本发明涉及一种测定方法，尤其涉及一种同时测定食品中花椒麻素和辣椒素的方法。
背景技术：
：随着社会的发展，麻辣食品越来越受人们的喜爱，尤其是湖南、四川等地，麻辣面筋食品的销量也逐年增加，在麻辣面筋食品生产中，必不可少的调料就是辣椒和花椒或其制品。在工业生产中，在选取原料之前，会分别对辣椒和花椒或其制品中的辣椒素和花椒麻素进行测定，但是在后期经过混料以后，辣椒粉与花椒粉或者花椒油混合撒到面筋表面，现有的测定方法无法同时测定辣椒素和花椒麻素的含量，采用现有的测定方法，无法使花椒麻素和辣椒素分离，因此，导致现有的工业生产中，只能实现对面筋食品前端的品质监控，无法实现对面筋食品终端产品的监控。技术实现要素：本发明的目的是提供一种同时测定食品中花椒麻素和辣椒素的方法，具有简便快捷、准确度好、灵敏度高的特点，有效解决了麻辣面筋食品等终端产品麻感和辣感监测的问题，具有实际应用价值。为实现以上目的，本发明采用的技术方案是：一种同时测定食品中花椒麻素和辣椒素的方法，包括如下步骤：1)、混合标准工作液制备；2)、仪器配置；3)、绘制标准曲线；4)、样品准备：取粉碎均匀的样品2-5g于离心管中，加入18-20ml甲醇涡旋1-2min，再进行超声提取25-35min，再用离心机离心5-7min，离心机转速4000-5000r/min，再进行过滤，将滤液转移至50ml容量瓶；5)、样品溶液制备：在步骤4)的滤渣中加入18-20ml甲醇，再依次进行涡旋、超声提取、离心、过滤，得到滤液，将滤液转移至步骤2)的容量瓶中，与步骤4)滤液合并；6)、定容：将步骤5)过滤后的残渣用4-6ml甲醇润洗2-3次，将润洗液导入步骤2)的容量瓶中，摇匀，用甲醇定容至50ml，充分混匀后，用0.22μm有机微孔滤膜过滤；7)、色谱分析：将经步骤6)0.22μm有机微孔滤膜过滤后的滤液进行色谱分析；8)、结果分析。优选的，所述步骤1)样品配置，以成品麻辣面筋食品等作为测定样品。优选的，所述步骤1)混合标准工作液制备包括如下步骤：(1)标准储备液：分别精确称取适量辣椒素、二氢辣椒素标准品(精确到0.0001g)，用甲醇定容，配成浓度均为1000mg/l的辣椒素、二氢辣椒素标准储备液，于4℃冰箱内保存，有效期1年；(2)混合标准储备液：分别准确吸取适量辣椒素、二氢辣椒素标准储备液于10ml容量瓶，用甲醇定容，配成含量分别为200mg/l、100mg/l的辣椒素、二氢辣椒素混合标准储备液；于4℃冰箱内保存，有效期1年；(3)混合标准工作液：分别准确吸取不同体积的花椒麻素标准储备液(100μg/ml的甲醇溶液，西南大学)和辣椒素、二氢辣椒素混合标准储备液，用甲醇溶解并定容，配置成系列标准工作液；于-20℃以下保存，有效期6个月。优选的，所述步骤2)仪器配置包括：高效液相色谱仪，紫外测定器、电子天平，组织捣碎机，旋涡混合器，超声波清洗器，离心机，离心管，50ml容量瓶，0.22μm有机微孔滤膜。优选的，所述步骤3)和步骤7)中，色谱条件如下：色谱柱：rp18柱，5μm，4.6×250mm或等效色谱柱；流动相：乙腈-水，乙腈体积百分数40-50％；流速：0.8-1.2ml/min；测定波长：205-280nm；进样量：5-20μl；柱温：30-40℃；洗针溶剂：乙腈-水，乙腈体积百分数40-50％；密封清洗液：10％-30％甲醇或乙腈水溶液。优选的，所述3)、绘制标准曲线为：分别取5-20μl混合标准工作液注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以混合标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。优选的，所述8)、结果分析，样品中的花椒麻素的含量按①式计算；式中：c——样品中待测组分含量，单位为克每千克；c1、c2、c3、——由标准曲线得出的样液中待测物的浓度，单位为毫克每升；f1、f2、f3、——花椒麻素峰1、峰2、峰3对应的花椒麻素换算系数，由花椒麻素标液测试结果得出花椒麻素峰1、峰2、峰3占3个峰的峰面积总和的比值；v——样品定容体积，单位为毫升；m——样品质量，单位为克；计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字；样品中的辣椒素和二氢辣椒素的含量按式②计算；式中：c——样品中待测组分含量，单位为克每千克；c0——由标准曲线得出的样液中待测物的浓度，单位为毫克每升；v——样品定容体积，单位为毫升；m——样品质量，单位为克；计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。辣椒中辛辣物质主要为辣椒素类物质，主要活性成分为辣椒素和二氢辣椒素，其含量的高低直接影响到辣椒及辣椒制品的辣度。花椒中的主要麻味成分为酰胺类物质，即花椒麻素(花椒麻素对照品色谱分离中的3个峰分别以花椒麻素1、花椒麻素2、花椒麻素3表示)，其含量的高低直接影响到花椒及花椒制品的麻度。在面筋等麻辣食品加工生产过程中，辣椒素和二氢辣椒素主要体现为麻辣食品的辣感；花椒麻素体现为麻辣食品的麻感。辣椒中辣椒素的总含量为辣椒素和二氢辣椒素含量之和，花椒麻素的含量为花椒麻素1、花椒麻素2、花椒麻素3的含量之和。本发明的有益效果是：(1)本发明提供了一种用甲醇作提取溶剂，超声提取花椒麻素、辣椒素、二氢辣椒素，采用高效液相色谱法分离测定花椒麻素、辣椒素、二氢辣椒素的方法。(2)花椒麻素、辣椒素、二氢辣椒素分别在浓度为1-50mg/l、2-100mg/l、1-50mg/l范围内线性良好，相关系数均大于0.995；花椒麻素、辣椒素、二氢辣椒素定性检出限分别为0.05mg/l、0.1mg/l、0.05mg/l,测试定量检出限分别为1.0mg/kg、2.0mg/kg、1.0mg/kg；在样品测定低、中浓度水平点花椒麻素、辣椒素、二氢辣椒素加标回收率范围分别为82.5％～100.5％、93.7％～114.8％、81.1％～110.7％，本发明方法精密度、检出限和测试范围均可以满足面筋等样品中花椒麻素、辣椒素、二氢辣椒素测定的需要。(2)本发明测定方法具有简便快捷、准确度好、灵敏度高等特点，本发明采用乙腈作为特定的流动相，有效解决了麻辣面筋食品等终端产品麻感和辣感监测的问题，具有实际应用价值。附图说明图1为本发明花椒麻素、辣椒素、二氢辣椒素混合标准工作液色谱图。(逆时针旋转90°)图2为本发明面筋样品色谱图。(逆时针旋转90°)图中所述文字标注表示为：1、花椒麻素1；2、花椒麻素2；3、花椒麻素3；4、辣椒素；5、二氢辣椒素。具体实施方式为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。以下是具体实施例实施例1一种同时测定食品中花椒麻素和辣椒素的方法，包括如下步骤：1)、混合标准工作液制备：(1)标准储备液：分别精确称取适量辣椒素(97.5％，中国食品药品检定研究院)、二氢辣椒素标准品(98.5％，中国食品药品检定研究院)，用甲醇定容，配成浓度均为1000mg/l的辣椒素、二氢辣椒素标准储备液。于4℃冰箱内保存，有效期1年；(2)混合标准储备液：分别准确吸取适量辣椒素、二氢辣椒素标准储备液于10ml容量瓶，用甲醇定容，配成含量分别为200mg/l、100mg/l的辣椒素、二氢辣椒素混合标准储备液；于4℃冰箱内保存，有效期1年；(3)混合标准工作液：分别准确吸取不同体积的花椒麻素标准储备液(100μg/ml的甲醇溶液，西南大学)和辣椒素、二氢辣椒素混合标准储备液，用甲醇溶解并定容，按表1配成系列标准工作液，或其他合适的浓度；于-20℃以下保存，有效期6个月。表1标准工作液浓度(单位：mg/l)2)仪器配置：高效液相色谱仪，紫外测定器、电子天平，组织捣碎机，旋涡混合器，超声波清洗器，离心机，离心管，50ml容量瓶，0.22μm有机微孔滤膜。3)、绘制标准曲线；色谱条件如下：色谱柱：rp18柱，5μm，4.6×250mm或等效色谱柱；流动相：乙腈:水＝40:60(体积分数)；流速：0.8ml/min；测定波长：205nm；进样量：5μl；柱温：30℃；洗针溶剂：乙腈:水＝40:60(体积分数)；密封清洗液：体积百分数为10％的甲醇溶液。分别取5μl混合标准工作液注入高效液相色谱仪中，在上述色谱条件下，测定相应的峰面积，以混合标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。4)、样品准备：取粉碎均匀的样品2g于离心管中，加入18ml甲醇涡旋1min，再进行超声提取25min，再用离心机离心5min，离心机转速4000r/min，再进行过滤，将滤液转移至50ml容量瓶；5)、样品溶液制备：在步骤4)的滤渣中加入18ml甲醇，再依次进行涡旋、超声提取、离心、过滤，得到滤液，将滤液转移至步骤2)的容量瓶中，与步骤4)滤液合并；6)、定容：将步骤5)过滤后的残渣用4ml甲醇润洗2次，将润洗液导入步骤2)的容量瓶中，摇匀，用甲醇定容至50ml，充分混匀后，用0.22μm有机微孔滤膜过滤；7)、色谱分析：将经步骤6)0.22μm有机微孔滤膜过滤后的滤液进行色谱分析；步骤7)色谱条件与步骤3)相同。8)、结果分析：样品中的花椒麻素的含量按①式计算；式中：c——样品中待测组分含量，单位为克每千克(g/kg)；c1、c2、c3、——由标准曲线得出的样液中待测物(花椒麻素峰1、2、3)的浓度，单位为毫克每升(mg/l)；f1、f2、f3、——花椒麻素峰1、峰2、峰3对应的花椒麻素换算系数(由花椒麻素标液测试结果得出花椒麻素峰1、峰2、峰3占3个峰的峰面积总和的比值)；v——样品定容体积，单位为毫升(ml)；m——样品质量，单位为克(g)；计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字；样品中的辣椒素和二氢辣椒素的含量按式②计算；式中：c——样品中待测组分含量，单位为克每千克(g/kg)；c0——由标准曲线得出的样液中待测物的浓度，单位为毫克每升(mg/l)；v——样品定容体积，单位为毫升(ml)；m——样品质量，单位为克(g)。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。实施例2一种同时测定食品中花椒麻素和辣椒素的方法，包括如下步骤：1)、混合标准工作液制备：(1)标准储备液：分别精确称取适量辣椒素(97.5％，中国食品药品检定研究院)、二氢辣椒素标准品(98.5％，中国食品药品检定研究院)，用甲醇定容，配成浓度均为1000mg/l的辣椒素、二氢辣椒素标准储备液。于4℃冰箱内保存，有效期1年；(2)混合标准储备液：分别准确吸取适量辣椒素、二氢辣椒素标准储备液于10ml容量瓶，用甲醇定容，配成含量分别为200mg/l、100mg/l的辣椒素、二氢辣椒素混合标准储备液；于4℃冰箱内保存，有效期1年；(3)混合标准工作液：分别准确吸取不同体积的花椒麻素标准储备液(100μg/ml的甲醇溶液，西南大学)和辣椒素、二氢辣椒素混合标准储备液，用甲醇溶解并定容，按表1配成系列标准工作液，或其他合适的浓度；于-20℃以下保存，有效期6个月。表1标准工作液浓度(单位：mg/l)标样标准点1标准点2标准点3标准点4标准点5花椒麻素1.05.010.020.050.0辣椒素2.010.020.040.0100.0二氢辣椒素1.05.010.020.050.02)仪器配置：高效液相色谱仪，紫外测定器、电子天平，组织捣碎机，旋涡混合器，超声波清洗器，离心机，离心管，50ml容量瓶，0.22μm有机微孔滤膜。3)、绘制标准曲线；色谱条件如下：色谱柱：rp18柱，5μm，4.6×250mm或等效色谱柱；流动相：乙腈:水＝50:50(体积分数)；流速：1.2ml/min；测定波长：280nm；进样量：20μl；柱温：40℃；洗针溶剂：乙腈:水＝50:50(体积分数)；密封清洗液：体积百分数为20％的乙腈水溶液。分别取20μl混合标准工作液注入高效液相色谱仪中，在上述色谱条件下，测定相应的峰面积，以混合标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。4)、样品准备：取粉碎均匀的面筋样品4g于离心管中，加入19ml甲醇涡旋2min，再进行超声提取35min，再用离心机离心7min，离心机转速5000r/min，再进行过滤，将滤液转移至50ml容量瓶；5)、样品溶液制备：在步骤4)的滤渣中加入19ml甲醇，再依次进行涡旋、超声提取、离心、过滤，得到滤液，将滤液转移至步骤2)的容量瓶中，与步骤4)滤液合并；6)、定容：将步骤5)过滤后的残渣用6ml甲醇润洗3次，将润洗液导入步骤2)的容量瓶中，摇匀，用甲醇定容至50ml，充分混匀后，用0.22μm有机微孔滤膜过滤；7)、色谱分析：将经步骤6)0.22μm有机微孔滤膜过滤后的滤液进行色谱分析；步骤7)色谱条件与步骤3)相同。8)、结果分析：同实施例1。实施例3一种同时测定食品中花椒麻素和辣椒素的方法，包括如下步骤：1)、混合标准工作液制备：(1)标准储备液：分别精确称取适量辣椒素(97.5％，中国食品药品检定研究院)、二氢辣椒素标准品(98.5％，中国食品药品检定研究院)，用甲醇定容，配成浓度均为1000mg/l的辣椒素、二氢辣椒素标准储备液。于4℃冰箱内保存，有效期1年；(2)混合标准储备液：分别准确吸取适量辣椒素、二氢辣椒素标准储备液于10ml容量瓶，用甲醇定容，配成含量分别为200mg/l、100mg/l的辣椒素、二氢辣椒素混合标准储备液；于4℃冰箱内保存，有效期1年；(3)混合标准工作液：分别准确吸取不同体积的花椒麻素标准储备液(100μg/ml的甲醇溶液，西南大学)和辣椒素、二氢辣椒素混合标准储备液，用甲醇溶解并定容，按表1配成系列标准工作液，或其他合适的浓度；于-20℃以下保存，有效期6个月。表1标准工作液浓度(单位：mg/l)标样标准点1标准点2标准点3标准点4标准点5花椒麻素1.05.010.020.050.0辣椒素2.010.020.040.0100.0二氢辣椒素1.05.010.020.050.02)仪器配置：高效液相色谱仪，紫外测定器、电子天平，组织捣碎机，旋涡混合器，超声波清洗器，离心机，离心管，50ml容量瓶，0.22μm有机微孔滤膜。3)、绘制标准曲线；色谱条件如下：色谱柱：rp18柱，5μm，4.6×250mm；流动相：乙腈:水＝45:55(体积分数)；流速：1.0ml/min；测定波长：花椒麻素268nm、辣椒素和二氢辣椒素230nm；进样量：10μl；柱温：35℃；洗针溶剂：乙腈:水＝45:55(体积分数)；密封清洗液：体积百分数为20％的甲醇水溶液。分别取10μl混合标准工作液注入高效液相色谱仪中，在上述色谱条件下，测定相应的峰面积，以混合标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，表2为标准工作液曲线方程：表2标准工作液曲线方程组分曲线方程(y：响应值，x：含量)r花椒麻素1y＝1.43e+003x-4.32e+0020.9972花椒麻素2y＝1.11e+003x-5.35e+0020.9981花椒麻素3y＝3.15e+004x-1.18e+0030.9981辣椒素y＝1.33e+004x-2.74e+0030.9979二氢辣椒素y＝1.42e+004x-2.54e+0030.9985由表2可知花椒麻素、辣椒素和二氢辣椒素与其响应值在1-50mg/l、2-100mg/l、1-50mg/l范围内均呈线性关系，相关系数r≥0.995。4)、样品准备：取粉碎均匀的样品5g于离心管中，加入20ml甲醇涡旋1min，再进行超声提取30min，再用离心机离心5min，离心机转速4000r/min，再进行过滤，将滤液转移至50ml容量瓶；5)、样品溶液制备：在步骤4)的滤渣中加入20ml甲醇，再依次进行涡旋、超声提取、离心、过滤，得到滤液，将滤液转移至步骤2)的容量瓶中，与步骤4)滤液合并；6)、定容：将步骤5)过滤后的残渣用5ml甲醇润洗2次，将润洗液导入步骤2)的容量瓶中，摇匀，用甲醇定容至50ml，充分混匀后，用0.22μm有机微孔滤膜过滤；7)、色谱分析：将经步骤6)0.22μm有机微孔滤膜过滤后的滤液进行色谱分析；步骤7)色谱条件与步骤3)相同。8)、结果分析：同实施例1。以下为本发明实验数据：以实施例3为例：1、精密度：取两次测定结果的算术平均值为测定结果。在重复性条件下获得的两次测定结果的绝对差不得超过算术平均值的10％。2、定量检出限：取样为5g，定容体积为50ml时，花椒麻素、辣椒素、二氢辣椒素的定量检出限分别为为1.0mg/kg、2.0mg/kg、1.0mg/kg。3、实验验证：3.1精密度试验取自配1.0/2.0/1.0mg/l、20.0/40.0/20.0mg/l标准溶液，重复测试7次，作仪器精确度及重复性评估，结果如下：表3由表3可以看出，差异及rsd均小于10％，表明仪器精密度良好。3.2重复性试验平行制取6份皇冠面筋1224w样品、4份自制试验样品，按测定方法测定，作方法精确度及重复性评估，结果如下：(单位：g/kg，ave：平均值，s：标准偏差，rsd：相对标准偏差)。表4由表4可以看出，rsd均小于10％，表明方法重复性良好。3.3检出限及线性范围、定量限仪器检出限测试：配制0.05/0.1/0.05mg/l标准溶液，做检出限测试，连续测试7次，差异及rsd均小于10％，符合要求，结果如下表5：表5组分avesrsd(％)实际值差异(％)花椒麻素0.0510.00285.540.052.59辣椒素0.0980.00515.140.11.57二氢辣椒素0.0510.00183.470.052.29方法检出限测试：将方法空白7次重复测试标准偏差的3.14倍作为方法检出限(mdl＝3.14s)，根据得到的mdl预估一个浓度值，制得方法空白,加标0.1/0.2/0.1mg/l重复测试7次,其平均值回收率在90-110％之间，符合要求，结果如下：线性范围测试：由此得出花椒麻素、辣椒素和二氢辣椒素测试仪器检出限为0.05mg/l、0.1mg/l、0.05mg/l，花椒麻素、辣椒素和二氢辣椒素测试方法检出限为0.1mg/l、0.2mg/l、0.1mg/l(当取样为5.0g，定容体积为50ml时，花椒麻素、辣椒素和二氢辣椒素对应的定量检出限分别为1.0mg/kg、2.0mg/kg、1.0mg/kg)，花椒麻素、辣椒素和二氢辣椒素线性范围分别为0.1mg/l～100mg/l、0.2mg/l～500mg/l、0.1mg/l～250mg/l。3.4加标回收率试验选用湖南玉峰食品公司成品皇冠面筋和香辣鱼，在样品测定低、中浓度水平点进行样品加标试验，样品测试2次，监控加标后各测试2次，基体加标后各测试2次，结果如下表5-6所示：表5表6选用湖南省玉峰食品实业有限公司半成品面胚，加入一定量的配料，自制试验样品，由于花椒油、辣椒是已知量，可以根据配料中辣椒、花椒油用量及辣椒中辣椒素、二氢辣椒素和花椒油中花椒麻素含量计算辣椒素、二氢辣椒素、花椒麻素理论加标量以及回收率。表7由以上表5-7可知，花椒麻素、辣椒素、二氢辣椒素监控加标和基体加标回收率均在80-120％之间，表明该方法和仪器均有较好的准确性，可以满足测试的要求。需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。当前第1页12