本发明属于化学检测技术领域，具体涉及一种利用hplc测定蓝花丹中白花丹素含量的方法。
背景技术：
蓝花丹(plumbagoauriculata)是一种常绿柔弱半灌木，其花冠呈淡蓝色至蓝白色，穗状花序约含18～30枚花，花期多为6～9月。原产于南非南部，现在我国华南、华东、西南和北京常有栽培，已广泛为各国引种作为观赏植物。其根部大量积累的次生代谢产物白花丹素(plumbagin)，即5-羟基-2-甲基-1,4-萘醌，分子式c11h8o3，分子量188.18，在多种动物模型试验中发现其具有抗菌、抗疟疾、抗炎、抗癌、免疫抑制、神经保护以及抗动脉粥样硬化等多种功效。
关于白花丹素含量的测定，目前多集中于白花丹中。根据文献资料显示，白花丹(plumbagozeylanica)原产于中国，其花冠大多呈白色，穗状花序通常含25～70枚花，花期为10月至翌年3月，其已作为药材进行家种栽培。对于白花丹的研究历史和研究深度较蓝花丹而言更为丰富、全面，目前白花丹科植物中白花丹素的测定也主要集中在白花丹上，而蓝花丹无论是在生理生化、成分组成还是分子生物学等方面的研究都尚处于初级阶段，关于其白花丹素的测定更是尚未见报道。由于白花丹和蓝花丹在植物性状上的表现有明显区别，其中各物质含量和组成成分可能会有较大不同，对于蓝花丹中白花丹素含量的检测可能会受到不同物质含量和组成成分的差异而表现出不同的测定结果。因此，目前仅对于白花丹中白花丹素的提取方法及含量检测上进行了充分的研究，但是对于如何有效提取出蓝花丹中白花丹素及进行含量的精密测定尚处于探索之中，没有相关文献可以参考。
另一方面，虽然对于白花丹中白花丹素的测定方法已有多种，包括hplc、rhplc、tlc等，但前人描述的过程较为复杂，大多需要长时间的抽提过程，即抽提处理过程需要数小时。hplc即高效液相色谱法，是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。在前人对白花丹中白花丹素进行hplc测定时，样品需要长时间的提取处理过程。在此基础上，能否提供一种针对于蓝花丹中白花丹素含量的测定方法，而且具备操作更简便、检测结果准确而真实可靠的hplc测定方法，成为蓝花丹栽培及质量控制方面极为重要的一个问题。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种利用hplc测定蓝花丹中白花丹素含量的方法。本发明提供的方法具有较高的回收率、稳定性、精密度，且重复性良好，结果可靠。采用该方法可以对蓝花丹中白花丹素进行简单快速的测定，结果准确可靠，对于控制蓝花丹的质量具有重要意义。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种利用hplc测定蓝花丹中白花丹素含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)标准品储备液的制备：
称取标准品白花丹素5.1mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得到标准品储备液a(0.51mg/ml)；吸取标准品储备液a2.0ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得到标准品储备液b(0.102mg/ml)；吸取标准品储备液b1.0ml，置于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得到标准品储备液c(0.00408mg/ml)；
(2)标准曲线的绘制：
取步骤(1)所得标准品储备液a1μl、5μl、15μl、20μl、40μl，标准品储备液b1μl、5μl、10μl，标准品储备液c1μl、5μl、15μl，分别注入高效液相色谱仪中进行含量检测，以进样量为横坐标，测得的峰面积为纵坐标，用峰面积的平均值建立校准曲线的相关系数，绘制标准曲线，得到白花丹素的线性回归方程；
(3)样品液的制备及样品液中白花丹素含量测定：
取经干燥粉碎后的蓝花丹组织样品粉末0.5g，用25ml甲醇溶解，超声波处理30min，过0.22μm滤头后注入高效液相色谱仪中进行含量测定；进样的色谱条件如下：流动相：a液为0.1％(v:v)的h3po4-水溶液，b液为甲醇；梯度洗脱程序：0min、0:40(va:vb)；21min、25:75(va:vb)；23min、10:90(va:vb)；30min、10:90(va:vb)。
进一步的是，步骤(3)中进行高效液相色谱测定时，所述进样的流速为1ml/min，进样量为20μl。
进一步的是，所述含量测定的波长为254nm，检测时间为21min，检测的注温为40℃。
进一步的是，所述高效液相色谱仪采用的色谱柱为：agilenttechnologies1260infinityii液相色谱，色谱柱规格为：4.6×250mm，5μm，检测灵敏度为0.16aufs。
进一步的是，所述流动相使用前先过0.22μm滤膜进行真空过滤。
进一步的是，所述蓝花丹组织样品包括来源于组培的无菌材料和实生材料所得的蓝花丹根、茎、叶及全株植株。
进一步的是，所述组培的无菌材料从组培瓶中取出后，轻轻冲洗掉培养基，放在滤纸上吸干多余水分，按照根、茎、叶及全株进行分装标记。
进一步的是，所述的实生材料从土里整株拔出，用流水彻底清洗掉根部泥土、污垢及杂质，去掉枯枝败叶，放在滤纸上吸干多余水分，按照根、茎、叶及全株进行分装标记。
进一步的是，将分装好的植物组织材料在阴凉环境下干燥，然后置于65℃恒温烘箱中烘24～48h至恒重，记录其干重，然后用粉碎机粉碎。
进一步的是，步骤(1)中所述甲醇的纯度均为ar级，步骤(3)中所述甲醇的纯度均为hplc级。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种可对蓝花丹中白花丹素含量进行快速测定的方法，采用本发明的测定方法，处理和检测的效率高，样品无需经过长时间的抽提处理。该方法具有较高的回收率、稳定性、精密度，且重复性良好，结果可靠。本发明的方法简单精确、结果准确可靠，对于控制蓝花丹的质量具有重要意义。
附图说明
图1为白花丹素标准品储备液的hplc色谱图；
图2为标准品储备液a的白花丹素标准曲线i；
图3为标准品储备液b和c的白花丹素标准曲线ii；
图4为标准品储备液a、b和c白花丹素标准曲线iii；
图5为一年生蓝花丹根粉末样品液的hplc色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明提供的一种hplc测定蓝花丹植株体内白花丹素含量的方法，该方法具体如下：
1)样品采集、烘样及粉碎
组培材料：用镊子从组培瓶中取出材料，轻轻冲洗掉培养基，放在滤纸上吸干多余水分，然后分根、茎、叶、全株分别装在a4大小的牛皮袋中，并做好标记。
实生材料：从土里整株拔出，用流水彻底清洗掉根部泥土、污垢及整株杂质，去除枯枝败叶，放在滤纸上吸干多余水分，然后分部位装在a4大小的牛皮袋中，并做好标记。
将上述分装好的材料在阴凉环境下干燥，然后置于50℃恒温烘箱中烘24～48h至恒重，记录其干重，然后利用粉碎机将样品粉碎。
2)制备标准品储备液及绘制标准曲线
称取标准品白花丹素5.1mg，置于10ml容量瓶中，加适量甲醇溶解并定容，摇匀而得标准品储备液a(0.51mg/ml)。随后，吸取标准品储备液a2.0ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得标准品储备液b(0.102mg/ml)。最后吸取标准品储备液b1.0ml，置于25ml容量瓶中，加适量甲醇(均为ar级)溶解并定容，摇匀，即得标准品储备液c(0.00408mg·ml–1)。将标准品储备液a1μl、5μl、15μl、20μl、40μl，标准品储备液b1μl、5μl、10μl，标准品储备液c1μl、5μl、15μl分别注入高效液相色谱仪中，以进样量为横坐标，测得的峰面积为纵坐标，用峰面积的平均值建立校准曲线的相关系数，绘制标准曲线，得白花丹素的线性回归方程y＝4037x+15.384(r2＝0.9995)。
3)制备样品溶液
取干燥样品粉末于甲醇(hplc级)润洗后的三角瓶中，再用甲醇(hplc级)润洗后的移液管吸取25ml甲醇(hplc级)加入三角瓶中，称取三角瓶的总重量，后用保鲜膜裹好超声波处理30min。
4)实际操作
称取样品粉末0.5g，用25ml甲醇(hplc级)溶解后用保鲜膜封好，超声波30min，过0.22μm滤头后注入1.5mlaligent瓶。
所述的色谱条件如下：
色谱柱：agilenttechnologies1260infinityii液相色谱系统；
色谱柱规格：4.6×250mm，5μm；
流动相：a液为0.1％的h3po4-水溶液(v:v)，b液为甲醇；
梯度洗脱程序：0min、0:40(va:vb)；21min、25:75(va:vb)；23min、10:90(va:vb)；30min、10:90(va:vb)，使用前流动相过0.22μm滤膜进行真空过滤；
流速：1ml/min；
波长：254nm；
柱温：40℃；
检测时间：21min；
灵敏度：0.16aufs；
进样量：20μl。
测试例
(一)仪器精密度试验
此试验取白花丹素标准品储备液a连续进样6次，每次进样量为20μl，考察所用试验仪器的精密度，其结果如表1所示。从表中可以看出，供试标准品储备液峰面积的相对标准偏差(rsd)值为0.8，表明该试验仪器精密度良好。
表1仪器精密度试验结果统计
(二)线性回归试验
因所测样品数量较多且白花丹素含量差别较大，因此本试验绘制了白花丹素高浓度和低浓度两条标准曲线。精密吸取白花丹素标准品储备液a，按照1μl、5μl、15μl、20μl、40μl分别进样，得到的标准品白花丹素的hplc色谱图如图1所示，峰面积测定值如表2所示。以标准品白花丹素浓度(mg/ml)为横坐标，测得峰面积(mau*s)为纵坐标绘制标准曲线图(图2)，进行线性回归考察进样浓度与峰面积之间的线性关系，得白花丹素线性回归方程i：y＝4003.1x+62.36(r2＝0.9995)。结果表明，白花丹素浓度在0.051～2.04mg/ml范围内线性关系良好。
表2白花丹素标准品储备液a峰面积测定结果统计
同样，精密吸取白花丹素标准品储备液b(1μl、5μl、10μl)、标准品储备液c(1μl、5μl、15μl)分别进样，峰面积测定值如表3所示。以标准品白花丹素浓度为横坐标，测得峰面积为纵坐标绘制标准曲线图(图3)，进行线性回归考察进样浓度与峰面积之间的线性关系，得白花丹素线性回归方程ii：y＝3529.6x+0.397(r2＝0.9999)。结果表明，白花丹素浓度在4.08×10-3～0.102mg/ml范围内线性关系良好。
表3白花丹素标准品储备液b、c峰面积测定结果统计
白花丹素标准品储备液a(1μl、5μl、15μl、20μl、40μl)、标准品储备液b(1μl、5μl、10μl)、标准品储备液c(1μl、5μl、15μl)分别进样，所得峰面积测定值如表4所示。以标准品白花丹素浓度为横坐标，测得峰面积为纵坐标绘制标准曲线图(图4)，进行线性回归考察进样浓度与峰面积之间的线性关系，得白花丹素线性总回归方程iii：y＝4044.7x+4.9262(r2＝0.9995)。结果表明，白花丹素浓度在4.08×10-3～2.04mg/ml范围内线性关系良好。
表4白花丹素标准品储备液a、b、c峰面积测定结果统计
(三)稳定性试验
取白花丹素标准品储备液a每2h进样一次(时间间隔为0、2、4、6、8、10、12h)，共进样7次，每次进样量为20μl，记录峰面积值，考察本试验条件的稳定性，其结果如表5所示。结果表明，相对标准偏差(rsd)为4.3，说明样品液在12h内稳定性良好，试验数据精确，结果可靠。
表5试验稳定性结果统计表
(四)重复性试验
取1年生蓝花丹根粉末6份，各0.5g，精密称定，制备样品液，进样，记录峰面积值。考察本试验方法的重复性。蓝花丹样品液色谱图如图5所示，峰面积测定结果如表6所示。试验结果表明，相对标准偏差(rsd)为0.79％，说明本试验的重复性较好。
表6标准品白花丹素峰面积测定结果统计
(五)加样回收试验
取1年生蓝花丹全株粉末9份，各0.5g，精密称定，每三份为一组，每组精密加入标准品，制备样品液，进样分析，计算回收率，考察本试验方法的回收性。回收率试验结果如表7所示，试验结果表明，低、中、高三种浓度水平的加样回收率平均值分别为91.14％、98.71％、99.38％，相对标准偏差(rsd)分别为0.48％、1.97％、1.93％，rsd较小，表明采用此方法测定白花丹素含量结果可靠。
表7蓝花丹样品液回收率试验结果统计
综上所述，本发明建立的hplc法的分析条件为：agilenttechnologies1260infinityii液相色谱系统c18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相0.1％h3po4-甲醇，梯度洗脱0min、0:40；21min、25:75；23min、10:90；30min、10:90，流速1ml/min，检测波长254nm，柱温40℃，灵敏度0.16aufs。该色谱条件下白花丹素峰形良好，保留时间约21min。该方法的平均加标回收率高，相对标准偏差(rsd)小。该方法具有较高的回收率、稳定性、精密度，且重复性良好，结果可靠。采用该方法可以对蓝花丹中白花丹素进行准确的测定。
实验例1
按上述含量测定方法，测定了蓝花丹20个样品的白花丹素含量，结果见表8。
表8样品测定结果
从上述结果可以看出，本发明提供的方法简单精确、结果准确可靠，对于控制蓝花丹的质量具有重要意义。
对比例1
对照实验例1的样品及测定方法，在进行样品液的制备中，在用25ml甲醇溶解样品粉末后，超声波处理10min，然后回流1h，再进行高效液相色谱检测，其检测结果明显下降，检测结果如下表9。
表9样品测定结果
从上述结果可以看出，在缩短超声提取时间的前提下，即使再采用回流提取的方法，对于蓝花丹中白花丹素的检测结果影响也较大，无法获得准确的测定结果。