一种基于适配体和碳点的链置换信号放大荧光传感器检测三磷酸腺苷的方法及试剂盒与流程

本发明属于分析检测技术领域，更具体地，涉及一种基于适配体和碳点的链置换信号放大荧光传感器检测三磷酸腺苷的方法，以及一种基于适配体和碳点的链置换信号放大荧光传感器检测三磷酸腺苷的试剂盒。

背景技术

三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，atp)是生物体内化学能量的主要载体，也是大多数生物体酶活动的重要基质，在抗心律失常、扩张微血管、保护心肌和神经信号方面发挥着重要的作用。体内atp的异常水平与许多疾病密切相关，例如缺氧、低血糖、帕金森病和一些恶性肿瘤等，同时atp的利用效率也是衡量细胞生存活性和细胞损伤的重要指标。目前涉及atp的检测方法有很多，比如液相-质谱连用、荧光素酶介导的生物发光法，基于金纳米粒的比色法等，但这些方法存在操作复杂，繁琐耗时，易受背景信号干扰等不足。因此，建立一种简便灵敏的atp定量检测体系成为目前生化分析和临床诊断的热点。

碳点(carbondots，cds)是一种零维半导体纳米材料，近似球型且粒径小于10nm。它制备简便，原材料来源广泛，具有优良的光学特性(高荧光强度、抗光漂白性、发光颜色可调等)。碳作为生物有机体的骨架材料，与其他元素构成的荧光材料(例如量子点)相比，碳点的毒性低且具有很好的生物相容性。这些优势使得碳点在生物传感、成像分析、药物载体和环境检测等领域有着很好的应用潜力。

适配体是一种经由指数富集配体系统进化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)技术从人工构建的随机单链寡核苷酸文库里筛选得到的dna或者rna序列，能和靶分子高特异性、高选择性地结合。适配体具有许多优点，如特定的空间二级结构，易于化学标记，稳定性好以及构象变换可逆等等。此外核酸适体适用范围广，比如蛋白质、核酸、氨基酸、小分子物质、金属离子以及药物等。这些优点使得核酸适体在蛋白质组学、病毒检测、疾病诊断等方面得到了广泛的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种基于适配体和碳点的链置换信号放大荧光传感器检测三磷酸腺苷的方法及试剂盒。其中，以适配体作为识别元件，碳点修饰的信号链作为荧光探针，氧化石墨烯为荧光淬灭剂。本发明基于荧光信号的变化实现atp的定量检测，该方法具有高特异性、高选择性、高灵敏度，操作简便，能够用于血样中atp的测定，可为临床诊断疾病提供有利分析数据。

本发明的第一方面提供一种基于适配体和碳点的链置换信号放大荧光传感器检测三磷酸腺苷的方法，包括如下步骤：

a)将碳点修饰的信号链(cds-signalstrand)，适配体链(aptamerstrand)和辅助链(helpstrand)杂交，形成双链探针；

b)目标物循环信号放大：向步骤a)体系中加入反应链(fuelstrand)及目标物atp，进行第一反应；

c)荧光检测atp：加入氧化石墨烯(go)，进行第二反应后离心，将上清液进行荧光检测；

d)标准曲线的绘制：按照上述方法，向体系中加入不同浓度的atp溶液，测定各自的荧光强度值f，同时测定空白荧光值f0，绘制相对荧光强度[(f0-f)/f0]与atp浓度对应的标准曲线；

e)样品检测：按照上述方法，向体系中加入未知atp浓度的待测溶液，测定其荧光强度值，根据步骤d)所得标准曲线得到待测溶液中atp的浓度；

其中，信号链具有seqidno：1所示的核苷酸序列，为实现与碳点连接，其5’端具有-nh2-c6的修饰基团；适配体链具有seqidno：2所示的核苷酸序列；辅助链具有seqidno：3所示的核苷酸序列；反应链具有seqidno：4所示的核苷酸序列。

如图1所示，本发明的检测方法基于如下原理：构建三条链杂交的双链dna，包括含有与atp特异性结合序列的适配体链，辅助链和碳点修饰的信号链。以aptamerstrand作为识别元件，cds-signalstrand作为荧光探针，氧化石墨烯则作为荧光淬灭剂。加入目标物atp和反应链后，atp与适配体结合，诱发体系发生链置换反应，使得cds-signalstrand和atp得以释放。释放出的atp进入新的循环。加入go后，体系中游离的cds-signalstrand吸附到go表面，发生荧光共振能量转移，检测体系的荧光发生猝灭。测定不同浓度的atp溶液的荧光猝灭值，制作荧光猝灭值与atp浓度的标准曲线，根据该标准曲线即可通过测定未知浓度的atp溶液的荧光猝灭值计算出相应的atp浓度。

本发明中，各链的浓度可根据需要进行调整，优选地，步骤a)的体系中，碳点修饰的信号链的终浓度为0.5-2μm；适配体链的终浓度为0.5-2μm；辅助链的终浓度为0.5-2μm；步骤b)中反应链的终浓度为0.4-2μm。实际操作中，通常将各链预先溶于缓冲液，再各取相应体积混合后进行杂交。根据一种具体实施方式，各链浓度和体积如下：碳点修饰的信号链的浓度为0.5～2μm，体积为10～30μl；适配体链的浓度为5～20μm，体积为1～3μl；辅助链的浓度为5～20μm，体积为1～3μl；反应链的浓度为5～20μm，体积为1～3μl。

根据本发明，步骤a)中，所述杂交可在常规核酸链杂交所适用的体系和条件下进行，优选地，所述杂交在tris-hcl缓冲液中于35-40℃下进行，所述tris-hcl缓冲液的浓度优选为10-50mm，杂交的时间可根据需要确定，一般为40-80min。

根据本发明，氧化石墨烯的加入量以能够猝灭荧光探针的荧光信号为宜，优选地，步骤c)中，氧化石墨烯的浓度为30～70μgml^-1。

由于释放出的atp进入新的循环，本发明的方法可实现高灵敏度的atp检测，步骤d)中，atp溶液的浓度可以为0～800nm。

根据本发明，各反应步骤的条件均可为本领域常规核酸链参与的反应的条件，优选地，步骤b)中，所述第一反应的条件包括：温度为15-30℃，优选在室温下进行，时间为100-120min。步骤c)中，所述第二反应的条件包括：温度为15-30℃，优选在室温下进行，时间为15-25min。

根据本发明，荧光检测的条件根据荧光探针的性质确定，优选地，步骤c)中，荧光检测的条件包括：测定体系在447nm处的荧光强度，激发波长为360nm，扫描速度为1200nmmin^-1，光电倍增管电压为500v，激发狭缝和发射狭缝宽度为10nm。

本发明中，碳点修饰的信号链和氧化石墨烯均可根据参考文献采用本领域公知的方法制得。具体步骤如下：

(1)cds-signalstrand的制备

称1g柠檬酸到10ml超纯水中溶解，然后加入350μl二乙烯三胺，搅拌均匀后转移到聚四氟乙烯反应釜中，200℃下加热5h得到棕黄色溶液，离心纯化，接着在真空干燥箱中干燥，定量复溶得到碳点溶液。在100μl的cds溶液中加入30μl20mgml^-1edc的tris-hcl缓冲液(ph8.0)，在室温条件下超声20min，活化cds表面的羧基基团。活化后的cds与氨基修饰的信号链混合，室温避光反应6h得到碳点修饰的信号链。

(2)氧化石墨烯的制备

取3g膨胀石墨，加入120mlh2so4在冰水浴中搅拌，接着加入16gkmno4，在35-40℃搅拌反应，之后再加入h2o于80℃反应2h，得到亮黄色反应物。冷却后加入40mlh2o2过夜，然后依次进行酸洗、水洗至ph为6，超声分散，然后真空干燥。

本发明的第二方面提供一种基于适配体和碳点的链置换信号放大荧光传感器检测三磷酸腺苷的试剂盒，该试剂盒包括：

1)碳点修饰的信号链；

2)适配体链；

3)辅助链；

4)反应链；

其中，信号链具有seqidno：1所示的核苷酸序列；适配体链具有seqidno：2所示的核苷酸序列；辅助链具有seqidno：3所示的核苷酸序列；反应链具有seqidno：4所示的核苷酸序列。

优选地，该试剂盒还包括氧化石墨烯。

本发明与现有技术相比，具有如下显著优点：

1、引入粘性末端介导的链置换反应，实现体系中目标物循环的信号放大，使得目标物不断重复利用，即单个目标物可以与n个探针分子按照1：n的比例进行反应，达到n倍信号放大的目的，提高了检测的灵敏度。反应过程依靠dna严格的碱基互补配对性质，避免了酶的参与。因而，温度、酸碱性等对实验过程的影响都可避免，特异性更强，使得实验条件更加简便，提高了目标检测的准确度。

2、利用氧化石墨烯作为荧光猝灭剂，能够有效地避免复杂基质的干扰，减小背景荧光，提高了检测的灵敏度。

3、引入核酸适配体，进一步提高检测体系的选择性，实现高选择性检测，检测结果可信度高。

4、基于本发明的传感策略，根据不同目标物选择合适的适配体，能够用于其他目标物的检测。并且成功运用到生物样品(人血清)中atp的检测，有较好的应用前景。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1为基于适配体和碳点的链置换信号放大荧光传感器检测atp的原理图；

图2为本发明合成的碳点的透射电镜图；

图3为本发明实施例1所构建的检测atp体系，荧光强度随不同浓度atp变化的荧光光谱图；

图4为本发明实施例1所构建的检测atp体系，不同浓度atp对相对荧光强度[(f0-f)/f0]的标准曲线图。

图5为本发明对比例1所构建的检测atp体系，在干扰物存在下的选择性结果。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

药品和试剂：实验中使用的dna均由生工生物工程(上海，中国)合成。柠檬酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)购自国药集团化学试剂有限公司，atp(adenosine)购自生工生物工程(上海，中国)。

cds-signalstrand的制备：称1g柠檬酸到10ml超纯水中溶解，然后加入350μl二乙烯三胺，搅拌均匀后转移到聚四氟乙烯反应釜中，200℃下加热5h得到棕黄色溶液，离心纯化，接着在真空干燥箱中干燥，定量复溶得到碳点溶液，将碳点进行透射电镜检测，如图2所示。在100μl的cds溶液中加入30μl20mgml^-1edc的tris-hcl缓冲液(ph8.0)，在室温条件下超声20min，活化cds表面的羧基基团。活化后的cds与氨基修饰的信号链混合，室温避光反应6h得到碳点修饰的信号链。

氧化石墨烯的制备：取3g膨胀石墨，加入120mlh2so4在冰水浴中搅拌，接着加入16gkmno4，在35-40℃搅拌反应，之后再加入h2o于80℃反应2h，得到亮黄色反应物。冷却后加入40mlh2o2过夜，然后依次进行酸洗、水洗至ph为6，超声分散，然后真空干燥。

实施例1

a)构建荧光适配体传感器：2μlaptamerstrand(10μm)、2μlhelpstrand(10μm)和20μlcds-signalstrand(1μm)混合均匀，37℃孵育杂交60min；上述各链均预先溶于20mm的tris-hcl中；

b)目标物循环信号放大：向体系中加入2μl10μmfuelstrand及目标物atp，在室温下反应110min；fuelstrand预先溶于20mm的tris-hcl中；

c)荧光检测atp：加入氧化石墨烯，使其浓度为50μgml^-1，室温反应20min后离心，装入石英比色皿进行荧光检测；

d)标准曲线的绘制：按照上述方法，向体系中加入不同浓度的atp溶液，浓度在0～800nm范围内，室温孵育，测定各自的荧光强度值f，同时测定空白荧光值f0，如图3所示，作相对荧光强度[(f0-f)/f0]与atp浓度对应的标准曲线，如图4所示；

e)样品检测：将未知浓度的atp样品离心处理后，按照上述方法测定其荧光强度，根据标准曲线得到待测样品中atp的浓度。

荧光测定的条件包括：测定体系在447nm处的荧光强度，激发波长为360nm，扫描速度为1200nmmin-1，光电倍增管电压为500v，激发狭缝和发射狭缝宽度为10nm。

对比例1

用于验证本发明检测方法的选择性。

重复实施例1中的步骤，不同的是，将步骤c)中的atp更换为三磷酸尿苷(utp)、三磷酸鸟苷(gtp)和三磷酸胞苷(ctp)等干扰物(干扰物浓度是目标物的10倍)，其它条件不变，检测荧光，得到本方法检测atp的选择性结果(结果见图5)。由图5可以看出，本发明的方法对于atp的检测具有特异性。

应用实施例1

将实施例1所构建的荧光传感器应用于实际人体血清样本测定。

血清样本12000rpm离心后，作为未知浓度的atp样品加入体系，测定体系在447nm处的荧光强度，激发波长为360nm，扫描速度为1200nmmin^-1，光电倍增管电压为500v，激发狭缝和发射狭缝宽度为10nm。根据实施例1得到的标准曲线可计算样本中atp的含量，为255.02nm，如下表1所示。

应用实施例2

用于测定本发明检测方法的回收率。

重复应用实施例1中的步骤，不同的是，在步骤e)中，进行加样检测，分别添加200、250、300nm的atp溶液，进行荧光检测，获得本方法在实际样品检测中的回收率，结果见表1。

表1实际样本中atp的测定结果(n＝3)

由表1可以看出，本发明的方法可用于生物样品(人血清)中atp的检测，并且具有较好的回收率，极具应用前景。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110>南京医科大学

<120>一种基于适配体和碳点的链置换信号放大荧光传感器检测三磷酸腺苷的方法及试剂盒

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cctacgtctccaactaacttacgg24

<210>2

<211>55

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

acctgggggagtattgcggaggaaggtagggccgtaagttagttggagacgtagg55

<210>3

<211>11

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ccctaccttcc11

<210>4

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cctacgtctccaactaacttacggccctacct32