaggtcaccgtctcctcagaacccaagacaccaaaaccacaaccagcggccgcacatcatcatcaccatcacggggccgcagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggccgcatag编码产生长度为181个氨基酸(末端终止子未计入，即序列中***号未计入)的蛋白质序列(序列2)，具体序列如下：本发明所述cd38单域抗体551的编码基因的cds序列，其cdna序列全长为558bp(序列3)，具体序列如下：atgaaatacctattgcctacggcagccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggccgatgtgcagctgcaggagtcaggaggaggattggtgcaggctggacactctctgagactctcctgtgtaggctccggtagcagattcgataactatgccatgggctggttccgccaggctccagggaaggagcgtgaatttgtagccgctattagctggagtagtggcactacgcgctatttagacaccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagagtacggtatatcttcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcagctcgatatcagccgaggtactacgactcaggggatatggatggatatgagtatgacaactggggtcaggggacccaggtcaccgtctcctcagaacccaagacaccaaaaccacaaccagcggccgcacatcatcatcaccatcacggggccgcagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggccgcatag编码产生长度为185个氨基酸(末端终止子未计入，即序列中***号未计入)的蛋白质序列(序列4)，具体序列如下：本发明所述检测抗体的编码基因的cds序列，其cdna序列全长为2085bp(序列5)，具体序列如下：tccggtaccatggatgtgcagctgcaggagtctggaggaggcttggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtacaggctcaggacgcaccttcaggaactatcccatggcctggttccgccaggctccaggaaaggagcgtgagtttgtagcaggtattacctgggtcggtgctagcacactctatgcagacttcgcgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttatagttgtgcagcaggtcgcggtatagtggctggtaggatcccagctgagtatgccgactggggccagggcacccaggtcaccgtctcctcagaacccaagacaccaaaaccacaaccagcggagctcccgggggcggccgcctgcagaatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagtga编码产生长度为694个氨基酸(末端终止子未计入，即序列中***号未计入)的蛋白质序列(序列6)，具体序列如下：实施本发明，具有以下有益效果：本发明提供了一种超高灵敏度、特异性高通量检测可溶性cd38的方法，其灵敏度达到10pg/ml，高于商用elisa试剂盒；更重要的是，相对于试剂盒，depid法能够有效检测出复杂样本(例如血浆样本)中cd38的含量。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，对实施例描述中所使用的附图作简单地介绍。附图中：图1是cd38单域抗体1053、551和重组蛋白1053-fluc2的sds-page分析图；图2是单域抗体1053、551、375、nbgfp与标记单域抗体551-af48结合cd38的竞争图；图3是单域抗体1053、551、375、nbgfp与标记单域抗体1053-af488结合cd38的竞争图；图4是depid法的检测原理图；图5是depid法检测cd38的标准曲线；图6是depid法检测特异性图；图7是depid检测的健康志愿者与多发性骨髓瘤病人血浆中可溶性cd38水平比较。具体实施方式下面将结合附图对本发明的实施例进行具体描述。由于可溶性cd38来源于细胞表面的cd38，血浆中可溶性cd38的浓度可以反映多发性骨髓瘤细胞的增殖和肿瘤微环境中脱落酶(sheddase)活性状态，可用作诊断和监测多发性骨髓瘤疾病发展的标志物。本发明描述了一种基于两个结合于cd38不同表位的单域抗体开发的特异的、超高灵敏的可溶性cd38检测方法——双表位蛋白识别法(dualepitopesproteinidentification，depid)，并显示了可溶性cd38和多发性骨髓瘤病程的相关性。本发明将筛选得到的一系列cd38单域抗体，经过流式细胞术的方法，筛选出能够同时结合cd38的单域抗体对，即单域抗体1053和551，其中单域抗体551作为捕获抗体，单域抗体1053和萤火虫萤光素酶突变体fluc2的融合蛋白作为检测抗体。将单域抗体551包被在elisa板底来捕获溶液中的cd38，检测抗体中的fluc2催化萤光素的发光信号来评估cd38的浓度(如图4所示)，开发出一种特异性超高灵敏度的可溶性cd38检测方法depid。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例1：针对depid检测抗体表达载体的构建(1)pcr扩增cd38单域抗体1053的基因序列，使用限制性内切酶kpni和saci(购自thermoscientific)酶切prhsul2载体和1053基因序列，并用t4dna连接酶(购自takara公司)连接两个片段，构建prhsul2-1053。(2)使用限制性内切酶saci和psti酶切prhsul2-1053载体，含有saci和psti粘性末端以及2×g4s序列的两条dna单链经退火，使用t4dna连接酶将2×g4s插入prhsul2-1053，构建prhsul2-1053-g4s。(3)pcr扩增萤火虫萤光素酶突变体fluc2的基因序列，使用限制性内切酶psti和hindⅲ酶切prhsul2-1053-g4s和fluc2基因序列，用t4dna连接酶连接两个片段，构建prhsul2-1053-g4s-fluc2，即depid检测抗体的表达载体。实施例2：cd38单域抗体和depid检测抗体1053-fluc2的表达和纯化(1)将cd38单域抗体表达载体phen2-1053、phen2-551及测序鉴定正确的重组质粒prhsul2-1053-g4s-fluc2转化到表达宿主菌rosetta2(de3)中，37℃扩大培养至od600达到0.6-0.8，加1mmiptg18℃诱导表达，收集菌体超声破碎，高速离心收集上清，用于进一步纯化。(2)cd38单域抗体经ni-nta亲和层析和阴离子交换层析纯化，得到纯化的蛋白。(3)depid检测抗体经ni-nta纯化后，使用sumoproteinase切除包含有6×hissumo-tag，再经一次ni-nta反相层析，收集流出液进行q柱交换层析，即得重组蛋白1053-fluc2。单域抗体1053、551和重组蛋白1053-fluc2的sds-page结果如图1。实施例3：cd38单域抗体标记(1)cd38单域抗体超滤，将溶液置换为不含tris的缓冲液例如pbs；(2)可与氨基反应的荧光染料alexafluortm488琥珀酰亚酯(thermoscientific)用dmso溶解；(3)在cd38单域抗体中加入约5倍摩尔数的上述荧光染料，4℃避光旋转混合过夜；(4)超滤，将cd38单域抗体溶液中未标记上的荧光染料去除。实施例4：cd38单域抗体对选择(1)多发性骨髓瘤细胞系lp-1计数，将细胞密度调至5×105/ml，预冷的pbs(含1mg/mlbsa)洗两遍；(2)加0.5μg/ml标记的单域抗体和梯度浓度的单域抗体，4℃避光孵育30min；(3)预冷的pbs(含1mg/mlbsa)洗两遍，100μlpbs(含1mg/mlbsa)重悬；(4)流式细胞术检测，检测结果如图2和图3所示，单域抗体1053和551能够相互不影响同时结合于cd38的不同表位。实施例5：depid方法步骤(1)单域抗体551用pbs稀释至10μg/ml，每孔100μl包被elisa板，4℃过夜；(2)pbs洗板三次；(3)1％bsa稀释于0.1％pbst(pbs，0.1％tween20)，每孔100μl，室温封闭1h；(4)0.1％pbst洗涤三次；(5)取cd38标准品或样品20μl与0.5μg/ml1053-fluc2、1mg/mlbsa稀释于0.1％pbst至100μl，加到elisa板，室温孵育1h；(6)0.1％pbst洗涤三次；(7)加萤光素底物动态检测，取初始15s平均值计算，检测cd38的标准曲线如图5，其灵敏度可达10pg/ml。实施例6：depid特异性检测(1)取出cd38单域抗体珠子，pbs洗两遍；(2)cd38标准品或血浆样品，每个样品平均分成两份，其中一份加入cd38单域抗体珠子4℃共孵育3h后，离心取出上清；cd38单域抗体珠子处理后的样品和未处理的样品，按照实施例5进行检测，特异性结果见图6，单域抗体珠子去除样本中的cd38后，检测信号降低至背景水平。同时检测健康志愿者与多发性骨髓瘤病人血浆样本，结果如图7所示，病人血浆可溶性cd38明显高于正常水平。此外，在比较depid法与商用elisa试剂盒时，同时检测病人血浆样本，表1是depid法与商用elisa试剂盒同时检测病人血浆样本可溶性cd38水平结果比较。表1n.d.：未检出(notdetectable)。结果显示，depid能够有效检测出血浆中可溶性cd38的浓度，而商用elisa试剂盒并没有检测到信号，充分显示了depid法的特异性，特别适用于复杂样本的检测。上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。序列表<110>北京大学深圳研究生院<120>一种可溶性cd38浓度的检测方法<130><160>6<210>1<211>546<212>dna<213>人工序列<400>1atgaaatacctattgcctacggcagccgctggattgttattactcgcggcccagccggcc60atggccgatgtgcagctgcaggagtctggaggaggcttggtgcaggctgggggctctctg120agactctcctgtacaggctcaggacgcaccttcaggaactatcccatggcctggttccgc180caggctccaggaaaggagcgtgagtttgtagcaggtattacctgggtcggtgctagcaca240ctctatgcagacttcgcgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacg300gtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttatagttgtgcagca360ggtcgcggtatagtggctggtaggatcccagctgagtatgccgactggggccagggcacc420caggtcaccgtctcctcagaacccaagacaccaaaaccacaaccagcggccgcacatcat480catcaccatcacggggccgcagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggcc540gcatag546<210>2<211>181<212>prt<213>人工序列<400>2metlystyrleuleuprothralaalaala10glyleuleuleuleualaalaglnproala20metalaaspvalglnleuglnglusergly30glyglyleuvalglnalaglyglyserleu40argleusercysthrglyserglyargthr50pheargasntyrprometalatrpphearg60glnalaproglylysgluargglupheval70alaglyilethrtrpvalglyalaserthr80leutyralaaspphealalysglyargphe90thrileserargaspasnalalysasnthr100valtyrleuglnmetasnserleulyspro110gluaspthralavaltyrsercysalaala120glyargglyilevalalaglyargilepro130alaglutyralaasptrpglyglnglythr140glnvalthrvalsersergluprolysthr150prolysproglnproalaalaalahishis160hishishishisglyalaalagluglnlys170leuileserglugluaspleuasnglyala180ala181<210>3<211>558<212>dna<213>人工序列<400>3atgaaatacctattgcctacggcagccgctggattgttattactcgcggcccagccggcc60atggccgatgtgcagctgcaggagtcaggaggaggattggtgcaggctggacactctctg120agactctcctgtgtaggctccggtagcagattcgataactatgccatgggctggttccgc180caggctccagggaaggagcgtgaatttgtagccgctattagctggagtagtggcactacg240cgctatttagacaccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagagtacg300gtatatcttcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcagct360cgatatcagccgaggtactacgactcaggggatatggatggatatgagtatgacaactgg420ggtcaggggacccaggtcaccgtctcctcagaacccaagacaccaaaaccacaaccagcg480gccgcacatcatcatcaccatcacggggccgcagaacaaaaactcatctcagaagaggat540ctgaatggggccgcatag558<210>4<211>185<212>prt<213>人工序列<400>4metlystyrleuleuprothralaalaala10glyleuleuleuleualaalaglnproala20metalaaspvalglnleuglnglusergly30glyglyleuvalglnalaglyhisserleu40argleusercysvalglyserglyserarg50pheaspasntyralametglytrpphearg60glnalaproglylysgluargglupheval70alaalailesertrpserserglythrthr80argtyrleuaspthrvallysglyargphe90thrileserargaspasnalalysserthr100valtyrleuglnmetasnserleulyspro110gluaspthralavaltyrtyrcysalaala120argtyrglnproargtyrtyraspsergly130aspmetaspglytyrglutyraspasntrp140glyglnglythrglnvalthrvalserser150gluprolysthrprolysproglnproala160alaalahishishishishishisglyala170alagluglnlysleuileserglugluasp180leuasnglyalaala185<210>5<211>2085<212>dna<213>人工序列<400>5tccggtaccatggatgtgcagctgcaggagtctggaggaggcttggtgcaggctgggggc60tctctgagactctcctgtacaggctcaggacgcaccttcaggaactatcccatggcctgg120ttccgccaggctccaggaaaggagcgtgagtttgtagcaggtattacctgggtcggtgct180agcacactctatgcagacttcgcgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaag240aacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttatagttgt300gcagcaggtcgcggtatagtggctggtaggatcccagctgagtatgccgactggggccag360ggcacccaggtcaccgtctcctcagaacccaagacaccaaaaccacaaccagcggagctc420ccgggggcggccgcctgcagaatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgcca480ttctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatac540gccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttac600gctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaat660acaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttg720ggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaa780ttgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttg840caaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggat900tctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacct960cccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgca1020ctgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcataga1080actgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccg1140gatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactc1200ggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgttt1260ctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctcc1320ttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgct1380tctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctg1440ccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacaccc1500gagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggtt1560gtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgaga1620ggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgac1680aaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttc1740atcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaa1800ttggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttccc1860gacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatg1920acggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgc1980ggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaaga2040aaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagtga2085<210>6<211>694<212>prt<213>人工序列<400>6serglythrmetaspvalglnleuglnglu10serglyglyglyleuvalglnalaglygly20serleuargleusercysthrglysergly30argthrpheargasntyrprometalatrp40pheargglnalaproglylysgluargglu50phevalalaglyilethrtrpvalglyala60serthrleutyralaaspphealalysgly70argphethrileserargaspasnalalys80asnthrvaltyrleuglnmetasnserleu90lysprogluaspthralavaltyrsercys100alaalaglyargglyilevalalaglyarg110ileproalaglutyralaasptrpglygln120glythrglnvalthrvalserserglupro130lysthrprolysproglnproalagluleu140proglyalaalaalacysargmetgluasp150alalysasnilelyslysglyproalapro160phetyrproleugluaspglythralagly170gluglnleuhislysalametlysargtyr180alaleuvalproglythrilealaphethr190aspalahisilegluvalaspilethrtyr200alaglutyrpheglumetservalargleu210alaglualametlysargtyrglyleuasn220thrasnhisargilevalvalcysserglu230asnserleuglnphephemetprovalleu240glyalaleupheileglyvalalavalala250proalaasnaspiletyrasngluargglu260leuleuasnsermetglyileserglnpro270thrvalvalphevalserlyslysglyleu280glnlysileleuasnvalglnlyslysleu290proileileglnlysileileilemetasp300serlysthrasptyrglnglypheglnser310mettyrthrphevalthrserhisleupro320proglypheasnglutyraspphevalpro330gluserpheaspargasplysthrileala340leuilemetasnserserglyserthrgly350leuprolysglyvalalaleuprohisarg360thralacysvalargpheserhisalaarg370aspproilepheglyasnglnileilepro380aspthralaileleuservalvalprophe390hishisglypheglymetphethrthrleu400glytyrleuilecysglypheargvalval410leumettyrargphegluglugluleuphe420leuargserleuglnasptyrlysilegln430seralaleuleuvalprothrleupheser440phephealalysserthrleuileasplys450tyraspleuserasnleuhisgluileala460serglyglyalaproleuserlysgluval470glyglualavalalalysargphehisleu480proglyileargglnglytyrglyleuthr490gluthrthrseralaileleuilethrpro500gluglyaspasplysproglyalavalgly510lysvalvalprophepheglualalysval520valaspleuaspthrglylysthrleugly530valasnglnargglygluleucysvalarg540glyprometilemetserglytyrvalasn550asnproglualathrasnalaleuileasp560lysaspglytrpleuhisserglyaspile570alatyrtrpaspgluaspgluhisphephe580ilevalaspargleulysserleuilelys590tyrlysglytyrglnvalalaproalaglu600leugluserileleuleuglnhisproasn610ilepheaspalaglyvalalaglyleupro620aspaspaspalaglygluleuproalaala630valvalvalleugluhisglylysthrmet640thrglulysgluilevalasptyrvalala650serglnvalthrthralalyslysleuarg660glyglyvalvalphevalaspgluvalpro670lysglyleuthrglylysleuaspalaarg680lysilearggluileleuilelysalalys690lysglyglylys694当前第1页12当前第1页12