一种利用响应面法结合遗传算法和直接搜索算法优化的北沙参糖类化合物的提取方法与流程

本发明属于化合物提取技术领域，具体涉及一种利用响应面法结合遗传算法和直接搜索算法优化的北沙参糖类化合物的提取方法。

背景技术

北沙参(radixglehniae)是伞形科植物珊瑚菜glehnialittoralisfr.schmidtexmiq的干燥根。该品性甘，味微苦、微寒，有养阴清肺、益胃生津的作用，对于治疗肺热燥咳、热病津伤、唠嗽痰血、口渴等病症，是我省道地药材之一。北沙参的主要化学成分为糖类、香豆素类、磷脂、生物碱、氨基酸、挥发油、微量元素等。其中，糖类成分含量最高。另外，有研究表明北沙参糖类化合物可增强体液免疫和细胞免疫功能，具有免疫活性。因此，北沙参的主要成分（含量高）和重要免疫活性成分——糖类化合物具有重要的研究价值，对北沙参糖类化合物进行提取条件的优化研究成为必要。

文献《星点设计-响应面法优化热水浸提北沙参多糖的工艺研究》及《响应面法优化北沙参中糖类的提取工艺研究》提供了一种采用响应面法进行糖类化合物提取的工艺优化方法，但是，两种都方法都仅单纯的采用响应面法进行工艺优化，方法中各因素的波动对效应值的影响不明确，实际应用过程中，为了达到较高的效应值，需要对各因素进行精确的控制，增加了工艺控制的难度，目前存在的方法中，针对此类问题，还没有更好的解决方法。研究一种提取工艺更加优化的方法对于药材北沙参糖类化合物的提取具有重要的价值和意义。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用响应面法结合遗传算法和直接搜索算法优化的北沙参糖类化合物的提取方法。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种利用响应面法结合遗传算法和直接搜索算法优化的北沙参糖类化合物的提取方法，包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备：称取50-200目北沙参粉末5g，以水料比10-60ml/g热水回流提取1-3次，提取时间为1-6h，提取液滤、合并后，离心，吸取上清液定容至500ml容量瓶，从中精密量取4ml定容至250ml容量瓶；充分混匀后从中精密吸取1ml入干燥洁净的具塞试管中，平行3支试管，继续进行蒽酮-硫酸反应，然后在590nm下测定供试品溶液的吸光度，每个样品测定两次，以吸光度的平均值计算提取率结果；

（2）标准曲线的制作：称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖0.5g，用纯净水稀释并定容至100ml容量瓶，从中吸取1ml再用纯净水定容至50ml容量瓶，得到浓度为0.1mg/ml的葡萄糖标准溶液；分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml葡萄糖标准溶液，每组平行3支试管，每支试管分别补加纯净水至液体总体积为1.2ml，同时取1.2ml纯净水作空白对照，分别加入4ml蒽酮试剂，迅速浸入冰水浴中冷却，充分振摇后，各试管同时浸入沸水浴中，管口加盖开始反应，反应10分钟，振摇均匀、冷却、室温放置10分钟后，获得标准样品，并在590nm检测波长下，测定各标准样品的吸光度;每个样品测定两次，以吸光度的平均值为纵坐标，以葡萄糖的浓度c（mg/ml）为横坐标，得葡萄糖的标准曲线方程；

（3）实验设计与统计分析：①单因素试验：以药材粒度、提取时间、水料比及提取次数为参数进行单因素试验，利用蒽酮-硫酸法测定北沙参提取物中的糖类化合物含量，计算北沙参糖类化合物提取率（%），计算公式为：提取率（%）=糖类化合物的质量浓度*溶液的体积*稀释倍数/北沙参药材的质量*100；②bbd-响应面法优化分析：在单因素试验的基础上，使用软件design-expert8.0.5b，以北沙参糖类化合物的提取率为响应值（y），选取提取过程中效果影响显著的药材粒度（a）、提取时间（b）和水料比（c）三因素为自变量，建立多元二次回归方程：y=-69.04440+0.88849a+14.07365b+0.49493c-0.040163ab-0.0000804375ac+0.055938bc-0.00232195a²-1.47066b²-0.00669713c²（r²=0.8915，p=0.0115）；

进行软件分析，得响应曲面图和等高线图；

（4）遗传算法搜索分析：以bbd二项式拟合方程为目标函数，使用软件matlab2014b，采用遗传算法搜索北沙参糖类化合物的最佳提取条件，搜索过程使用遗传算法工具gui，设置参数，随机搜索10次，验证分析；

（5）直接搜索法搜索分析：以二项式拟合方程为目标函数，使用软件matlab2014b，采用直接搜索算法搜索北沙参糖类化合物的最佳提取条件，搜索过程使用模式搜索工具gui，设置参数，随机搜索10次，验证分析。

进一步的，步骤（4）中，所述遗传算法的搜索过程使用遗传算法工具gui，设置参数如下所示：

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进一步的，步骤（5）中，所述直接搜索法的搜索过程使用模式搜索工具gui，设置参数如下：

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本发明通过优化后，最优化的提取方法为：取北沙参药材饮片，粉碎为粒度150目的粉末，精密称取北沙参药材粉末，热水回流提取，水料比为49∶1ml/g，提取液滤过后离心分离，留存上清液，沉淀部分加水重复上次提取过程，加水量相同，每次提取时间均为3.2h，共提取2次。

进一步的，所述离心分离的条件为在4000r/min，离心15min。

本发明的有益效果为：

（1）本发明先采用bbd-响应面优化法建立数学模型、获得目标函数后，使用遗传算法及直接搜索算法搜索各因素的精确最优值，将三种方法联合使用，以得到最佳优化结果，克服了现有的三种方法所存在的局限性。

（2）bbd-响应面优化法可将复杂的未知函数关系在小区域内用简单的模型来拟合，计算简便、可减少试验次数、降低成本等，具有可连续对实验各水平进行分析的优势。遗传算法借鉴了生物界自然选择和自然遗传的机制，使原始数据在迭代过程中产生遗传和变异，并从全局的角度去寻找最优实验条件，可有效避免最优实验条件选取时的主观性和局部最优解问题。直接搜索算法可以作为其他优化方法的一个补充，实现的是模式搜索方法，可搜索出最大、最小正基模式，处理边界约束、线性等式、线性不等式，并且不需要函数可微或连续。

（3）通过本发明优化的提取方法，能够实现对北沙参糖类化合物进行最大程度的提取，具有重要的研究意义。

附图说明

图1为实施例1中单因素考察结果。

其中，a为不同粒度北沙参样品的提取率结果；b为不同提取时间北沙参样品的提取率结果；c为不同水料比北沙参样品的提取率结果；d为不同提取次数北沙参样品的提取率结果。

图2为实施例1中提取时间和药材粒度对北沙参糖类化合物提取率的影响图。

图3为实施例1中水料比和药材粒度对北沙参糖类化合物提取率的影响图。

图4为实施例1中水料比和提取时间对北沙参糖类化合物提取率的影响图。

图5为实施例1中通过遗传算法所得最佳适应度曲线。

图6为实施例1中直接搜索算法所得模式搜索结果图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的试验方案做进一步的解释和说明。

本发明所使用的仪器与材料

1、仪器

bt125d电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），紫外-可见分光光度仪uv-250（岛津公司），dk-s24型恒温水浴锅（上海森信实验有限公司），kdm-a控温电热套（金坛市仪器医疗厂），dgg-9123a型干燥箱（上海森信实验仪器有限公司），fw-80高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司），tdl40b低速离心机（上海安亭科学仪器厂），纯水超纯水一体机（摩尔公司）。

2、材料

北沙参药材购自济南市建联中药店，经山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴定为伞形科植物珊瑚菜（glehnialittoralisfr.schmidtexmip.）的干燥根；葡萄糖对照品（10010518）、蒽酮和浓硫酸均购自国药集团化学试剂有限公司。

实施例1

（1）北沙参糖类化合物提取率的测定

本试验采用蒽酮-硫酸法测定北沙参糖类化合物的提取率。

（2）试剂的配制

蒽酮试剂的配制：称取0.16g蒽酮溶解于80ml浓硫酸中，用玻璃棒缓缓搅动使其溶解，使用时需要当日配制使用。

（3）检测波长的选择及葡萄糖溶液标准曲线的建立

称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖0.5g，用纯净水稀释并定容至100ml容量瓶，从中吸取1ml再用纯净水定容至50ml容量瓶，得到浓度为0.1mg/ml的葡萄糖标准溶液。分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml葡萄糖标准溶液入洁净干燥的具塞试管，每组平行3支试管，每支试管分别补加纯净水至液体总体积为1.2ml，同时取1.2ml纯净水作空白对照。

将各试管按顺序编号，分别加入4ml蒽酮试剂，迅速浸入冰水浴中冷却，充分振摇后，各试管同时浸入沸水浴中，管口加盖开始反应。准确反应10分钟。振摇均匀、冷却、室温放置10分钟后，获得标准样品。使用紫外-可见分光光度仪进行400~900nm范围的波长扫描，获得最佳检测波长。并在该检测波长下，测定各标准样品的吸光度。每个样品测定两次，以吸光度的平均值为纵坐标，以葡萄糖的浓度c（mg/ml）为横坐标，计算得葡萄糖的标准曲线方程、线性关系及线性范围结果。

波长扫描结果可知，最佳检测波长为590nm。计算可知，标准曲线为y=8.9463x+0.0341，r²=0.9945，r=0.9972＞0.995，说明线性关系良好，且线性范围为16.82～100.92ug/ml。

（4）供试品溶液的制备

精密称取北沙参粉末5g，热水回流提取，提取液滤过、合并后，离心（4000r/min，15min），吸取上清液定容至500ml容量瓶，从中精密量取4ml定容至250ml容量瓶。充分混匀后从中精密吸取1ml入干燥洁净的具塞试管中，平行3支试管，继续进行蒽酮-硫酸反应。反应过程同（3）中从“将各试管按顺序编号，分别加入4ml蒽酮试剂”始，至“获得被测定样品”止。然后在590nm下测定供试品溶液的吸光度，每个样品测定两次，以吸光度的平均值计算提取率结果。

（5）北沙参糖类化合物提取率的计算

北沙参糖类化合物提取率（%）计算公式为：提取率（%）=糖类化合物的质量浓度*溶液的体积*稀释倍数/北沙参药材的质量*100

（6）单因素考察

①药材粒度对北沙参糖类化合物提取率的影响

北沙参饮片粉碎后过不同目数（50、65、80、100、120、150、200目）的筛网，获得不同粒度的北沙参样品。在保持提取时间为3h、提取次数为1次、水料比为50ml/g不变的条件下，考察北沙参饮片及各不同粒度北沙参样品对北沙参糖类化合物提取率的影响。

直接提取北沙参饮片，所得提取率结果为21.7021%，明显低于各不同粒度北沙参粉末的糖类化合物提取率。各不同粒度北沙参样品的提取率结果由图1（a）所示。可知，提取率随着药材粒度的增加先增加后减小。在药材粒度为150目时，北沙参糖类化合物的提取率最高，继续增加药材的粒度，提取率反而减小的原因可能是由于北沙参粉末粒度过低，使得提取体系黏度变大，糖类化合物的提取率减小。故为高效利用北沙参，选取北沙参的粒度为150目最合适。

②提取时间对北沙参糖类化合物提取率的影响

在保持水料比为50ml/g、提取次数为1次、药材粒度为150目的不变的条件下，测定北沙参在1h、2h、3h、4h、5h、6h提取率，以提取时间对提取率进行单因素试验。

由图1（b）可知，提取率随着提取时间的增大先增大继而趋于平稳，在提取时间为3h时提取率开始趋于平稳。在确保北沙参得到高效利用的同时兼顾节省能源的目的，所以选取提取时间3h最适宜。

③水料比对北沙参糖类化合物提取率的影响

在保持药材粒度为150目、提取次数为1次、提取时间为3h不变的条件下，考察水料比10、20、30、40、50、60ml/g对北沙参糖类化合物提取率的影响。

由图1（c）可知，提取率随着水料比的增大先增大继而趋于平稳，在水料比为50ml/g时开始趋于平稳，选取水料比为50ml/g最为适宜。

④提取次数对北沙参糖类化合物提取率的影响

在保持药材粒度为150目、提取时间为3h、水料比为50ml/g不变的条件下，分别考察北沙参热水回流提取1、2、3次的提取率。（提取次数2次所得的提取率结果为累计两次提取的提取率之和，提取次数3次所得的提取率结果为累计三次提取的提取率之和）。

由图1（d）可知，尽管提取率随着提取次数的增大而增大，但提取3次的累计得率与提取2次的累计得率仅差0.8000773%，并无显著性差异，考虑到经济成本选择提取2次最合适。

（6）bbd-响应面法优化分析

①因素与水平的确定

在单因素试验的基础上，使用软件design-expert8.0.5b，以北沙参糖类化合物的提取率为响应值（y），采用bbd-响应面法进行药材粒度（a）、提取时间（b）和水料比（c）三因素三水平试验。因素与水平设计见表1。bbd试验安排与结果见表2。

表1因素与水平表

表2bbd-响应面法设计方案与结果

②模型拟合

使用软件design-expert8.0.5b对各因素进行模型拟合。软件推荐（suggested）的模型类型为二项式方程拟合（quadratic），拟合方程为y=-69.04440+0.88849a+14.07365b+0.49493c-0.040163ab-0.0000804375ac+0.055938bc-0.00232195a²-1.47066b²-0.00669713c²（r²=0.8915，p=0.0115）。失拟误差的p=0.6522，可知，二项式拟合方程的相关系数较高，二项式模型p<0.05，失拟误差p>0.05，说明模型拟合效果较好，故用该模型进行分析合理。

③方差分析

方差分析结果见表3。

表3方差分析结果

由表3可知，b、a²影响显著，即在三个因素中，提取时间b相对于水料比a和药材粒度c对北沙参糖类化合物的提取率影响更显著。

软件分析可知，北沙参糖类化合物的最佳提取工艺为：药材粒度为187.02目，提取时间为3.17h，料液比为49.04ml/g，在此条件下可获得北沙参糖类化合物的最高预测提取率结果38.402%。

④响应曲面图和等高线图

软件处理后得到了响应曲面图和等高线图，用于分析各因素对北沙参糖类化合物提取率的影响，结果如图2、3、4所示：响应曲面图和等高线图可反映各因素对提取率的影响情况。由图2可知，提取时间和药材粒度等高线的形状为椭圆形，说明提取时间和药材粒度两因素有一定交互作用，提取时间与药材粒度的曲面坡度相差不大，等高线的密度相差也不大，说明提取时间与药材粒度两因素相比，对北沙参糖类化合物提取率的影响差不多；由图3可知，水料比和药材粒度等高线的形状为椭圆形，说明水料比和药材粒度两因素有一定交互作用，水料比的曲面比药材粒度的曲面缓，药材粒度的等高线密度大于水料比，说明药材粒度比水料比对北沙参糖类化合物提取率的影响更大；由图4可知，水料比和提取时间等高线的形状为椭圆形，说明水料比和提取时间两因素有一定交互作用，而水料比的曲面比提取时间的曲面缓，提取时间等高线的密度明显大于水料比，说明提取时间比药材粒度对北沙参糖类化合物的提取影响更大。

（7）遗传算法搜索最佳提取条件

以bbd二项式拟合方程为目标函数，使用软件matlab2014b的gads工具箱，采用遗传算法搜索北沙参糖类化合物的最佳提取条件。搜索过程使用遗传算法工具gui，参数设置见表4。随机搜索10次，结果见表5。所得最佳适应度曲线见图5。

表4遗传算法工具gui参数设置

表5随机搜索结果

由图5可知，在进化约50代后，北沙参糖类化合物提取率的最佳适应度趋于稳定。且由表5数据统计分析可知，10次随机搜索结果的变异范围较小，对目标函数最佳值的逼近程度较好。因此，本试验选择10次随机搜索的平均水平，即药材粒度为159.523377目，提取时间为3.575010h，水料比为50.923100ml/g作为遗传算法优化北沙参糖类化合物的最佳提取条件，预期提取率结果为39.581479%。

（8）直接搜索算法搜索最佳提取条件

以二项式拟合方程为目标函数，使用软件matlab2014b的gads工具箱，采用直接搜索算法搜索北沙参糖类化合物的最佳提取条件。搜索过程使用模式搜索工具gui，随机搜索10次，参数设置见表6。所得模式搜索结果图见图6。

表6直接搜索算法工具gui参数设置

直接搜索算法随机搜索10次后发现，10次结果完全一致：在药材粒度为159.523438目，提取时间为3.575012h，水料比为50.923096ml/g的条件下，预期最佳提取率结果为39.581479%，且10次搜索过程均停止于74代。

（9）结果验证

根据实际情况，确定各提取条件的小数位数，可知bbd-响应面法的优化结果为：药材粒度为150目，提取时间为3.2h，水料比为49ml/g。经遗传算法和直接搜索算法优化的最佳条件相差不大，其共同优化结果为：药材粒度为150目，提取时间为3.6h，水料比为51ml/g。分别按照以上两条件提取北沙参糖类化合物，每个条件平行提取6次。进行统计学配对t检验，可知，两组结果均服从正态分布，且两组结果没有统计学差异（t=-1.021，p=0.354>0.05），即采用bbd-响应面法、遗传算法和直接搜索算法均可较好地对北沙参糖类化合物的提取进行寻优，且无显著差异。

对比例1

若仅采用文献《响应面法优化北沙参中糖类的提取工艺研究》提供的方法进行提取条件优化，要求实验人员对各因素进行尽量精确的控制，使工艺控制的难度增加。且无法得知药材粒度、提取时间和水料比三因素的波动对效应值的影响。而使用遗传算法搜索得到的最优工艺参数可在一定范围内波动，且几乎不影响提取率，在生产实际中更易于实现。此外，直接搜索算法可通过设定边界约束、利用模式搜索方法精确搜索得各工艺参数的最佳取值。因此，三种方法联合使用，取长补短，以得到北沙参糖类化合物的最佳提取工艺优化结果。