本发明涉及生物碱类物质检测技术领域，尤其涉及一种铁皮石斛总生物碱含量的检测方法。
背景技术：
铁皮石斛(dendrobiumofficinalekimuraetmigo)又名铁皮兰、黑节草，为兰科石斛属多年生草本植物，分布广泛，作为传统中草药和保健食品在我国使用已有千年的历史，含有丰富多样的次生代谢产物，具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳等功效。因其功效确切，自2010版中国药典开始，即将其作为新增品种单独列出，与中药石斛区别开。生物碱是铁皮石斛中重要的药性成分之一，在抗肿瘤、治疗心血管及胃肠道疾病等方面具有明显的疗效，具有广阔的开发应用前景。因此，建立科学有效的铁皮石斛总生物碱含量的检测方法，对于铁皮石斛总生物碱制备工艺的质量控制以及铁皮石斛总生物碱累积规律的研究具有重要的意义。
生物碱常用的检测方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法、酸碱滴定法和酸性染料比色法等。其中紫外分光光度法、高效液相色谱法以及气相色谱法只适合一种或几种生物碱含量的检测，对于成分复杂的总生物碱含量检测并不适用。而相比较于酸碱滴定法，酸性染料比色法灵敏度更好，重现性更好，因此是检测总生物碱含量的常用方法。
酸性染料比色法的基本原理是在适当缓冲体系中，生物碱能与酸性染料结合生成有色络合物，该络合物可以定量的用有机溶剂萃取并具有特征性吸收波长，因此可用比色定量的方法对该络合物进行定量，从而间接的对生物碱含量进行检测，其关键技术在于参照标准品、酸性染料以及检测波长的选择。不同类型的生物碱与酸性染料反应生成的络合物，其最大吸波长有差异，因此标准参照品的选择会很大程度上影响生物碱酸性染料检测结果的灵敏度与准确性。由于缺乏对铁皮石斛生物碱化学结构的研究，现行铁皮石斛总生物碱的检测均选用石斛碱作为参照品，但石斛碱型倍半萜类生物碱在石斛属植物中分布并不广泛，现有文献已证实铁皮石斛不含有石斛碱，因此，不适宜以石斛碱作为标准参照品建立铁皮石斛总生物碱酸性染料比色法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种铁皮石斛总生物碱含量检测方法，提高铁皮石斛总生物碱含量测定的准确度。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种铁皮石斛总生物碱含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)采用浓氨水和氯仿对铁皮石斛进行提取，得到提取液；
(2)将血根碱与氯仿混合，配制血根碱标准溶液，将所述血根碱标准溶液与酸性染料溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和氯仿混合后静置，将得到的氯仿相作为标准待测溶液，测定所述标准待测溶液的吸光度，建立血根碱含量的标准曲线；
(3)按照所述步骤(2)中的方法测定所述步骤(1)中提取液的吸光度，根据所得提取液的吸光度和血根碱含量的标准曲线，得到铁皮石斛总生物碱含量；
所述步骤(1)和步骤(2)无时间顺序限定。
优选的，所述步骤(1)中提取的方法，包括以下步骤：
将铁皮石斛进行杀青处理和制粉处理，得到铁皮石斛干粉；
将所述铁皮石斛干粉在浓氨水中浸润35～45min，得到浸润铁皮石斛；所述浓氨水为分析纯，所述浓氨水中nh3含量为25％-28％；
将所述浸润铁皮石斛与氯仿混合，于75～85℃进行加热处理1.5～2.5h，得到提取液。
优选的，所述杀青处理的温度为100～110℃，杀青处理的时间为15～25min。
优选的，所述铁皮石斛干粉质量与浓氨水、氯仿的体积比为1:12:40。
优选的，所述步骤(2)中酸性染料溶液中的酸性染料包括溴酚蓝或溴甲酚绿；所述酸性染料溶液的质量浓度为0.3-0.7％。
优选的，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的ph值为3.0-4.0，浓度为0.1～0.2mol/l。
优选的，所述步骤(2)中将血根碱标准溶液与酸性染料溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和氯仿混合时，所述血根碱标准溶液、酸性染料溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和氯仿的体积比为0.5:0.5:5:6。
优选的，所述步骤(2)中测定标准待测溶液吸光度的检测波长为410nm。
优选的，所述步骤(2)中血根碱标准溶液的浓度为40～200μg/ml。
优选的，根据所述血根碱含量的标准曲线得到的血根碱含量的标准曲线回归方程为y＝0.0047x+0.0037，相关系数r2＝0.999，其中，所述x为血根碱标准溶液的浓度，所述y为血根碱标准溶液对应的吸光度。
本发明提供了一种铁皮石斛总生物碱含量的检测方法，本发明人在前期研究中，通过非靶向代谢组学技术分析了铁皮石斛提取物中的生物碱组分，发现铁皮石斛中含有血根碱等异喹啉生物碱，hplc外标实验和加标实验也证实铁皮石斛含有血根碱(图4-5)。因此，本发明根据铁皮石斛总生物碱含有血根碱等异喹啉生物碱的特点，以血根碱为标准品，并选取溴酚蓝为酸性染料，使得总生物碱和血根碱与酸性染料溴酚蓝反应形成的络合物在400～800nm的扫描光谱一致，最大吸收波长均为410nm。因此，以血根碱为标准品能够实现铁皮石斛总生物碱含量的准确测定。同时，本发明选取溴酚蓝为酸性染料，使得反应体系在最大吸收波长410nm处的本底吸收值(空白吸收值)较低，能够减弱本底干扰，有利于提高检测方法的准确性和灵敏度。此外，本发明选取的反应缓冲体系为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在此条件下，总生物碱与溴酚蓝形成的络合物的稳定性好，在60min内能够稳定存在，有利于提高检测方法的稳定性和重现性。
实施例的实验结果表明，本发明的检测方法中，在血根碱标准溶液的浓度为40～200μg/ml的范围内，与检测波长处吸光度呈良好的线性关系，线性关系方程式为y＝0.0047x+0.0037，相关系数r2＝0.999；检出限为10.5μg/ml，以120μg/ml血根碱溶液重复检测六组，平均吸光度值为0.546，rsd为2.54％。这说明本发明提供的检测方法具有准确性高、稳定性好、易于重现的优点，为研究铁皮石斛总生物碱累积规律及铁皮石斛总生物碱制备工艺的质量控制提供了更加准确有效的检测方法。
附图说明
图1为铁皮石斛总生物碱与溴酚蓝反应所得络合物和血根碱与溴酚蓝反应所得络合物的扫描图谱；
图2为溴酚蓝和溴甲酚绿的扫描图谱；
图3为血根碱含量的标准曲线；
图4为铁皮石斛总生物碱中血根碱的高效液相色谱检测图；
图5为铁皮石斛总生物碱中血根碱加标实验图。
具体实施方式
本发明提供了一种铁皮石斛总生物碱含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)采用浓氨水和氯仿对铁皮石斛进行提取，得到提取液；
(2)将血根碱与氯仿混合，配制血根碱标准溶液，将所述血根碱标准溶液与酸性染料溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和氯仿混合后静置，将得到的氯仿相作为标准待测溶液，测定所述标准待测溶液的吸光度，建立血根碱含量的标准曲线；
(3)按照所述步骤(2)中的方法测定所述步骤(1)中提取液的吸光度，根据所得提取液的吸光度和血根碱含量的标准曲线，得到铁皮石斛总生物碱含量；
所述步骤(1)和步骤(2)无时间顺序限定。
本发明采用浓氨水和氯仿对铁皮石斛进行提取，得到提取液。在本发明中，所述提取的方法，优选包括以下步骤：
将铁皮石斛进行杀青处理和制粉处理，得到铁皮石斛干粉；
将所述铁皮石斛干粉在浓氨水中浸润35～45min，得到浸润铁皮石斛；所述浓氨水为分析纯，所述浓氨水中nh3含量为25％-28％；
将所述浸润铁皮石斛与氯仿混合，于75～85℃进行加热处理1.5～2.5h，得到提取液。
本发明优选将铁皮石斛进行杀青处理和制粉处理，得到铁皮石斛干粉。在本发明中，所述铁皮石斛优选使用铁皮石斛全株；所述杀青处理的温度优选为100～110℃，杀青处理的时间优选为15～25min。完成所述杀青处理后，本发明优选对杀青处理得到的铁皮石斛进行制粉，得到铁皮石斛干粉；本发明对所述制粉的方式没有特殊的限制，选用本领域技术人员熟知的方式即可。
得到铁皮石斛干粉后，本发明优选将所述铁皮石斛干粉在浓氨水中浸润35～45min，得到浸润铁皮石斛；所述浓氨水为分析纯，所述浓氨水中nh3含量为25％-28％。在本发明中，所述铁皮石斛干粉的质量与浓氨水的体积比优选为1：12。在本发明中，所述浸润的温度优选为室温。在本发明中，将所述铁皮石斛干粉浸润在浓氨水中，能够将总生物碱转化为游离状态，便于氯仿萃取。
得到浸润铁皮石斛后，本发明优选将所述浸润铁皮石斛与氯仿混合，于75～85℃进行加热处理1.5～2.5h，得到提取液。在本发明中，所述铁皮石斛干粉的质量与氯仿的体积比优选为1:40。在本发明中，所述加热处理的温度优选为氯仿的回流温度。本发明优选采用水浴加热的方式提供所述加热处理的温度。
完成所述加热处理后，本发明优选将加热处理后的混合溶液经0.22μm微滤膜过滤，得到提取液。
本发明将血根碱与氯仿混合，配制血根碱标准溶液，将所述血根碱标准溶液与酸性染料溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和氯仿混合后静置，将得到的氯仿相作为标准待测溶液，测定所述标准待测溶液的吸光度，建立血根碱含量的标准曲线。在本发明中，所述酸性染料优选为包括溴酚蓝或溴甲酚绿，图2为溴酚蓝和溴甲酚绿的扫描图谱。根据扫描图谱，本发明选取溴酚蓝为酸性染料，使得反应体系在最大吸收波长410nm处的本底吸收值(空白吸收值)较低，能够减弱本底干扰(图2)，有利于提高检测方法的准确性和灵敏度。
在本发明中，所述血根碱标准溶液的浓度优选为40～200μg/ml。本发明对于所述血根碱标准溶液的配制方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的溶液的配制方法即可。在本发明的实施例中，具体是取血根碱标准品20mg，使用氯仿溶解，定容至50ml，得到浓度为400μg/ml的血根碱母液，并按照表1进行精密稀释，可获不同梯度的(40、80、120、140、160和200μg/ml)的血根碱标准溶液。
表1血根碱标准溶液的配制
在本发明中，所述酸性染料溶液的质量浓度优选为0.3％～0.7％，更优选为0.5％。在本发明中，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的ph值优选为3.0-4.0，更优选为3.0，浓度优选为0.1～0.2mol/l，更优选为0.15mol/l。本发明将所述血根碱标准溶液与酸性染料溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和氯仿混合时，所述血根碱标准溶液、酸性染料溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和氯仿的体积比优选为0.5:0.5:5:6。本发明对于所述血根碱标准溶液与酸性溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和氯仿的混合没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的物料混合的技术方案即可。本发明优选先将酸性染料溶液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液混合，然后依次加入血根碱标准溶液和氯仿，将所得混合物料震摇4～6min，以保证各组分充分混合。
在本发明中，所述静置的时间优选为25～35min，更优选为30min；所述静置优选在室温下进行。在本发明中，在所述静置过程中，总生物碱与酸性染料形成络合物，并分层。
完成所述静置后，本发明优选将得到的氯仿相进行干燥后作为标准待测溶液进行后续测定。本发明对于所述干燥没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的干燥的技术方案即可；在本发明的实施例中，具体是采用无水硫酸钠对静置后得到的氯仿相进行干燥。
在本发明中，测定所述标准待测溶液吸光度的检测波长优选为410nm。本发明对于确定所述检测波长的具体方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。在本发明的实施例中，具体是将所述标准待测溶液在340～600nm范围内进行波长扫描，结果显示血根碱与溴酚蓝生成的络合物在410nm处有特征性吸收峰，因此，以410nm作为检测波长。
本发明对于建立血根碱含量的标准曲线的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。本发明优选以所述血根碱标准溶液的浓度为横坐标，以所述血根碱标准溶液在检测波长处的吸光度为纵坐标，绘制血根碱含量的标准曲线。在本发明的实施例中，所述血根碱含量的标准曲线回归方程为y＝0.0047x+0.0037，相关系数r2＝0.999，其中，所述x为血根碱标准溶液的浓度，所述y为血根碱标准溶液对应的吸光度。
得到血根碱含量的标准曲线和提取液后，本发明按照测定血根碱标准溶液吸光度的方法测定所述提取液的吸光度，根据所得提取液的吸光度和血根碱含量的标准曲线，得到铁皮石斛总生物碱含量。得到提取液后，本发明优选采用氯仿对提取液进行定容，作为待测样品溶液，然后测定所述待测样品溶液的吸光度。
在本发明的实施例中，具体的，是将所述待测样品溶液的吸光度代入血根碱含量的标准曲线回归方程中，获得所述待测样品溶液中总生物碱的浓度，再根据所述待测样品溶液的体积和铁皮石斛干粉的质量，按照以下公式计算铁皮石斛中总生物碱的百分含量：
m＝[(c×v)/m]×100％
其中，m为铁皮石斛干粉中总生物碱的百分含量；
c为待测样品溶液中总生物碱的浓度，单位为μg/ml；
v为待测样品溶液的体积，单位为ml；
m为铁皮石斛干粉的质量，单位为g。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1)制备提取液
取铁皮石斛全株，于105℃下进行杀青处理30min，然后于60℃烘干制粉，得到铁皮石斛干粉；取0.25g铁皮石斛干粉，用3ml浓氨水(分析纯，nh3含量为25％-28％)于室温下浸润40min后，加入氯仿10ml，称重，于80℃水浴回流加热2h，冷却后补充氯仿至原重，0.22微滤膜过滤，定容至10ml，即为待测样品溶液。
2)制作标准曲线
21)取血根碱标准品20mg，适量氯仿溶解，定容至50ml，即为400μg/ml血根碱母液，按照表1精密稀释，可获40，80，120，140，160，200μg/ml的血根碱标准溶液。
22)取质量浓度为0.5％的溴酚蓝溶液0.5ml，与5ml磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(ph3.3；浓度0.15mol/l)混匀，加入0.5ml不同梯度血根碱标准溶液，摇匀，加入6ml氯仿，用力震摇5min，室温静置30min；取氯仿相，无水硫酸钠干燥后作为标准待测溶液在340～600nm范围内进行波长扫描，结果显示所述标准待测溶液中血根碱与溴酚蓝生成的络合物在410nm处有特征性吸收峰(图1)。
23)将所述标准待测溶液于410nm下检测吸光度，以血根碱标准溶液的浓度为横坐标，以410nm处吸光度为纵坐标，绘制血根碱含量的标准曲线(图3)。
结果表明，血根碱在浓度40～200μg/ml的范围内，与410nm处吸光度呈良好的线性关系，标准曲线回归方程为y＝0.0047x+0.0037，相关系数r2＝0.999。
24)以实际检测时空白rsd的10倍确定方法的检出限为10.5μg/ml，120μg/ml血根碱标准溶液重复检测六组，平均吸光度值为0.546，rsd为2.54％。
3)利用酸性染料比色法对待测样品溶液进行检测
取0.5％的溴酚蓝溶液0.5ml，与5ml磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液混匀，加入0.5ml待测样品溶液，摇匀，加入6ml氯仿，用力震摇5min，室温静置30min。取氯仿相，脱水后于410nm下检测吸光度，设置三组重复，测得平均吸光度值为0.433。
4)根据血根碱含量的标准曲线计算铁皮石斛总生物碱含量
将步骤3)所得平均吸光度值代入步骤23)所得到的血根碱含量的标准曲线回归方程中，获得待测样品溶液中总生物碱的浓度，再根据步骤1)中待测样品溶液的体积以及铁皮石斛干粉的质量0.25g，代入含量计算公式，计算铁皮石斛干粉中总生物碱的百分含量。含量计算公式如下：
m＝[(c×v)/m]×100％
其中，m为铁皮石斛干粉中总生物碱含量；
c为待测样品溶液中总生物碱质量浓度，单位为μg/ml；
v为待测样品溶液的体积，单位为ml；
m为铁皮石斛干粉的质量，单位为g。
本实施例中c为91.40μg/ml，v为10ml，m为0.25g，根据公式计算最后得出铁皮石斛干粉中总生物碱含量为0.366％。
从以上实施例可以看出，本发明以血根碱为标准品对铁皮石斛中总生物碱含量进行检测，该检测方法的检出限为10.5μg/ml，方法具有准确性高、稳定性好、易于重现的优点，为研究铁皮石斛总生物碱累积规律及铁皮石斛总生物碱制备工艺的质量控制提供了更加准确有效的检测方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。