生物流体样本成像方法和生物流体样本成像设备与流程

本申请享有2012年12月6日提交的美国专利申请no.61/734,179和2013年10月28日提交的美国专利申请no.61/896,432所公开的本质主题的权益，并通过引用并入该本质主题。

本发明总体涉及用于对生物流体样本成像的方法，并且尤其涉及在多于一种分辨率下且在少于整体样本的一些情形下用于对生物流体样本成像的方法和设备。

背景技术：

历史上，诸如全血、尿液、脑脊髓液、体腔液等的生物流体样本已经通过在载玻片上涂抹少量未稀释的流体并且在手动显微镜下评估该涂片来评估其微粒或细胞成分。使用这些技术能够得到合理的结果，但是它们非常依靠技术员的经验和技巧。这些技巧同样是劳动密集型，因而对于商业实验室应用在实践上不可行。

用于分析生物流体样本的自动化设备是已知的，该自动化设备包括适于对腔室内静止地存在的生物流体的样本成像的一些设备。自动分析装置可以在大体上减少的时间段内产生与人工检测方法同样精确的结果。尽管如此，自动化装置操作的速度能够被高分辨率成像显著地限制。高分辨率成像产生大量的电子数据，这些电子数据必须经由设备处理。因此需要提供减少始终如一地提供精确的结果所需时间的自动化装置和方法。

技术实现要素：

用于根据本发明的一方面，提供一种用于分析生物流体样本的方法。所述方法包括以下步骤：a)提供用于保持所述生物流体样本的腔室，该腔室在空间上映射为将所述腔室划分为多个子区域；b)当将样本设置在所述腔室内设置时，提供所述样本内的一种或多种成分的预定可重复的非均匀空间分布，其中，所述分布指示在所述腔室的每一个子区域中的所述样本内的统计上显著数量的至少一种成分的存在或不存在；c)将所述生物流体样本设置在所述腔室内；d)基于由所述分布所指示的在所述子区域中的统计上显著数量的一种或多种成分的存在或不存在，针对每个子区域选择一种或多种成像技术；e)使用为所述子区域所选择的所述一种或多种成像技术创建表示在每一个子区域中的所述生物流体样本的图像数据；以及f)使用表示在每一个子区域中的所述生物流体样本的所述图像数据分析所述样本。

根据本发明的另一个方面，提供一种用于对生物流体样本成像的设备。所述设备包括腔室、样本照明器、至少一个析像管、以及处理器。所述腔室可操作以保持所述生物流体样本。所述腔室在空间上映射为将所述腔室划分为多个子区域。所述析像管可操作以产生表示在腔室内所存在的样本的图像信号。所述处理器适于包括设置在所述腔室内设置的所述样本内的一种或多种成分的预定可重复的非均匀空间分布。所述分布指示在所述腔室的每一个子区域中的所述样本内的统计上显著数量的至少一种成分的存在或不存在。基于由所述分布所指示的在所述子区域中的统计上显著数量的一种或多种成分的存在或不存在，所述处理器还适于针对每个腔室子区域选择一种或多种成像技术。使用为每一个所述选择的腔室子区域所选择的所述一种或多种成像技术，所述处理器还适于与所述样本照明器和所述析像管通信，以创建表示在所述选择的腔室子区域中的所述生物流体样本的图像数据。

鉴于以下所提供的本发明的详细说明以及如附图中所示出的，本方法和与之相关的优点将变得明显。

附图说明

图1是生物流体样本分析盒的透视图。

图2是图1所示的生物流体样本分析盒的分解透视图。

图3是保持分析腔室的托盘的平面图。

图4是分析腔室的截面图。

图5是分析装置的示意图。

图6是映射的分析腔室的示意性视图。

图7是映射的分析腔室的示意性视图，包括设置在样本腔室内的样本成分的可重复的预定分布。

图8是映射的分析腔室的示意性视图，示出了在映射的腔室中捕获的图块(tile)图像的数量的示例。

具体实施方式

参考图1和图5，本发明包括用于通过分析装置12自动分析生物流体样本(例如全血)的方法和设备。存放在腔室10中或设置在腔室10上的样本被成像，并且使用分析装置12来分析样本的图像。

可以用在本发明中的腔室10的示例显示在图1至图4中。腔室10由第一平面构件14、第二平面构件16形成，并且通常具有设置在平面构件14与平面构件16之间的至少三个分隔件18。平面构件14、平面构件16中的至少一者是透明的。腔室10的高度20通常使得在腔室10中存在的样本将借助毛细力在腔室10中横向地移动。图4显示了腔室10的横截面，包括腔室10的高度18(例如z轴)。图3显示了腔室10的俯视平面图，示出了腔室10的区域(例如x-y平面)。腔室10的侧向边界可以例如由在平面构件14、平面构件16的内表面24、内表面26之间延伸的胶线22限定，或者由平面构件表面上设置的吸水性材料的线限定，该吸水性材料的线抑制横向移动跨越那儿。通过接合在平面构件14、平面构件16之间形成的入口21，样本可以沿腔室的边缘(即，“填充边缘23”)用样本的丸件来引入到样本中。在与填充边缘23接触后，样本通过毛细力吸入到腔室入口中。

本发明不限于使用任何特别的腔室的实施方式。可接受的腔室的示例描述在美国专利no.7,850,916和序列号为12/971,860、13/341,618和13,594,439的美国专利申请中，其每一者整体通过引用而合并于此。出于本公开的目的，本发明将描述为使用序列号为13/594,439的美国专利申请中所描述的分析腔室。在“439”申请中公开的分析腔室10安装在托盘28上，该托盘28可以从盒30上拆卸。图1显示了组装形式的盒30。图2显示了盒30的分解视图，其包括分析腔室10和托盘28。图3是安装在托盘28上的分析腔室10的俯视图，描绘了存在于腔室10中的样本。图4是腔室10的示意性截面图。分析腔室10的通常尺寸为保持有大约0.2μl至1.0μl的样本，但是腔室10不限于任何特别的体积容量，并且容量可以改变以适合分析应用。

然而，如上所指出的，本发明不限于使用前述的腔室。另一种“腔室”型结构的示例是样本可以涂抹在其上的载玻片。为了便于以下说明，可操作以保持样本和/或样本可以存放其上的所有这些结构在以下文中将通常称为“腔室”并且除非特别指出，不旨在限于任何该结构的物理特性。

腔室10可操作以静止地保持有液体样本。所使用的术语“静止地(quiescent)”用于描述样本存放在腔室10中以用于分析，并且该样本在分析中不有目的地移动。在该运动存在于血液样本中的程度上，由于血液样本中的组成成分的布朗运动(该运动未使得本发明不起作用)，该运动将很显著。样本涂片可以固定在载玻片上，此后样本没有明显的运动。

参考图5，所示的自动分析装置12控制、处理、成像和分析设置在盒10中的样本。美国专利no.6,866,823和美国专利申请no.13/077,476和no.13/204,415(因而其每一者整体通过引用合并于此)公开了分析装置10的示例，其具有光学器件和用于控制、处理和分析样本的图像的处理器，如在下文中将描述的，这些装置可以根据本发明而修改。除了分析装置可操作以执行本发明的一种或多种方法的程度之外，本发明不限于任何特别的装置。以下描述的分析装置12示出了可以使用的装置的示例。

分析装置12包括包含至少一个物镜32的光学器件、盒定位器34、一个或多个样本照明器36、析像管38和可编程分析仪40。定位器34适于选择性地改变物镜32和分析腔室10的相对位置。光学器件(例如，物镜)和分析腔室10中的一者或两者可以相对于另一者沿所有相关的轴(例如x、y和z)移动。腔室10在x-y平面中的相对运动允许光学器件捕获在腔室10中存在的全领域样本。腔室10沿z轴的相对运动允许光学器件相对于样本的高度在焦点位置中的改变。光学器件可以包括硬件，该硬件使分析装置12捕获存在于腔室10中的样本的一个或多个低分辨率图像以及存在于腔室10中的样本的一个或多个高分辨率图像。能够采用样本的低分辨率图像和高分辨率图像的可接受的光学硬件包括具有多个物镜(例如，高分辨率物镜和低分辨率物镜)的实施方式和其中单个物镜与能够选择性地移动到光学路径中且可操作以改变装置的分辨率的一个或多个透镜一起使用的实施方式。然而，本分析装置12不限于该示例性的光学硬件。

样本照明器36利用预定波长的光照亮样本。例如，样本照明器36可以包括落射荧光光源(epi-fluorescencelightsource)和透视光源。透视光源可操作以产生波长与红光、绿光和蓝光中的一种或多种相关的光。通常产生的红光在约600nm-700nm的范围内，优选约660nm的红光。通常产生绿光在约515nm-570nm的范围内，优选约540nm的绿光。通常产生的蓝光在约405nm-425nm的范围内，优选约413nm的蓝光。使用析像管捕获传输穿过样本的光或来自样本的荧光，并且表示所捕获的光的信号发送至可编程分析仪，在该可编程分析仪中，所述信号被处理成图像。图像以允许基于每基准单元确定图像中捕获的透光率或荧光强度的方式产生，例如“每基准单元”是样本的图像可以被切割成的增强单元，如像素。

可接受的析像管38的示例是电荷耦合装置(chargecoupledevice，ccd)型图像传感器，该图像传感器将经过(或来自)样本的光转化为电子数据格式的图像。互补金属氧化物半导体(complementarymetaloxidesemiconductor，“cmos”)型图像传感器是可以使用的图像传感器的另一示例。来自析像管38的信号提供图像的每一个像素的信息，该信息包括或者可以得出包括强度、波长和光密度。强度值被分配例如0单位至4095单位(“ivu”)中的任意数值范围。光密度(“opticaldensity,od”)是所吸收的光量相对于通过介质所传输的光量的度量，例如，“od”值越大，在传输中所吸收的光量越大。od可以以光密度单位(“opticaldensityunit，odu”)或其分数定量描述，例如milliodu是odu的1/1000。一个“odu”使光强度减少90％。作为量值的“odu”或“milliodu”可以用于通过透视光来获取或得出的图像。

可编程分析仪40包括中央处理单元(cpu)，且与盒定位器34、样品照明器36和析像管38进行通信。可编程分析仪40适于(例如，程序化的)发送和接收来自盒定位器34、样品照明器36和析像管38中的一者或多者的信号。例如，该分析仪40适于：1)发送和接收来自盒定位器34的信号以相对于光学器件、照明器和析像管中的一个或多个而定位盒30和腔室10；2)将信号发送给样品照明器36以产生规定波长(或可替选地多个波长)的光；和3)发送和接收来自析像管38的信号以捕获规定的时间段的光。应当注意，使用硬件、软件、固件或其组合可实现可编程分析仪的功能。本领域技术人员将能够对处理单元编程以执行本文所描述的功能，而不需过多的实验。

现在参考图6至图8，生物流体样本的自动图像分析可以包括使用各种成像技术，每种技术设计成将允许识别和分析样本中的具体成分的图像数据收集起来。使用全血样本作为示例，自动分析装置将优选可操作以产生与样本中的每一成分相关的信息，例如，红细胞指数(rbcindices)、白细胞计数(wbccount)、白细胞分类(wbcdifferential)、血小板计数(plateletenumeration)、网织红细胞计数(reticulocyteenumeration)等。为了获取所需的图像信息，分析装置可以使用数种不同的成像技术来对样本成像，例如在多种不同波长的光(例如，使用处在不同波长的落射荧光光源和/或透视光源)对样本成像；在不同的分辨率下对样本成像；在不同的焦点位置成像等。

下面的专利和专利申请描述了可操作以使用不同的成像技术获取数据的分析装置，该数据允许具体识别和分析样本中的成分：题目为“methodandapparatusforautomatedwholebloodsampleanalysesfrommicroscopyimages”的序列号为13/204,415的美国专利申请(其整体通过引用合并于此)公开了用于对全血样本执行wbc分类的方法，该方法包括使用落射荧光光源和透视光源在多种不同的波长下对血液样本成像；题目为“methodandapparatusfordeterminingatleastonehemoglobinrelatedparameterofawholebloodsample”的专利号为8,472,693的美国专利(其整体通过引用合并于此)公开了用于使用透视光源确定rbc指数以及它们的数目统计的方法，所述rbc指数包括红细胞的细胞体积(cellvolume，cv)、平均细胞体积(meancellvolume，mcv)、细胞血红蛋白浓度(cellhemoglobinconcentration，chc)、平均细胞血红蛋白浓度(meancellhemoglobinconcentration，mchc)以及平均细胞血红蛋白含量(meancellhemoglobincontent，mch)；题目为“methodandapparatusforautomatedplateletidentificationwithinawholebloodsamplefrommicroscopyimages”的序列号为13/730,095的美国专利申请(其整体通过引用合并于此)公开了使用落射荧光光源用于识别和枚举样本中的血小板的方法；以及题目为“methodforrapidimagingofbiologicfluidsamples”的序列号为13/729,887的美国专利申请(其整体通过引用合并于此)公开了用于在高图像分辨率和低图像分辨率下分析样本的方法，这些分辨率可以便于数据的获取。

对于自动分析装置12，需要在最少量的时间内产生所需的信息。还需要使用最少量的图像数据产生所需的信息，从而减少装置的图像数据处理以及存储需求。

至少由于这些原因，本发明的各方面协调了那些成像技术的性能，所述成像技术用于通过样本中成分的位置来识别和/或分析样本中的具体成分。换言之，用于识别和/或分析样本中的成分的成像技术只在具体成分可能存在(例如，成分的统计上的显著数目可能存在)的样本区域中实施，而在具体成分不可能存在的样本区域中不实施。这种成像技术的选择性的实施可以在执行多种类型的样本分析的情形下使用或在当执行仅一个或多个选择的分析类型时的情形下使用。分析装置12适用以执行以下所述的成像技术。

根据本发明的各方面，样本腔室10映射为提供样本腔室中可定位的子区域。映射在下文中描述为具有图块的正交图(例如，x和y正交)。此处使用的术语“图块”是指由图的行和列所限定的子区域。图块不限于特别的几何形状和尺寸，并且不要求具有四个相等的长边。腔室映射不限于正交的映射。图块可以表示各个图像领域，并且集合的图像领域可以捕获存在于腔室10中的所有或大体上所有样本。图块可以集合地组装以形成存在于腔室10中的所有或大体上所有的样本的单个图像。

图6示意性地示出了应用于分析腔室10的正交映射50，所述分析腔室10包括编号为t1至t86的图块。图块t1和图块t2是与腔室分开的参考图块，并且用来产生胶线22/空中界面(airinterface)的参考图像。图块t83至图块t86与位于腔室的填充边缘23处的腔室区域对齐，腔室入口21存在于腔室的填充边缘23处。在图6所示的腔室的实施方式中，图块t83与主要填充有胶线22的腔室区域对齐，并且图块t86与局部填充有胶线22的腔室对齐。因此，腔室入口21设置在图块t83和图块t86之间且与图块t84、图块t85、和图块t86的一部分对齐。图块t3、图块t18、图块t19、图块t34、图块t35、图块t50、图块t51、图块t66、图块t67和图块t82与腔室10的右侧边缘52对齐，并且与每个图块对齐的腔室区域至少局部地填充有形成分析腔室10的右侧边界的胶线。图块t10、图块t11、图块t26、图块t27、图块t42、图块t43、图块t58、图块t59、图块t74和图块t75与腔室10的左侧边缘54对齐，并且与每个图块对齐的腔室区域至少局部地填充有形成分析腔室10的左侧边界的胶线22。图块t3至图块t10沿腔室10的与腔室10的填充边缘相对的边缘56设置。

在一些应用中，存在于分析腔室10内的样本中的成分将假定在分析腔室内的可重复的非均匀分布。使用的术语“可重复的非均匀分布”意味着当相同类型的样本(例如，未稀释的全血)设置在特别类型的分析腔室(例如，以上描述为由平面构件限定的腔室；或载玻片)内时，样本中的某些成分以非均匀分布的方式可重复地占有腔室内的特别区域；即，不是由样本占有的每一个腔室区域都具有与其他腔室区域相同的类型和/或相同数量的成分。下面图8提供了在分析腔室中可重复的非均分布的全血的示例。因此，统计上显著数目(例如，足以执行分析的数量)的某些成分将可重复地存在于分析腔室的某些区域中，而不是在其他区域中。可重复的非均匀分布的预定代表性版本可以例如是通过评估设置在相同腔室内的相同类型的有意义数目的样本来确定。已经确定的是，在这些情形下，样本中的成分将可重复地占有腔室内的某些区域。因此，预定分布可以在经验上基于有意义数量的填充腔室内的成分的统计位置。在这些应用中，已知在样本中统计上显著数量的成分的位置，并且为了寻找样本腔室的图像中的前述成分的位置，不需要执行成像步骤即可获取。

例如，使用以上所描述的腔室10作为示例，全血样本可以通过毛细力沿填充边缘23吸入到腔室入口21中。随着样本被吸入到腔室10中，样本朝向腔室10的相对的端部56移动，并且朝向形成腔室10的侧边界的胶线22侧向向外移动。当全血样本在腔室10内分布时，成分(例如，wbc、rbc、血小板、血浆)以可重复的非均匀形式分布。尤其在前述的非均匀分布中，样本中统计上显著数量的wbc将移动有限的距离进入到腔室10内并且将填入(populate)接近于腔室入口21的腔室区域58。在图7中，将可重复地包含有样本中统计上显著数量的wbc的腔室区域58与图块t53至图块t56、图块t60至图块t64、图块t69至图块t72和图块t78至图块t79以及图块t68、图块t65、图块t52、图块t48至图块t45、图块t57和图块t73的一部分对齐。

样本中的统计上显著部分的rbc也将移动有限的距离进入到腔室10中，但是比wbc移动得更远距离而进入到腔室10内。因而rbc将填入腔室区域60，该腔室区域60邻接于腔室入口21但是比由统计上显著数量的wbc所填入的腔室58更远离腔室入口21。在图7中，将可重复地包含有样本中的统计上显著数量的rbc的腔室区域60与图块t22、图块t23、图块t27至图块t33、图块t42至图块t36、图块t43、图块t58和图块t49以及图块t65、图块t52、图块t59、图块t25、图块t24、图块t21和图块t20的一部分对齐。移动距离的不同至少部分地归结于分析腔室的高度(例如，在形成腔室10的平面构件14、平面构件16的内表面之间的4微米间隔)以及wbc对rbc的相对尺寸。wbc在尺寸上大体上平均大于rbc，并且它们在腔室中的移动由此可以由与平面构件14、平面构件16的内表面摩擦接触所阻碍。处于正常状态的rbc通常将不与平面构件14、平面构件16的内表面都接触。血浆和血小板通过毛细力分布遍及腔室。

尤其指向血浆的分析可以在腔室区域中执行，统计上显著部分的rbc位于该腔室区域外，该区域相对没有wbc和rbc并且因此由血浆支配。在图7中，将由样本中的血浆可重复地支配的腔室区域显示为区域62，该区域与图块t13至图块16、图块t19至图块t21和图块t25至图块t27的一部分对齐。注意到，出于说明目的，区域62在此随意显示，并且由血浆所支配的区域也可以在任何地方找到。由于他们大体上相对较小的尺寸，血小板可以遍及腔室成像。

以上所描述的包含样本中的某些成分的腔室区域且尤其是图块的可重复的对齐提供为非限制性示例，并且可以使用可替选的的图块/成分对齐；例如前述的对齐可以受到腔室的高度和/或引入到腔室内的样本的体积影响。

样本中成分的可重复的非均匀分布也可以至少部分地归结于设置在腔室内的试剂。例如，在一些全血样本的分析中，需要使样本中的rbc的至少一部分承受等体积球状试剂(isovolumetricspheringagent)；例如，参见通过以上引用合并的专利号为8,472,693的美国专利。在一些应用中，等体积球状试剂可以在样本进入到腔室中之前以并非所有的rbc都将承受球状试剂的方式设置在腔室内。因此，如图7所述，包含统计上显著数量的rbc的腔室区域60的前缘(即，离腔室入口最远的区域的边缘——描绘为区域60a)将包含有大量数量的球形rbc，并且包含统计上显著数量的rbc的区域60的其余部分将不包含大量数量的球形rbc。球形rbc特别有益于某些类型的rbc分析。

如上所指出的，以上所述的样本成分的可重复的非均匀分布提供为在具体腔室实施方式内分布的非限制示例。在替选实施方式(例如，在载玻片上的涂抹)中，非均匀分布可以假定完全不同的配置。不管特定的可重复的非均匀分布如何，根据本发明的多个方面，映射可以应用于允许协调那些成像技术的性能的腔室，所述成像技术用于通过样本中统计上显著数量的特别成分的位置来识别和/或分析样本中的具体成分。换言之，用于识别和/或分析样本中的成分的成像技术只在具体成分可能存在(例如，统计上显著数目的成分可能存在，和/或顺利成像)的样本区域中实现，而在具体成分不可能存在(或不能顺利地成像)的样本区域中不能实现。

使用确定的、可以重复的非均匀分布，样本中特别成分的各个图像分析可以依据时间和数据量以有效的方式执行。例如，如果分析装置被命令执行wbc分析，则只有与包括统计上显著数目的wbc的样本区域对齐的那些映射图块使用所需要的成像技术成像，以执行所需要的分析。类似地，如果分析装置被命令执行rbc分析，则只有与包括统计上显著数目的rbc的样本区域对齐的那些映射图块使用所需要的成像技术成像，以执行所需要的分析。如上所指出的，某些rbc分析最好在球形rbc上执行。在这些情形下，只有与包括统计上显著数目的rbc的样本区域对齐的那些映射图块使用所需要的成像技术成像，以执行所需要的分析。相同的方法可以用于血浆分析等。

图8显示了对带有数值(例如，n至n+7，其中“n”是整数)的样本腔室的示意图，所述数值表示全血样本的多种分析所需的图像的数量；例如，wbc分析、血小板分析、rbc分析、血浆分析等。在图中，用于所有分析而必须捕获的图像的数量根据图块的位置以及与将在那个位置成像的样本的对齐区域而变化。在映射中，位于中央而且位于更接近腔室入口的一组图块指示总数为“n+7”图像被捕获用于那些图块的每一个。该数量的图像表示每一图块用于分析wbc所需的全部数量的图像，这些图块(样本中成分的每次可重复的非均匀分布)与样本中统计上足够数量的wbc对齐。为了进一步示出，在映射中，位于中央而且位于更远离腔室入口的一组图块指示总数为“n+3”图像被捕获用于那些图块的每一个。该数量的图像表示每个图块用于分析球形的rbc所需的全部数量的图像，这些图块(样本中成分的每次可重复的非均匀分布)与样本中统计上足够数量的球形rbc对齐。应当注意的是，用于任何特别成分的成像区域(即，图块)常常增加为超出样本中成分的已知的可重复的非均匀分布指示的区域，以确保收集了足够的数据。所增加的图块数量也导致统计变化以及腔室的体积填充中的变化。

从示意图可以看出用于所示八十(80)个图块的图像的全部数量等于“n”的八十倍(80*n)加上额外的一百八十(180)个图像。如果“n+7”个图像捕获所有八十个图块，则结果将等于80*n个图像加上额外的五百六十(560)个图像，这表示三百八十(380)个不同图像，这些图像中的每一者显著地增加了全部的分析时间和图像存储以及处理要求。

尽管本发明描述为参考示例性的实施方式，但是本领域技术人员可以理解的是在不背离本发明的范围的情况下可以做出不同改变以及对于其构件可以替换为等价物。另外，不背离本发明的范围的情况下对于本发明的技术可以做出许多变型方式，以适用特别的情况或材料。因此，这意指本发明不限于此处描述为用于实现本发明的最好模式的特别的实施方式。