一种用于检测牛乳品中A2β-酪蛋白含量的特征肽及方法与流程

本发明涉及食品检测
技术领域：
，尤其涉及一种用于检测牛乳品中a2β-酪蛋白含量的特征肽及方法。
背景技术：
：牛β-酪蛋白是牛奶中的主要乳蛋白之一，约占鲜奶蛋白质的15％～25％。牛β-酪蛋白具有非常优秀的消化性和低过敏性，可以防止活性蛋白的变异，亦可以促进某些营养成分(如钙、磷、必需氨基酸等)的吸收。β-酪蛋白由226个氨基酸残基组成，包含a1、a2、a3等多种变异体，其中a1、a2为最主要的变异体。a2β-酪蛋白是牛β-酪蛋白的天然原型。最初，所有家牛只含有a2类β-酪蛋白，后因基因突变出现了a1蛋白质的变体。a1β-酪蛋白和a2β-酪蛋白的结构存在差异，a1β-酪蛋白在67号位氨基酸上发生变异，由原来的羟脯氨酸p变异为组氨酸h。研究表明，a1β-酪蛋白在消化过程中可生成β-酪啡肽-7(bcm-7)，而a2β-酪蛋白则不会生成；然而bcm-7被部分研究认为可能是诱发糖尿病，影响免疫系统和心血管系统发育的因素。乳制品中高含量的a1对于婴幼儿早期的生长发育具有潜在的风险性。申请公布号为cn101339158a的发明专利申请文献公开了一种利用毛细管电泳检测乳中β-酪蛋白含量的方法，该方法包括以下步骤：将需要检测的乳样品与样品缓冲液进行混合处理，将混合处理之后的样品通过毛细管电泳仪进行检测，所述样品缓冲液的配制方法是：三甲基氨基甲烷缓冲液加3-吗啉代丙烷磺酸、乙二胺四乙酸二钠、尿素，处理样品时再添加β-巯基乙醇，甲基羟乙基纤维素。其中乳样品处理的步骤包括乳样品的离心处理，取离心处理后的样品上清液与样品缓冲液混合，再经超声波清洗。申请公布号为cn106198692a的发明专利申请文献公开了一种检测牛乳中a1β-酪蛋白及a2β-酪蛋白的方法。该方法包括：(1)将待测样品依次进行加热、离心、冷冻及解冻，以便得到待测储备液；(2)将所述待测储备液进行预处理，以便得到待测液，其中，所述预处理包括将所述待测储备液与预处理液进行混合；以及(3)利用毛细管电泳法对所述待测液进行检测，以便确定牛乳中是否含有a1β-酪蛋白及a2β-酪蛋白。目前，关于a2β-酪蛋白的检测方法仍然较为缺乏。因此，有必要建立一种可以精确定性定量a2β-酪蛋白的检测方法，该方法无论是对于食品安全方面还是对于市场监管领域都具有深远的意义。技术实现要素：本发明提供了一种用于检测牛乳品中a2β-酪蛋白的含量特征肽以及利用该特征肽检测牛乳品中a2β-酪蛋白含量的方法，该特征肽和方法能够准确检测乳品中a2β-酪蛋白的含量，具有较高的特异性、灵敏度、回收率和精密度。具体技术方案如下：一种用于检测牛乳品中a2β-酪蛋白含量的特征肽，其氨基酸序列为ihpfaqtqslvypfpgpipnslpqnippltqtpvvvppflqpevmgvsk。经检测，其他牛乳蛋白中均不含有与该肽段氨基酸序列一致的肽段。该特征肽经化学合成获得，而经化学合成、纯化后的产品纯度可以达到95％以上，在本发明中作为肽段标准品使用。本发明中所述的a2β-酪蛋白指牛a2β-酪蛋白。基于上述特征肽，本发明又提供了一种用于检测牛乳品中a2β-酪蛋白含量的内标肽，其氨基酸序列为ihpfaqtqs(l*)vypfpgpipns(l*)pqnipp(l*)tqtpvvvppf(l*)qpevmgvsk。该内标肽组合添加至待测样品中，起到对检测结果进行校正的目的。本发明还提供了一种液质联用检测牛乳品中a2β-酪蛋白含量的试剂盒，包括a2β-酪蛋白特征肽和a2β-酪蛋白内标肽；所述a2β-酪蛋白特征肽的氨基酸序列为ihpfaqtqslvypfpgpipnslpqnippltqtpvvvppflqpevmgvsk，所述a2β-酪蛋白内标肽的氨基酸序列为ihpfaqtqs(l*)vypfpgpipns(l*)pqnipp(l*)tqtpvvvppf(l*)qpevmgvsk。四种肽段的质谱碎片信息见附图1。上述试剂盒可以在定量检测牛乳品中a2β-酪蛋白中应用。本发明文本中，同位素标记的a2β-酪蛋白内标肽，也可称为a2β-酪蛋白特征肽同位素内标、内标a2β-酪蛋白特征肽或a2β-酪蛋白内标特征肽。本发明还提供了一种液质联用检测牛乳品中a2β-酪蛋白含量的方法，该方法可以采用方案a或方案b中的任意一种，也可将方案a和方案b进行组合：其中，方案a：(1)取待检测的样品，用水稀释，依次经变性处理、胰蛋白酶酶解处理、二甲基化处理后，终止反应，得到预处理后的样品溶液；(2)取如权利要求1所述特征肽的标准品，依次经变性处理、胰蛋白酶酶解处理、二甲基化处理后，得到二甲基化的内标肽溶液；(3)将所述的内标肽溶液加入至所述样品溶液中混合，得到待测样品；(4)采用高效液相色谱-质谱联用技术对所述待测样品进行检测；(5)根据检测结果，计算待测样品中如权利要求1所述的a2β-酪蛋白特征肽与其相对应的内标肽的峰面积比；(6)将所述峰面积比代入标准曲线中，计算得到待测样品中a2β-酪蛋白特征肽的浓度，最后计算得到样品中a2β-酪蛋白的含量。方案b：(a)取待检测的样品，用水稀释，加入如权利要求2所述内标肽的标准品，依次经变性处理、胰蛋白酶酶解处理后，终止反应，得到待测样品；(b)采用高效液相色谱-质谱联用技术对所述待测样品进行检测；(c)根据检测结果，计算待测样品中如权利要求1所述的a2β-酪蛋白特征肽与其相对应的内标肽的峰面积比；(d)将所述峰面积比代入标准曲线中，计算得到待测样品中a2β-酪蛋白特征肽的浓度，最后计算得到样品中a2β-酪蛋白的含量。进一步地，所述样品为生鲜牛乳或牛乳制品；具体地，所述牛乳制品为、婴幼儿配方粉、脱脂乳粉、全脂乳粉、高温杀菌奶、巴氏消毒奶、发酵型酸奶等奶牛或牦牛乳制品。步骤(1)和步骤(a)中，所述变性处理是添加碘乙酰胺(iaa)使蛋白质完全变性；所述胰蛋白酶酶解处理过程中，添加二硫苏糖醇(dtt)可水解二硫键破坏蛋白质的空间结构；所述酶解采用的是胰蛋白酶；所述二甲基化处理过程中添加甲醛溶液和氰基硼氢化钠溶液。本方法应用胰蛋白酶只作用于精氨酸(r)和赖氨酸(k)的专一性的特点，把a2β-酪蛋白切成几百至上千道尔顿的肽段分子，从中选择a2β-酪蛋白所独有的特征分子作为特征肽，经合成和提纯高纯度特征肽作为定量标准品参与检测方法中。作为优选，步骤(4)和步骤(b)中，高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：acquitybeh300c18柱(1.7μm，2.1×100mm)；柱温：15℃；进样体积：10μl；样品温度：15℃；流动相a：0.1％甲酸-水，流动相b：0.1％甲酸-乙腈，流速为0.4ml/min。作为优选，步骤(4)和步骤(b)中，质谱的条件为：电喷雾离子源电离模式：esi+；质谱扫描方式：多反应监测(mrm)；毛细管电压：3.5kv；锥孔电压：30v；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：500℃；脱溶剂气流量：800l/min；锥孔反吹气流量：50l/hr。进一步地，步骤(6)中，所述标准曲线由以下方法获得：将特征肽配制成系列浓度的标准溶液，经步骤(2)得到内标肽溶液，再经高效液相色谱-质谱联用技术分析，计算得到各标准品中a2β-酪蛋白特征肽与其相对应的内标肽的峰面积，绘制得到标准曲线。进一步地，步骤(d)中，所述标准曲线由以下方法获得：将特征肽配制成系列浓度的标准溶液，加入内标肽后经液相色谱串联质谱分析，计算得到各标准品中a2β-酪蛋白特征肽与相应的内标肽的峰面积，绘制得到标准曲线。本发明采用以同位素肽段作为内标的同位素稀释法或者以肽段同位素二甲基衍生化作为内标的同位素稀释法与高效液相色谱-质谱联用技术进行结合，可使检测结果更为准确和可靠，有效降低样品处理过程中存在样品损失、高校液相色谱回收率存在损失和波动等问题所带来的影响。具体地，内标法计算过程如下：(a)将a2β-酪蛋白特征肽配制成系列浓度的标准工作曲线溶液，重复所述方法中的步骤(1)～(3)或者步骤(a)，进行分离检测，根据得到的标准工作曲线中的a2β-酪蛋白特征肽与其相对应的内标同位素特征肽的峰面积比与对应的溶液浓度进行线性回归，得出a2β-酪蛋白特征肽的方程y＝kx+b；其中，y为a2β-酪蛋白特征肽与其相对应的内标特征肽的峰面积比，x为a2β-酪蛋白特征肽的浓度，单位为nmol/l；k为线性方程斜率；b为线性方程的截距。(b)将所述方法步骤(4)或(b)中得到的峰面积比代入上述方程中，计算得到a2β-酪蛋白特征肽的浓度；再将所述浓度带入含量计算公式中，得到最终计算得到样品中a2β-酪蛋白特征肽的含量；所述公式为cx＝na×m×n×10-10；其中，cx为待检测的样品中a2β-酪蛋白特征肽的含量，单位为g/100g；na为待检测的样品中a2β-酪蛋白特征肽的浓度；m为a2β-酪蛋白特征肽的分子量，a1为25422，a2为25382；n为样品稀释倍数。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明通过筛选牛a2β-酪蛋白的特征肽，并设获取对应的内标肽，并采用高效液相色谱与质谱联用的分析技术，实现了牛乳品中a2β-酪蛋白的定量，该方法具有较好的线性、灵敏度、回收率和精密度。(2)本发明选择牛a2β-酪蛋白中的特征肽段作为检测物质，适用于变性蛋白的检测，可以满足样品中的变性与非变性蛋白的同时检测，保证了方法的准确性。附图说明图1为实施例1中牛a2β-酪蛋白特征肽和牛a2β-酪蛋白的内标同位素特征肽的质谱鉴别图；其中，a为牛a2β-酪蛋白特征肽；b为牛a2β-酪蛋白内标特征肽。图2为实施例1中牛a2β-酪蛋白特征肽和牛a2β-酪蛋白的内标同位素特征肽的色谱分离图；其中，a为牛a2β-酪蛋白特征肽；b为牛a2β-酪蛋白内标特征肽。图3为实施例2中二甲基化的牛a2β-酪蛋白特征肽和同位素二甲基化的牛a2β-酪蛋白内标特征肽的质谱鉴别图；其中，a为牛a2β-酪蛋白特征肽；b为牛a2β-酪蛋白内标特征肽。图4为实施例2中二甲基化的牛a2β-酪蛋白特征肽和同位素二甲基化的牛a2β-酪蛋白内标特征肽的色谱分离图；其中，a为牛a2β-酪蛋白特征肽；b为牛a2β-酪蛋白内标特征肽。具体实施方式下面结合具体实施方式和附图说明对本发明进行详细阐述。本发明采用的仪器设备、化学试剂，具体如下：超高效液相色谱串联静电场轨道阱质谱(uhplc-orbitrap-ms，thermofisher公司，美国)；超高效液相色谱串联四级杆质谱(uplc-tq-ms，waters公司，美国)；刀式混和研磨仪gm200(retsch公司，德国)；球磨仪mm400(retsch公司，德国)；l-8900全自动氨基酸分析仪(日立hitachi公司，日本)。下列实施例中采用的a2β-酪蛋白特征肽段标准品，纯度大于95％。内标a2β-酪蛋白特征肽(又称为：a2β-酪蛋白特征肽同位素内标，或简称为：a2β-酪蛋白内标肽)，纯度大于90％。a2β-酪蛋白特征肽的氨基酸序列为ihpfaqtqslvypfpgpipnslpqnippltqtpvvvppflqpevmgvsk，a2β-酪蛋白内标肽的氨基酸序列为ihpfaqtqs(l*)vypfpgpipns(l*)pqnipp(l*)tqtpvvvppf(l*)qpevmgvsk。下列实施例采用的液相色谱条件和质谱条件如下：色谱条件：(1)硅烷基c18柱，柱长100mm，柱内径2.1mm；填料粒径1.7μm，孔径或等效者，柱温15℃；(2)流动相a相0.1％甲酸-水；b相0.1％甲酸-乙腈；(3)梯度洗脱：参考梯度洗脱程序见表1；表1流动相梯度洗脱条件时间(min)流动相a(％,v/v)流动相b(％,v/v)07030170303.460403.501003.901004.070306.07030(4)流动相流速：0.4ml/min；(5)样品温度：15℃；(6)进样体积：10μl。质谱条件：电喷雾模式：esi+；质谱扫描方式：多反应监测(mrm)；毛细管电压：3.5kv；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：500℃；脱溶剂气流量：800l/min；锥孔反吹气流量：50l/hr；其它质谱参数见表2、表3。表2同位素多肽法主要参考质谱参数表3二甲基化同位素内标法主要参考质谱参数注：表中带*为定量离子；不同质谱仪器，质谱参数条件可能存在差异，测定前应将质谱条件优化到最佳。内标法计算过程如下：(a)将a2β-酪蛋白特征肽配制成系列浓度的标准工作曲线溶液，经过与样品相同的处理过后，在相同液相色谱质谱条件下进行分离检测，根据得到的标准工作曲线中的a2β-酪蛋白特征肽与其相对应的二甲基化同位素标记的内标特征肽的峰面积比，与对应的溶液浓度进行线性回归，得出a2β-酪蛋白特征肽的方程y＝kx+b；其中，y为a2β-酪蛋白特征肽与其相对应的内标特征肽的峰面积比，x为a2β-酪蛋白特征肽的浓度，单位为nmol/l；k为线性方程斜率；b为线性方程的截距。(b)将预处理后待测样品中测得的a2β-酪蛋白特征肽与其相对应的二甲基化同位素标记的内标特征肽的峰面积比代入上述方程中，计算得到a2β-酪蛋白特征肽的浓度；再将所述浓度带入含量计算公式中，得到最终计算得到样品中a2β-酪蛋白特征肽的含量；所述公式为cx＝na×m×n×10-10；其中，cx为待检测的样品中a2β-酪蛋白特征肽的含量，单位为g/100g；na为待检测的样品中a2β-酪蛋白特征肽的浓度；m为a2β-酪蛋白特征肽的分子量，a1为25422，a2为25382；n为样品稀释倍数。实施例1同位素二甲基化内标法方法学验证1、样品的预处理：(a)取a2β-酪蛋白特征肽标准品5mg至10ml容量瓶中，加水定容至10ml混匀，作为a2β-酪蛋白特征肽标准母液。取a2β-酪蛋白特征肽标准母液各1ml至10ml容量瓶中，加水定容至10ml混匀，作为a2β-酪蛋白特征肽标准溶液。(b)取a2β-酪蛋白特征肽标准溶液5、10、20、50、100、200、400μl至1ml容量瓶，加水定容至1ml。作为a2β-酪蛋白特征肽标准曲线溶液1、2、3、4、5、6、7。(c)依据方法学考察内容选择步骤(a)(b)中相关溶液100μl，至于2ml离心管中，向离心管中加入500μl100mmol/l碳酸氢钠溶液和100μl100mmol/l二硫苏糖醇溶液，混匀后于70℃恒温反应30min；冷却至室温，加入100μl300mmol/l碘代乙酰胺溶液，暗处静置30min；再加入100μl100mg/l碱性胰蛋白酶溶液(1g酶/300g蛋白)，混匀，加入100μl超纯水，于37℃恒温酶解4h，室温下静置10min，然后10000r/min离心10min。(d)取步骤(c)中离心后的下层清液100μl于2ml离心管中，加入4μl4％(v/v)甲醛溶液(同位素甲醛)和4μl0.6mol/l氰基硼氢化钠溶液，混匀，室温下进行二甲基化反应1h；然后加入16μl1％(v/v)氨水溶液，混匀，再加入10μl甲酸，混匀。(e)将步骤(d)获得的溶液室温下静置1h，移取溶液50μl至进样瓶，与50μl经相同处理的同位素标记的二甲基化的内标特征肽混合，得到待测样品。其中，同位素标记的二甲基化的内标特征肽指二甲基化的内标a2β-酪蛋白特征肽；以待测样品计，内标a2β-酪蛋白特征肽的添加量为23.6μg；相同处理指重复步骤(c)(d)的内容。2、高效液相色谱-质谱联用技术的检测和结果计算检测结果如下：(1)重现性计算：取a2β-酪蛋白特征肽标准曲线溶液2、5、7作为低浓度重现性考察点，中等浓度重现性考察点，高浓度重现性考察点，重复上述(c)～(e)内容，平行5次检测，得到a2β-酪蛋白特征肽低、中、高浓度rsd分别为6.9％、2.0％、2.8％。(2)线性计算：取a2β-酪蛋白特征肽标准曲线溶液重复上述(c)～(e)内容，进行线性考察，得到a2β-酪蛋白特征肽线性方程相关系数为0.9953。(3)回收率计算：取基质奶粉2g，至于50ml烧杯中，用50ml水分次将试样充分溶解后转移到100ml容量瓶中，用水定容至刻度(最终溶液中蛋白质浓度约为3mg/ml)，必要时置于涡旋混合器上充分涡旋溶解。取100μl，至于2ml离心管中，加入100μla2β-酪蛋白特征肽标准曲线溶液2或5或7，作为低浓度加标、中等浓度加标、高浓度加标，向离心管中加入500μl100mmol/l碳酸氢钠溶液和100μl100mmol/l二硫苏糖醇溶液，混匀后于70℃恒温反应30min；冷却至室温，加入100μl300mmol/l碘代乙酰胺溶液，暗处静置30min；再加入100μl100mg/l碱性胰蛋白酶溶液(1g酶/300g蛋白)，混匀，于37℃恒温酶解4h，室温下静置10min，然后10000r/min离心10min。重复步骤(d)(e)的内容，进行回收率考察。得到a2β-酪蛋白特征肽低中高浓度回收率分别为114.4％、106.1％、108.6％。实施例2同位素多肽内标法方法学验证1、样品的预处理：(a)取a2β-酪蛋白特征肽标准品5mg至10ml容量瓶中，加水定容至10ml混匀，作为a2β-酪蛋白特征肽标准母液。取a2β-酪蛋白特征肽标准母液各1ml至10ml容量瓶中，加水定容至10ml混匀，作为a2β-酪蛋白特征肽标准溶液。(b)取a2β-酪蛋白特征肽混合标准溶液5、10、20、50、100、200、400μl至1ml容量瓶，加水定容至1ml。作为a2β-酪蛋白特征肽标准曲线溶液1、2、3、4、5、6、7。(c)依据方法学考察内容选择步骤(a)(b)中相关溶液100μl，至于2ml离心管中，加入100μl内标溶液，加入500μl100mmol/l碳酸氢钠溶液和100μl100mmol/l二硫苏糖醇溶液，混匀后于70℃恒温反应30min；冷却至室温，加入100μl300mmol/l碘代乙酰胺溶液，暗处静置30min；再加入100μl100mg/l碱性胰蛋白酶溶液(1g酶/300g蛋白)，混匀，加入100μl超纯水，于37℃恒温酶解4h，室温下静置10min，然后10000r/min离心10min，得到待测样品。2、高效液相色谱-质谱联用技术的检测和结果计算检测结果如下：(1)重现性计算：取a2β-酪蛋白特征肽标准曲线溶液2、5、7作为低浓度重现性考察点，中等浓度重现性考察点，高浓度重现性考察点，重复上述(c)内容，平行5次检测，得到a2β-酪蛋白特征肽低、中、高浓度rsd分别为3.6％、1.1％、1.0％。(2)线性计算：取a2β-酪蛋白特征肽所有标准曲线溶液重复上述(c)内容，进行线性考察，得到a2β-酪蛋白特征肽线性方程相关系数为0.9973。(3)回收率计算：取基质奶粉2g，至于50ml烧杯中，用50ml水分次将试样充分溶解后转移到100ml容量瓶中，用水定容至刻度(最终溶液中蛋白质浓度约为3mg/ml)，必要时置于涡旋混合器上充分涡旋溶解。取100μl，至于2ml离心管中，加入100μla2β-酪蛋白特征肽标准曲线溶液2或5或7，作为低浓度加标、中等浓度加标、高浓度加标，向离心管中加入500μl100mmol/l碳酸氢钠溶液和100μl100mmol/l二硫苏糖醇溶液，混匀后于70℃恒温反应30min；冷却至室温，加入100μl300mmol/l碘代乙酰胺溶液，暗处静置30min；再加入100μl100mg/l碱性胰蛋白酶溶液(1g酶/300g蛋白)，混匀，于37℃恒温酶解4h，室温下静置10min，然后10000r/min离心10min。进行回收率考察。得到a2β-酪蛋白特征肽低、中、高浓度回收率分别为97.9％、104.6％、97.1％。实施例3市售a2婴儿配方粉的检测1、样品的预处理：1.1以同位素特征肽作为内标定量(a)取a2三段婴儿配方粉2g，至于50ml烧杯中，用50ml水分次将试样充分溶解后转移到100ml容量瓶中，用水定容至刻度(最终溶液中蛋白质浓度约为3mg/ml)，必要时置于涡旋混合器上充分涡旋溶解；(b)取步骤(a)所得溶液100μl，至于2ml离心管中，加入100μl内标溶液(内标a2β-酪蛋白特征肽)，加入500μl100mmol/l碳酸氢钠溶液和100μl100mmol/l二硫苏糖醇溶液，混匀后于70℃恒温反应30min；冷却至室温，加入100μl300mmol/l碘代乙酰胺溶液，暗处静置30min；再加入100μl100mg/l碱性胰蛋白酶溶液(1g酶/300g蛋白)，混匀，加入100μl超纯水，于37℃恒温酶解4h，室温下静置10min，然后10000r/min离心10min，得到待测样品。1.2以同位素二甲基化衍生物作为内标定量(1)取a2三段婴儿配方粉2g，于50ml烧杯中，用50ml水分次将试样充分溶解后转移到100ml容量瓶中，用水定容至刻度(最终溶液中蛋白质浓度在3mg/ml)，必要时置于涡旋混合器上充分涡旋溶解；(2)取步骤(1)所得溶液100μl，于2ml离心管中，向离心管中加入500μl100mmol/l碳酸氢钠溶液和100μl100mmol/l二硫苏糖醇溶液，混匀后于70℃恒温反应30min；冷却至室温，加入100μl300mmol/l碘代乙酰胺溶液，暗处静置30min；再加入100μl100mg/l碱性胰蛋白酶溶液(1g酶/300g蛋白)，混匀，加入100μl超纯水，于37℃恒温酶解4h，室温下静置10min，然后10000r/min离心10min；(3)取步骤(2)中离心后的下层清液100μl于2ml离心管中，加入4μl4％(v/v)甲醛溶液(同位素甲醛)和4μl0.6mol/l氰基硼氢化钠溶液，混匀，室温下进行二甲基化反应1h；然后加入16μl1％(v/v)氨水溶液，混匀，再加入10μl甲酸，混匀；(4)将步骤(3)获得的溶液室温下静置1h，移取溶液50μl至进样瓶，与50μl经相同处理(步骤(1)～(3))的同位素标记的二甲基化的内标特征肽混合，得到待测样品；其中，同位素标记的二甲基化的内标特征肽指二甲基化的内标a2β-酪蛋白特征肽。3、高效液相色谱-质谱联用技术的检测和结果计算(内容如上文所述)，检测结果如下：表4不同定量方法检测婴儿配方粉的结果实验结果经过t检验结果均>0.05，不存在显著性差异。奶粉样包装标示值显示，奶粉样1中a2β-酪蛋白含量为1.3g/100g，奶粉样2中a2β-酪蛋白含量为2.7g/100g，奶粉样3中a2β-酪蛋白含量为3.5g/100g。结果表明，同位素多肽法与同位素二甲基化法所检测到的a2β-酪蛋白含量结果相近，同位素多肽法的结果相对标准偏差更小，实验步骤更简单，更加适宜相对标准化的检测。同位素二甲基化法不需要对应合成同位素肽段，更适宜实验初期研究。实施例4牦牛奶的检测1、样品的预处理：(a)取牦牛奶样品10g，至于50ml烧杯中，用50ml水分次将试样充分溶解后转移到100ml容量瓶中，用水定容至刻度(最终溶液中蛋白质浓度在3mg/ml)，必要时置于涡旋混合器上充分涡旋溶解；(b)取步骤(a)所得溶液100μl，至于2ml离心管中，向离心管中加入500μl100mmol/l碳酸氢钠溶液和100μl100mmol/l二硫苏糖醇溶液，混匀后于70℃恒温反应30min；冷却至室温，加入100μl300mmol/l碘代乙酰胺溶液，暗处静置30min；再加入100μl100mg/l碱性胰蛋白酶溶液(1g酶/300g蛋白)，混匀，加入100μl超纯水，于37℃恒温酶解4h，室温下静置10min，然后10000r/min离心10min；(c)取步骤(b)中离心后的下层清液100μl于2ml离心管中，加入4μl4％(v/v)甲醛溶液(同位素甲醛)和4μl0.6mol/l氰基硼氢化钠溶液，混匀，室温下进行二甲基化反应1h；然后加入16μl1％(v/v)氨水溶液，混匀，再加入10μl甲酸，混匀；(d)将步骤(c)获得的溶液室温下静置1h，移取溶液50μl至进样瓶，与50μl经相同处理的同位素标记的二甲基化的内标特征肽混合，得到待测样品；其中，同位素标记的二甲基化的内标特征肽指二甲基化的内标a2β-酪蛋白特征肽；以待测样品计，内标a2β-酪蛋白特征肽的添加量为23.6μg；相同处理指重复步骤(a)～(c)的内容。2、高效液相色谱-质谱联用技术的检测和结果计算(内容如上文所述)检测结果如下：该牦牛奶样品中牛a2β-酪蛋白含量为0.658g/100g；rsd为6.3％。序列表<110>杭州璞湃科技有限公司<120>一种用于检测牛乳品中a2β-酪蛋白含量的特征肽及方法<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>49<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ilehisprophealaglnthrglnserleuvaltyrpropheprogly151015proileproasnserleuproglnasnileproproleuthrglnthr202530provalvalvalpropropheleuglnprogluvalmetglyvalser354045lys当前第1页12