一种纸基双模式检测镁离子的方法与流程

本发明涉及一种纸基双模式检测镁离子的方法，属于镁离子的检测技术领域。

背景技术：

镁是一种参与生物体正常生命活动及新陈代谢过程必不可少的元素，钙、磷、碘、钾、维生素等营养素在人体内的新陈代谢作用也都依靠镁来发挥。它能促进细胞的增殖和生长，维持人体组织的完整性。镁是降低血液中胆固醇的主要催化剂，也是维持心脏收缩的重要离子。体内缺镁，可导致心肌纤维坏死、心排血量减低、心律紊乱等。镁耗竭还可以导致胰岛素抵抗及胰岛素分泌损害。因此，对镁离子浓度的分析与检测对人体健康有着重要意义。

然而，目前检测镁离子的方法需要特定的设备，测定周期长，操作复杂，很多方法只能停留在实验室内不能用于实践。因此，研究和开发简便、快速、灵敏、准确的检测方法是十分重要的。微流控纸芯片作为新型设备具有制作过程简单、易携带、成本低、生物相容性和生物降解能力好等优点，可以用于疾病检测、环境质量监控和水质分析等领域。因此，研究和开发新型、实用、便宜、操作简单的纸器件有着重要意义。

技术实现要素：

针对目前存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种双模式纸基设备的构建方法，通过比色法和电化学发光法实现对镁离子的可视化定性以及电化学发光定量检测，其特征是包括以下步骤：

1. 在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计疏水蜡打印图案并利用固态蜡打印机将其批量打印到裁剪的A4滤纸上，随后将其在加热板加热至蜡融化并渗透整个纸的厚度，形成疏水墙，样式如附图1所示，其中A为比色区，B为电化学发光检测区；

2. 采用丝网印刷的方法，将Ag/AgCl参比电极，碳工作电极和碳对电极分别印刷到纸器件背面圆形亲水区域a、b、c，且印刷电极面积小于预留亲水区域面积，样式如附图2所示；比色区由灰色疏水图案包围的白色圆形区域用来辅助液体渗透到电化学发光检测区区域b，由灰色疏水图案包围的白色矩形区域用来记录颜色长度，电化学发光检测区域由灰色疏水图案围成的白色矩形区域用来辅助连通三电极；

3. 制备枝状金纳米粒子：将80 mL二次水加热至90 ℃，并加入0.8 mL质量分数为1%的氯金酸溶液，继续加热至96 ℃保持1 min，最后加入2.8 mL质量分数为1%的柠檬酸钠，并加热5 min后冷却至室温；取20 μL上述溶液滴加到电化学发光检测区圆形亲水工作区域，自然晾干后重复上述操作一次；继续滴加20 μL由0.018 g盐酸羟胺，1.0 mL二次水和667 μL质量分数为1%的氯金酸溶液组成的混合溶液，自然晾干后重复上述操作一次；

4. 制备氧化石墨烯-Ag-N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺纳米复合物：将1.0 mL 0.02 mol/L N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺快速加入由2.0 mL 10 mmol/L硝酸银溶液，500 μL 2.0 mg/mL氧化石墨烯溶液，5.0 mL二次水，9.0 mL乙醇组成的混合溶液并于室温磁力搅拌下反应12小时，将得到的溶液用乙醇和二次水洗涤数次得到氧化石墨烯-Ag-N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺纳米复合物；

5. 制备硫化镉量子点：将172 μL巯基丙酸加入40 mL 20 mmol/L的氯化镉溶液中并用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH为10，继续加入20 mL 20 mmol/L的硫代乙酰胺，并持续搅拌30 min后于80 ℃回流10 h，得到的硫化镉胶体于室温下透析24小时得到硫化镉量子点；

6. 制备Au -辣根过氧化物酶-DNA链2- HKUST-1@Pt复合物

(1) 制备HKUST-1@Pt纳米粒子：称取0.545 g三水合硝酸铜溶解在7.5 mL二次水中，称取0.264 g均苯三甲酸溶解在7.5 mL乙醇中，使其完全溶解；将上述得到的两种溶液混合并于室温下磁力搅拌30 min得到均匀溶液，将其于120 ℃反应24 h，冷却至室温，用乙醇和二次水洗涤数次，并于80 ℃真空状态下反应10小时得到金属有机框架材料HKUST-1，HKUST-1为Cu3(BTC)2, BTC代表均苯三甲酸；取1 mL质量分数为1%的氯铂酸加入1 mL 1mg/mL的HKUST-1中并超声处理20 min，取2 mL 0.1 mol/L硼氢化钠溶液逐滴加入上述混合溶液并剧烈搅拌30 min，最后，将得到的溶液以12000 rpm离心10 min并用二次水洗涤三次得到HKUST-1@Pt纳米粒子；

(2) 制备Au纳米立方体-辣根过氧化物酶-DNA链2-HKUST-1@Pt复合物：将0.15 mL 0.1 mol/L硼氢化钠溶液于4 ℃保存3 h后快速加入由6.25 mL 1.0 mmol/L 氯金酸溶液和18.75 mL 0.1 mol/L十六烷基三甲基溴化铵溶液组成的混合溶液中，得到黄褐色溶液，将其于室温磁力搅拌下反应4 h，得到Au种子溶液；将5.0 μL Au种子溶液，50 μL 0.01 mol/L硫酸铜溶液，3.0 mL 0.1 mol/L新制备的抗坏血酸溶液依次加入到由5.0 mL 2.0 mmol/L氯金酸和20 mL 0.02 mol/L十六烷基三甲基溴化铵组成的混合溶液中，溶液在5 min后变为紫红色，将得到的溶液以12000 rpm离心10 min并用二次水洗涤两次，得到Au纳米立方体；取 40 μL 5 μmol/L DNA链2与1.0 mL pH 5.2的缓冲溶液，1.5 μL 10 mmol/L三（2-羧乙基）膦混合并保持1 h；将上述混合溶液与500 μL Au纳米立方体溶液混合并磁力搅拌1 h；将得到的溶液与80 μL 1 mg mL^-1辣根过氧化物酶混合并于室温下磁力搅拌1.5 h得到Au纳米立方体-辣根过氧化物酶-DNA链2复合物；将上述复合物与1.0 mL HKUST-1@Pt纳米粒子混合并于室温下磁力搅拌16 h后于4 ℃保持4 h，最后用乙醇和二次水洗涤数次得到Au纳米立方体-辣根过氧化物酶-DNA链2-HKUST-1@Pt纳米粒子复合物；

7. 取20 μL氧化石墨烯-Ag-N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺纳米复合物滴加到金纳米粒子修饰的区域b并自然晾干；依次滴加20 μL硫化镉量子点，15 μL 0.05 wt %的壳聚糖固定液并自然晾干；继续滴加20 μL DNA链3溶液并于37 ℃保持1小时后4 ℃保存24 h；最后用10 mmol/L pH 8.0的缓冲溶液冲洗工作区域以除去多余的DNA链3，所述的DNA链3碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其3’端修饰上巯基和6个亚甲基；

8. 取20 μL由60 μL 1 μmol/L DNA链1，500 μL pH 8.0的缓冲溶液，500 μL 1 mM 三（2-羧乙基）膦组成的混合溶液与20 μL Au纳米立方体-辣根过氧化物酶-DNA链2-HKUST-1复合物混合并加热到 95 °C以形成Mg²⁺ 特异性DNA酶；将纸器件比色区沿虚线部分进行切割，沿实线部分进行折叠，取15 μL上述溶液滴加到比色区圆形亲水区域并于室温下保持1.5 h；继续滴加20 μL含有镁离子的待测溶液并于37 °C保持0.5 h以完成镁离子与其特异性DNA酶之间的特异性识别，由于材料粒径和纸纤维孔径大小不同，连接有Au-辣根过氧化物酶的DNA链2序列能渗透纸芯片实现与DNA链3碱基互补配对，所述的DNA链1碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰上氨基和6个亚甲基，DNA链2碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰上巯基，3’端修饰上氨基和6个亚甲基，且自左向右第23个碱基A代表腺嘌呤核糖核酸；

9. 取20 μL 20 mmol/L 3，3’-二氨基联苯胺滴加于区域A矩形亲水显色条，连接有HKUST-1@Pt NPs的DNA链2序列由于粒径大于纸芯片孔径不能透过纸芯片，继续向区域A圆形亲水工作区域滴加20 μL 5 mmol/L H2O2，反应5 min后滴加40 μL pH 8.0的缓冲溶液，液体矩形亲水显色条，10 min后测量显色长度；

10. 将纸器件电化学发光检测区下方矩形区域沿虚线部分进行切割，沿实线部分进行折叠使矩形亲水区域与圆形亲水区域对齐，将20 μL 10 mmol/L双氧水与40 μL pH 8.0的缓冲溶液混合滴加到矩形亲水区域，连接电化学工作站检测镁离子浓度；

11. 分别绘制电化学发光强度和显色长度与镁离子浓度的标准曲线，完成镁离子的测定。

12. 上述纸器件的总尺寸为40 mm-50 mm×100 mm-110 mm，其中比色区由疏水蜡包围的圆形亲水区域直径为5-7 mm，纵向矩形亲水区域宽度为1-3 mm, 高度为44-46 mm，矩形亲水区域右侧刻度间隔为1 mm；电化学发光检测区圆形亲水区域a、b、c直径为5.5-7.5 mm，其周围矩形疏水区域宽度为29-31 mm，高度为14-16 mm，其下方矩形亲水区域宽度为23-25 mm，高度为4.5-6.5 mm，其周围疏水蜡的宽度为2-5 mm。

本发明的有益效果：

1. 一种纸基双模式传感器可同时实现对镁离子的可视化以及电化学发光精准检测，充分利用镁离子特异性DNA酶，降低了实验成本。

2. 本发明利用纸纤维孔径以及材料粒径的大小差异，实现了HKUST-1@Pt纳米粒子与Au纳米立方体-辣根过氧化物酶的分离，并分别用于镁离子的可视化定性检测与电化学发光定量检测。

3. 通过改变离子特异性DNA酶，可实现对其它重金属离子的分析与检测。

附图说明：

1. 附图1为疏水蜡打印图案。其中，A为比色区，B为电化学发光检测区。

2. 附图2为疏水蜡打印图案上丝网印刷上3个电极，区域a、b、c分别印刷Ag/AgCl参比电极，碳工作电极和碳对电极。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

实施例1（自来水中的镁离子）

一种操作简单、检测速度快、成本低廉的纸基双模式检测镁离子的方法，包括以下步骤。

1. 在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计疏水蜡打印图案，如附图1所示。

2. 将滤纸裁剪成A4大小。

3. 采用喷蜡打印机在步骤2中裁好的滤纸上打印步骤1中设计的疏水蜡打印图案。

4. 将步骤3中得到的带有疏水蜡图案的A4滤纸在加热板上于100 ℃下加热2 min，使蜡融化并渗透整个纸的厚度，形成疏水墙。

5. 将纸器件沿虚线部分进行切割，沿实线部分进行折叠。

6. 采用文献已报道的方法在纸纤维上生长枝状金纳米粒子。

7. 采用文献已报道的方法制备氧化石墨烯-Ag-N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺纳米复合物。

8. 采用文献已报道的方法制备硫化镉量子点。

9. 采用文献已报道的方法制备Au-辣根过氧化物酶-DNA链2复合物及HKUST-1@Pt纳米粒子。

10. 配置混合溶液。混合溶液由60 μL 1 μmol/L DNA链1，500 μL pH 8.0的缓冲溶液，500 μL 1 mM三（2-羧乙基）膦组成。

11. 将步骤9得到的Au -辣根过氧化物酶-DNA链2复合物与1.0 mL HKUST-1@Pt纳米粒子混合并于室温下磁力搅拌16 h后于4 ℃保持4 h，最后用乙醇和二次水洗涤数次得到Au纳米立方体-辣根过氧化物酶-DNA链2- HKUST-1@Pt纳米粒子复合物。

12. 取20 μL步骤10中得到的混合溶液与20 μL步骤11中得到的溶液混合并加热到 95 °C以形成Mg²⁺ 特异性DNA酶。

13. 取20 μL步骤7中得到的氧化石墨烯-Ag-N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺纳米复合物滴加到金纳米粒子修饰的工作区域并自然晾干，继续依次滴加20 μL硫化镉量子点，15 μL 0.05 wt %的壳聚糖固定液于电化学发光检测区圆形亲水工作区域并自然晾干；继续滴加20 μL DNA链3溶液并于37 ℃保持1小时后4 ℃保存过夜；最后用10 mmol/L pH 8.0的缓冲溶液冲洗工作区域以除去多余的DNA链3。

14. 取15 μL步骤12中得到的溶液滴加到比色区圆形亲水区域并于室温下保持1.5 h，继续滴加20 μL含有镁离子的待测溶液并于37 °C保持0.5 h，由于材料粒径和纸纤维孔径大小不同，连接有Au-HRP的DNA链2序列能渗透纸芯片实现与DNA链3碱基互补配对。

15. 连接有HKUST-1@Pt纳米粒子的DNA链2序列由于粒径大于纸纤维孔径不能透过纸芯片，继续向比色区圆形亲水工作区域滴加20 μL 5 mmol/L H2O2，反应5 min后滴加40 μL pH 8.0的缓冲溶液，液体流入滴加有20 μL 20 mmol/L 3，3’-二氨基联苯胺的矩形亲水显色条，10 min后测量颜色长度。

16. 将纸器件电化学发光检测区下方矩形区域沿虚线部分进行切割，沿实线部分进行折叠使矩形亲水区域与圆形亲水区域对齐，将20 μL 10 mmol/L双氧水与40 μL pH 8.0的缓冲溶液混合滴加到矩形亲水区域，连接电化学发光工作站检测镁离子浓度。

17. 取20 μL 20 mmol/L 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺于长度为2 mm，宽度为15 mm的比色条区域，并自然晾干。

18. 分别绘制电化学发光强度和显色长度与镁离子浓度的标准曲线，完成镁离子的测定。

19. 上述纸器件的总尺寸为40 mm-50 mm×100 mm-110 mm，其中比色区由疏水蜡包围的圆形亲水区域直径为5-7 mm，纵向矩形亲水区域宽度为1-3 mm, 高度为44-46 mm，矩形亲水区域右侧刻度间隔为1 mm；电化学发光检测区圆形亲水区域a、b、c直径为5.5-7.5 mm，其周围矩形疏水区域宽度为29-31 mm，高度为14-16 mm，其下方矩形亲水区域宽度为23-25 mm，高度为4.5-6.5 mm，其周围疏水蜡的宽度为2-5 mm。

序列表

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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