一种铁皮石斛利用茎段薄片进行扩繁的方法与流程

本发明涉及一种铁皮石斛扩繁方法，具体是利用茎段薄片不经历愈伤组织阶段直接分化获得无菌苗，进而通过增殖获得大量的无菌苗的扩繁方法，属于农业领域。

背景技术：

铁皮石斛为兰科石斛属植物，是传统名贵中药材。近年来随着人们对铁皮石斛的了解越来越多，对铁皮石斛的需求日趋增加，而石斛自然繁殖力极低，种子需与真菌共生才能萌发，加上长期采挖，稀缺的野生资源越来越少。通过组培方法可快速获得铁皮石斛的无菌苗，并通过快速增殖，可以快速获得大量无菌铁皮石斛种苗。

目前通过组培获得铁皮石斛无菌苗的方法有两种：

一是果荚消毒后在培养基上播种获得无菌苗，此方法获得无菌植株为杂交后代，每个个体的基因型都存在差异，在商品化生产中无法满足对种苗一致性的要求；

二是通过外植体消毒，经过愈伤组织培养、分化培养、增殖培养获得遗传背景稳定，变异系数小的大量无菌植株，此方法经历愈伤组织培养、分化培养两个阶段，时间较长；并且，已报道的此类方法，需要选择距离节左端和右端各0.5-1cm左右的茎段，同样长度的外植体获得的无菌苗数量较少。

因而，急需继续寻找一种优良的铁皮石斛组培快繁方法，既能快速获得大量的无菌植株，又能保持遗传性状的稳定。

技术实现要素：

本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种铁皮石斛利用茎段薄片进行扩繁的方法。本发明首先将铁皮石斛茎段切割成厚度0.2cm以上的茎段薄片，接种于接种培养基上不经历愈伤组织阶段直接分化获得无菌苗，当无菌苗长至3-5片叶时，移植到增殖培养基上，可快速获得大量无菌苗。利用该方法进行铁皮石斛的组织培养扩繁，可节约从田间铁皮石斛植株获得无菌苗的时间，快速获得大量遗传背景一致的种苗群体，满足商品苗对扩繁一致性、稳定性的要求。

本发明的技术方案：一种铁皮石斛利用茎段薄片扩繁的方法,其特征是,

1)培养基制备

接种培养基为：ms+6-ba0.125-0.25mg/l+naa0.125-0.375mg/l+2,4-d0.5-1.5mg/l+kt0.125-0.25mg/l；

增殖培养基为：蒸馏水+花宝1号1.4-1.6g/l+花宝2号0.30-0.35g/l+牛骨蛋白胨1.5-1.6g/l+活性炭1.5-1.6g/l+ms母液中的6、7部分各10-12ml/l+蔗糖18-20g/l+琼脂粉5.5-6.0g/l+香蕉泥100-120g；

2)外植体预处理与接种培养

采用健康铁皮石斛的茎段作为外植体，将外植体洗涤、灭菌后将茎段横切为厚度0.2cm以上的茎段薄片，然后接种于接种培养基上光培养25±2天，即可见到芽，继续光培养使石斛在组培瓶内生长，至55天左右时，无菌苗可长出3-5片叶，可进行增殖；

3)无菌苗接种

当无菌苗长出3-5片叶时，将无菌苗移植到装有增殖培养基的组织培养瓶中，光培养15-25天，每棵无菌苗可分生出20-30棵小苗；

4)壮苗培养、生根培养和出瓶炼苗

将增殖的铁皮石斛苗经壮苗培养8-15天，生根培养3-8天；然后选取根系发达及健壮的铁皮石斛放在温室驯化2-3天；清洗干净根部的培养基，移栽至已浇透水的树皮基质中继续培养至植株长大。

所述步骤2)的灭菌优选为：用75％酒精灭菌30s，后用无菌水冲洗1次；用0.1％升汞溶液灭菌8min，用无菌水冲洗3次。

所述步骤3)所述组织培养瓶，规格有两种，一种瓶上下内径5.5cm，高9.5cm；另一种瓶上口径4cm，下瓶径8.5cm，高13.5cm，根据增殖系数选择适宜的组培瓶，一瓶可接种3-4棵石斛。

所述步骤4)的壮苗培养为：将增殖的铁皮石斛苗转接到壮苗培养基上继续培养，光照强度为1500-1800lux，培养8-15d；所述壮苗培养基为：ms+iba0.3mg/l+naa0.4mg/l+2,4-d0.7mg/l+活性炭5g/l+琼脂30g/l+香蕉泥20g/l，ph值为5.0-5.5。

所述步骤4)的生根培养为：于生根培养基上光照强度为2500-4500lx下培养3-8天；生根培养基为：ms+iba3mg/l+naa1mg/l+2,4-d0.2mg/l+活性炭10g/l+琼脂30g/l+香蕉泥20g/l。

优选的，所述步骤1)的接种培养基为：ms+6-ba0.125mg/l+naa0.125mg/l+2,4-d0.5mg/l+kt0.125mg/l。

优选的，所述步骤1)的增殖培养基为：蒸馏水+花宝1号1.4g/l+花宝2号0.30g/l+牛骨蛋白胨1.5g/l+活性炭1.5g/l+ms母液中的6、7部分各取10ml/l+蔗糖18g/l+琼脂粉5.5g/l+香蕉泥100g/l。

本发明的有益效果是：

(1)本发明采用茎段薄片0.2cm以上即可，不需要必须有节点，大大增加了外植体的获取数量，进而有利于获得大量遗传背景一致的无菌苗；

(2)采用本发明的接种培养基，可以不用经过愈伤培养、分化培养，从外植体茎段(不要求有节点)直接获得无菌苗，节约了获得无菌苗的时间，提高了效率；

(3)传统的增殖培养基仅能分化出2-3棵小苗，繁殖系数低。难以满足新品种推广中种苗需求量大的需要。本发明采用增殖专用培养基每棵无菌苗可分生出20-30棵小苗；满足了商品化生产要求。

综上，本发明采用0.2cm以上茎段薄片作为外植体，采用本发明的接种培养基不经过愈伤培养、分化培养获得无菌苗；再采用本发明的增殖专用培养基每棵无菌苗可分生出20-30棵小苗，可节约从田间铁皮石斛植株获得无菌苗的时间，快速获得大量遗传背景一致的种苗群体，满足商品苗对扩繁一致性、稳定性的要求。

附图说明

图1为筛选可以分化出无菌苗的最薄茎段图；两个铁皮石斛地方栽培种(福建栽培种和广西栽培种)，图中显示茎段厚度0.2cm时均可直接分化出无菌苗。图1中a、b、c为铁皮石斛福建栽培种1cm、0.5cm、0.2cm茎段直接分化出无菌苗照片；d、e为铁皮石斛广西栽培种1cm、0.2cm茎段直接分化出无菌苗照片。

图2为本发明与对照组增殖培养基增殖效果对比图；其中左图采用的是对照培养基培养的无菌苗，右图为本发明的增殖培养基培养的无菌苗。

具体实施方式

以下结合实施例来说明其效果。其中6-ba：6-苄氨基腺嘌呤；naa：萘乙酸；2,4-d：2,4-二氯苯氧乙酸；kt：激动素，6-糖基氨基嘌呤；iba：吲哚丁酸。

ms母液中的6部分为：硼酸0.62g/l，硫酸锰1.86g/l，硫酸锌0.86g/l，碘化钾0.083g/l，钼酸钠0.025g/l，硫酸铜0.0125g/l，氯化钴0.0125g/l，其余为水。

ms母液中的7部分为：肌醇10g/l，甘氨酸0.2g/l，烟酸0.05g/l，盐酸吡哆辛0.03g/l，盐酸硫胺素0.02g/l，其余为水。

实施1：茎段薄片分化培养基筛选

(1)选配培养基

将铁皮石斛茎段用洗衣粉溶液浸泡20分钟，后用流水冲洗20分钟；然后用75％酒精灭菌30s，后用无菌水冲洗1次；用0.1％升汞溶液灭菌8min，用无菌水冲洗3次；然后将茎段切割成1cm左右的茎段(没有节间)，每瓶放置3-4段，放置在如表1所示的不同配方培养基上，每个处理重复4瓶。统计不同培养基配方对没有节间的铁皮石斛茎段的分化率，结果如表1所示。

表1不同培养基配方及分化效率

从表1可以看出：处理6和处理11均具有较高分化率，而处理6培养基的激素含量较少，因此选择处理6为最适分化培养基。

(2)筛选可以分化出无菌苗的最薄茎段

利用两个铁皮石斛地方栽培种(福建栽培种和广西栽培种)进行如上所示的洗涤和消毒，茎段灭菌后切割成0.2cm、0.5cm、1cm的茎段，不考虑是否有节间，然后放置于上述处理6的培养基中光培养25±2天，筛选可以分化出无菌苗的最薄茎段；筛选结果如图1所示，从图1可以看出：0.2cm厚度无节间的茎段(图1中c和e)即可满足要求。

(3)增殖培养基制备

对照为报道的培养基配方：ms+香蕉100g/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l。

本发明增殖专用培养基：蒸馏水+花宝1号1.4g/l+花宝2号0.3g/l+牛骨蛋白胨1.5g/l+活性炭1.5g/l+ms母液中的6、7部分各取10ml/l+蔗糖18g/l+琼脂粉5.5g/l+香蕉泥100g/l。

当无菌苗长至3-5片叶时，在无菌超净台内分别将无菌苗接种到本发明增殖专用培养基和对照培养基上，一瓶可接种3-4棵；光培养20天，观察结果，结果如图2所示。从图2可以看出：采用本发明的增殖专用培养基每棵无菌苗可分生出20-30棵小苗；而对照组每棵无菌苗可分生出2-3棵小苗。

实例2

1)培养基制备

接种培养基为：ms+6-ba0.125mg/l+naa0.125mg/l+2,4-d0.5mg/l+kt0.125mg/l；

2)外植体选取与预处理

选取健康的铁皮石斛植株，用洗衣粉溶液浸泡20分钟，后用流水冲洗20分钟，备用；

3)外植体灭菌

用75％酒精灭菌30s，后用无菌水冲洗1次；用0.1％升汞溶液灭菌8min，用无菌水冲洗3次；

4)接种

在无菌超净台内对已灭菌的铁皮石斛茎段横切为厚度0.2cm以上的茎段薄片，用镊子将茎段薄片轻轻放在接种培养基(培养基装在组培瓶内)上，轻压使之与接种培养基紧贴；

5)培养环境控制

光培养25天，即可见到芽，继续光培养使石斛在组培瓶内生长，至55天左右时，无菌苗可长出3-5片叶，可用于进行增殖；

6)增殖培养基制备

增殖培养基：蒸馏水+花宝1号1.4g/l+花宝2号0.3g/l+牛骨蛋白胨1.5g/l+活性炭1.5g/l+ms母液中的6-7部分各取10ml+蔗糖18g/l+琼脂粉5.5g/l+香蕉泥100g/l；

7)接种

当无菌苗长至3-5片叶时，在无菌超净台内将无菌苗移植到增殖培养基上，一瓶可接种3-4棵；组培瓶规格有两种，一种瓶上下内径5.5cm，高9.5cm；另一种瓶上口径4cm，下瓶径8.5cm，高13.5cm；

8)培养环境控制

光培养15-25天，每棵无菌苗可分生出20-30棵小苗；

9)壮苗培养

将增殖的铁皮石斛苗转接到壮苗培养基上继续培养，光照强度为1500-1800lux，培养8-15d；

所述壮苗培养基为：ms+iba0.3mg/l+naa0.4mg/l+2,4-d0.7mg/l+活性炭5g/l+琼脂30g/l+香蕉泥20g/l，ph值为5.0-5.5；

10)生根培养

然后于生根培养基上光照强度为2500-4500lx下培养3-8天；生根培养基为：ms+iba3mg/l+naa1mg/l+2,4-d0.2mg/l+活性炭10g/l+琼脂30g/l+香蕉泥20g/l；

11)出瓶炼苗

选取根系发达及健壮的铁皮石斛放在温室驯化2-3天，取出幼苗清洗干净根部的培养基，移栽至已浇透水的树皮基质中。边移栽边覆盖白色无纺布遮光。