一种免标记磷光探针定量检测三磷酸腺苷的方法与流程

本发明涉及生物分析检测技术领域，特别是涉及一种免标记磷光探针定量检测三磷酸腺苷的方法。

背景技术

量子点(qds)一般为球形或类球形，是由半导体材料(通常由iib～ⅵa或iiia～va元素组成)制成的、直径在2～20nm的纳米粒子。量子点是在纳米尺度上的原子和分子的集合体，既可由一种半导体材料组成，如由iib～via族元素(如cds、cdse、cdte、znse等)或iiia～va族元素(如inp、inas等)组成，也可以由两种或两种以上的半导体材料组成。

磷光相对于荧光是一种更为少见的发光现象。相对于量子点的荧光分析法，室温磷光法(room-temperaturephosphorescence,rtp)具有很多的优点。室温磷光法具有三线态寿命、较好的选择性、较高的信噪等优点。室温磷光法不仅能够避免生物基质本底荧光和散射光的干扰而且对仪器的要求也相对较低，磷光寿命的测量也比荧光寿命测量更简便。

相对于天然受体、抗体和酶生物传感器，适配体生物传感器展现出其特有的优势。首先,寡核苷酸适配体体外对于任何给定的目标---大蛋白质和小分子细胞，有很高特异性和亲和力。第二,可以商业化合成重现性高和纯度较高的atp适配体并且其具有较好的化学稳定性。第三,目标绑定后，寡核苷酸适配体通常都会发生显著的构象变化，具有新型生物传感器的特性，可实现检测灵敏度高和选择性强的目的。

三磷酸腺苷(atp)作为细胞中能量供给的核心物质，在调节细胞代谢活动和细胞生理机能的生物化学过程中发挥着重要的作用。atp的浓度与许多疾病密切相关，如低血糖、帕金森病和一些恶性肿瘤。因此生物体内atp的定量检测对于生物化学研究和临床诊断都具有重大意义。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种免标记磷光探针定量检测三磷酸腺苷的方法。

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

本发明的一种免标记磷光探针定量检测三磷酸腺苷的方法，包括以下步骤：

先将tris-hcl缓冲溶液、atp适配体、atp溶液混合加高纯水定容，反应完成后，加入mpa包覆的mn掺杂zns量子点母液混合均匀形成检测系统，其中的atp适配体的基因序列为:(acctgggggagtattgcggaggaaggt)，mpa包覆的mn掺杂zns量子点具有磷光性质，atp适配体可以使得量子点磷光猝灭，atp与atp适配体能够特异性结合，随着atp的浓度增加，阻碍了atp适配体与量子点的结合，从而使得量子点磷光恢复。经数据统计，量子点的磷光恢复过程呈线性关系，其线性方程为：y＝317.7+0.015x，其中y为磷光强度，x为检测体系中atp的浓度，拟合度为0.95，线性范围为8-9000nmol/l，最低检出限为6nmol/l。

优选的，所述tris-hcl缓冲溶液、atp适配体、atp溶液加高纯水定容，反应25-30min后，然后加入mpa包覆的mn掺杂zns量子点母液。

优选的，加入mpa包覆的mn掺杂zns量子点母液后20-25min，检测系统的磷光强度。

优选的，mpa包覆的mn掺杂zns量子点母液的浓度为200-250mg/l。

优选的，检测体系中atp适配体的浓度为0.4-0.6μm。

优选的，所述tris-hcl缓冲溶液的ph＝7-7.4。

优选的，tris-hcl缓冲溶液、atp适配体溶液、待检测atp溶液的体积比为2体积份:2体积份:2体积份:1体积份，整个检验系统定容至500μl。

优选的，向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入50μl待检测atp溶液作为磷光恢复剂，加高纯水定容至475μl，反应30min后，再加入25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm，测定磷光强度，通过y＝317.7+0.015x，可计算出待检测atp溶液中atp的浓度，其中y为磷光强度，x为检测体系中atp的浓度。

本发明的另一方面还包括mpa包覆的mn掺杂zns量子点母液在atp检测中的应用。

优选的，当atp的加入浓度为8-9000微摩范围内时，量子点的磷光强度呈线性增强，线性关系为y＝317.7+0.015x，线性范围为8-9000nmol/l，最低检出限为6nmol/l，r²＝0.95。

(1)mpa包覆的mn掺杂zns量子点母液的制备，具体步骤参见文献：1.wu,p.,he,y.,wang,h.-f.,yan,x.-p.,2010.anal.chem.82,1427–1433.2.zhuang,j.,zhang,x.,wang,g.,li,d.,yang,w.,li,t.,2003.j.mater.chem.13,1853–1857.

准确称取0.0020g纯化后的量子点粉末，溶解于2ml的高纯水中，摇匀备用；

(2)不同phtris-hcl缓冲液的配制

准确称取tris固体0.6058g于50ml离心管中，加入40ml高纯水,然后加入0.1m的hcl溶液，调节ph至6.0,6.5,7.0,7.2,7.4,7.6,7.8,8.5,9.0，最后加高纯水定容至50ml。

(3)不同浓度atp适配体的配制

分别取40μmatp适配体溶液10μl,40μl,60μl,80μl,100μl,125μl,150μl,用高纯水定容至1ml，得到0.4μm,1.6μm,2.4μm,3.2μm,4μm,5μm,6μmatp适配体梯度浓度溶液。

(4)不同浓度atp溶液的配制

准确称取0.0030gatp二钠盐溶于5ml高纯水中，配制成浓度为1mm的atp溶液；分别取4.5μl,25μl,75μl,250μl,350μl,450μl，用高纯水定容至5ml,得到0.9μm,5μm,15μm,50μm,70μm,90μmatp梯度浓度溶液。

(5)采用磷光法为检测手段，用mpa包覆的mn掺杂zns量子点对atp进行特异性检测：

向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)不同ph(6.0-9.0)tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl梯度浓度(0.4μm-6μm)atp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入10-45μlmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液，加高纯水定容至425μl。摇匀静置0.5-25min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)不同ph(6.0-9.0)tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl梯度浓度(0.4μm-6μm)atp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入50μl梯度浓度(0.9-90μm)atp溶液作为磷光恢复剂，加高纯水定容至475μl，反应30min后，加入10-45μlmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液。摇匀静置0.5-25min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明在磷光模式下检测，相对于荧光量子点，磷光量子点具有磷光寿命长、可避免自体荧光和散色光的干扰、选择性强、检测时无需加入任何除氧剂和诱导剂等优点。

(2)本发明所提供的“off-on”检测机理简单，不需要对mpa包覆的mn掺杂zns量子点进行功能化的表面修饰即可实现对atp的特异性检测，此举能大幅度的简化合成步骤，且作为磷光猝灭剂的atp适配体和磷光恢复剂的atp均为环保易得的低毒性材料。

(3)本发明采用磷光法作为检测手段具有检测时间短，操作简单，结果直观，灵敏度较高，准确度较高等优点，适合作为可靠的检测手段进行广泛推广。

(4)目前已发展的检测方法有很多种，主要包括高效液相色谱法、荧光素酶介导的生物荧光、电化学传感、比色探针、荧光化学传感器等。然而，这些方法存在操作复杂、仪器昂贵、灵敏度不高、选择性不足等问题，阻碍了实际应用。

(5)定量检测atp的线性范围宽，满足了3个数量级，线性范围为8-9000nmol/l，检出限为6nmol/l。

附图说明

图1为mpa包覆的mn掺杂zns磷光量子点的x射线粉末衍射图(xrd)图；

图2为mpa包覆的mn掺杂zns磷光量子点和mpa的傅里叶变换红外光谱图(ftir)图；

图3为mpa包覆的mn掺杂zns磷光量子点的透射电镜图(tem)图；

图4为加入不同浓度atp适配体后mpa包覆的mn掺杂zns磷光量子点磷光猝灭优化图(图中a为实例7，b为实例3.c为实例8)；

图5为随着恢复剂atp加入量不同的线性拟合图

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所述的高纯水购买于杭州娃哈哈集团有限公司，硫酸锌、乙酸锰和硫化钠生产于天津市光复精细化工研究所，3-巯基丙酸(mpa)购于百灵威科技有限公司，tris缓冲溶液购于鼎国昌盛生物技术有限责任公司，无水乙醇(c2h5oh)购于天津市基准化学试剂有限公司。三磷酸腺苷二钠盐购于北京索莱宝科技有限公司。atp的适配体(acctgggggagtattgcggaggaaggt)购于生工生物工程(上海)股份有限公司，其他试剂均购于天津科威有限公司。

实例1：mpa包覆的mn掺杂zns量子点的合成

向100ml的三口瓶中加入原料5ml0.1m的硫酸锌、5ml0.01m乙酸锰、50ml0.04mmpa，用1mol/lnaoh溶液调节该混合溶液的ph值至11。将该混合液在氮气环境中室温磁力搅拌30分钟，保证稳定剂mpa与zn²⁺和mn²⁺络合充分。随后用注射器在隔绝空气的条件下加入5ml0.1m的硫化钠水溶液，在室温下继续搅拌20分钟后，停止通n2。将三口瓶置于空气中，50℃恒温搅拌陈化2小时。得到具有室温磷光性质的mpa包覆的mn掺杂zns磷光量子点。加入无水乙醇(3倍量的无水乙醇)，在12000r/min下高速离心5min，弃去上清液，得到的产物用无水乙醇反复清洗多次，室温真空干燥24小时备用。通过x射线粉末衍射光谱(xrd)(图1)得到磷光量子点的晶型为立方型闪锌矿结构。傅里叶变换红外光谱图(ftir)(图2)得到mpa通过-sh作用成功的包覆在了mn掺杂zns磷光量子点的表面。通过透射电镜图(tem)(图3)，可以看出mn掺杂zns磷光量子点的分散性良好且近似为球型。

实例2：

1.合成方法参照实施例一；

2.采用磷光发为检测手段，用mpa包覆的mn掺杂zns量子点对atp进行特异性检测：

①向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入10μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液，加高纯水定容至425μl。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

②向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入50μl梯度浓度(0.9-90μm)atp溶液作为磷光恢复剂，加高纯水定容至475μl，反应30min后，加入10μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

实例3

1.合成方法参照实施例一；

2.采用磷光发为检测手段，用mpa包覆的mn掺杂zns量子点对atp进行特异性检测：

①向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液，加高纯水定容至425μl。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

②向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入50μl梯度浓度(0.9-90μm)atp溶液作为磷光恢复剂，加高纯水定容至475μl，反应30min后，加入25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

实例4

1.合成方法参照实施例一；

2.采用磷光发为检测手段，用mpa包覆的mn掺杂zns量子点对atp进行特异性检测：

①向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入45μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液，加高纯水定容至425μl。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

②向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入50μl梯度浓度(0.9-90μm)atp溶液作为磷光恢复剂，加高纯水定容至475μl，反应30min后，加入45μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

实例5

1.合成方法参照实施例一；

2.采用磷光发为检测手段，用mpa包覆的mn掺杂zns量子点对atp进行特异性检测：

①向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝6.0tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液，加高纯水定容至425μl。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

②向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝6.0tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入50μl梯度浓度(0.9-90μm)atp溶液作为磷光恢复剂，加高纯水定容至475μl，反应30min后，加入25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

实例6

1.合成方法参照实施例一；

2.采用磷光发为检测手段，用mpa包覆的mn掺杂zns量子点对atp进行特异性检测：

①向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝9.0tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液，加高纯水定容至425μl。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

②向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝6.0tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入50μl梯度浓度(0.9-90μm)atp溶液作为磷光恢复剂，加高纯水定容至475μl，反应30min后，加入25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

实例7

1.合成方法参照实施例一；

2.采用磷光发为检测手段，用mpa包覆的mn掺杂zns量子点对atp进行特异性检测：

①向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4的tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl0.4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液，加高纯水定容至425μl。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

②向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4的tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl0.4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入50μl梯度浓度(0.9-90μm)atp溶液作为磷光恢复剂，加高纯水定容至475μl，反应30min后，加入25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

实例8

1.合成方法参照实施例一；

2.采用磷光发为检测手段，用mpa包覆的mn掺杂zns量子点对atp进行特异性检测：

①向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4的tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl6μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液，加高纯水定容至425μl。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

②向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4的tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl6μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入50μl梯度浓度(0.9-90μm)atp溶液作为磷光恢复剂，加高纯水定容至475μl，反应30min后，25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

实例9

1.合成方法参照实施例一；

2.采用磷光发为检测手段，用mpa包覆的mn掺杂zns量子点对atp进行特异性检测：

①向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4的tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液，加高纯水定容至425μl。摇匀静置0.5min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

②向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4的tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入50μl梯度浓度(0.9-90μm)atp溶液作为磷光恢复剂，加高纯水定容至475μl，反应30min后，加入25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液。摇匀静置0.5min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

实例10

1.合成方法参照实施例一；

2.采用磷光发为检测手段，用mpa包覆的mn掺杂zns量子点对atp进行特异性检测：

①向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4的tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液，加高纯水定容至425μl。摇匀静置25min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

②向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4的tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入50μl梯度浓度(0.9-90μm)atp溶液作为磷光恢复剂，加高纯水定容至475μl，反应30min后，加入25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液。摇匀静置25min后,荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm。

通过实施例2、3、4，优化不同浓度的量子点，得到最优量子点浓度200mg/l，通过实施例3、5、6中，优化不同ph值，选择的最优的ph值为7.4，通过实例3、7、8中，优化不同浓度atp适配体，选择的最优atp适配体为50μl4μm，通过实例3、9、10中，优化反应时长，选择的最优反应时长为20min。

在优化atp适配体浓度的过程中，得到如图4所示的加入不同浓度atp适配体后mn掺杂zns磷光量子点磷光猝灭优化图，由图4中可得出，atp适配体在反应体系中的浓度大于等于0.4μm时，磷光强度趋于直线稳定，由此得到最优atp适配体在反应体系中的最优浓度为0.4μm。

基于上述筛选条件，向离心管中依次加入50μl(0.02mol/l)ph＝7.4tris-hcl缓冲溶液，再向其中加入50μl4μmatp适配体溶液作为磷光猝灭剂，加入50μl梯度浓度(0.9-90μm)atp溶液作为磷光恢复剂，加高纯水定容至475μl,反应30min后，加入25μl200mg/lmpa包覆的mn掺杂zns量子点母液。摇匀静置20min后，将荧光分光光度计调成磷光法的检测模式，设置激发波长为315nm，测定磷光强度，可得到如图5所示的线性拟合图，得到方程y＝317.7+0.015x，r²＝0.95。

本专利受到国家自然科学基金面上项目21375089、天津市“131”创新型人才培养工程第一层次项目zx110185、天津市自然科学基金青年项目(17jcqnjc05800)、天津师范大学博士基金项目(52xb1510)的资助。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。