核体蛋白SP110及含有该蛋白的试剂盒在制备酒精性心肌病早期诊断试剂中的应用的制作方法

本发明涉及一种新的、用于早期诊断酒精性心肌病的血清生物标志物，还涉及含有该血清生物标志物的试剂盒。本发明属于医药
技术领域：
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背景技术：
酒精性心肌病(alcoholiccardiomyopathy，acm)是指因长期大量饮酒所致的以心脏扩大、心律失常和充血性心力衰竭为特征的一类继发性心肌病变。随着人民生活水平提高，饮酒人数增加，acm发病率呈逐年上升趋势。据统计acm占所有心脏疾病的3.8％，而几乎一半扩张型心肌病患者都是由酒精摄入引起的(pianomr，clinicalcharacteristicsandpathophysiology，2002，121:1638-1650)。终末期acm患者会出现心功能下降的各种临床症状，同时累及脑、神经系统、肝脏，骨骼肌等靶器官出现相应症状，最终导致病人死亡。据报道3年acm患者病死率高达40％，4年病死率接近50％(李为民，chinesejournalofpracticalinternalmedicine，2012)。因而acm已成为世界各国所日益关注的公共健康问题。为了降低死亡率，提高acm的治疗效果，关键是acm的早期发现、早期诊断、早期治疗，然而关于acm的诊断方法是及其有限的，目前acm被欧洲心脏病学会和由美国心脏协会归为扩张型心肌病(dcm)(elliottp，eurheart，2008；29:270-276)。因此acm的诊断通常是在患有dcm的患者中排除的，这部分dcm患者没有确定的病因并且有长期的严重酒精滥用史(至少5年内每天超过80g)(fauchierl,eurheart，2000；21:306-314)。但是具体多少酒精以及多长时间的应用会导致acm是有争议的。因此，关于acm，目前尚无特异性诊断方法及标准。从长远角度来看，为了实现对acm的早期高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找到更敏感、更特异的acm的生物标志物。理想的acm标志物应符合以下几个条件：(1)敏感性高；(2)特异性高；(3)标志物能够和其他心脏疾病区分开来；(4)半衰期短，有效治疗后浓度能够很快的下降，能够较快的反应治疗效果；(5)存在于体液，特别是血液中，易于检测。目前还没有符合上述条件的acm生物标志物开发出来用于诊断acm，为了实现对acm的早期高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供核体蛋白sp110在制备酒精性心肌病早期诊断试剂中的应用，以解决现有技术不能实现对酒精性心肌病的早期高灵敏性、高特异性诊断的技术性问题。本发明的第二目的在于提供一种用于酒精性心肌病早期诊断的试剂盒，以解决现有技术对酒精性心肌病诊断不能实现早期高灵敏性、高特异性的技术性问题。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：本发明利用人蛋白质组芯片高通量、快速分析的优势，分析了酒精性心肌病人相关血清，在较短时间内比较了酒精性心肌病人、dcm患者和健康人样品中的不同，结果发现核体蛋白sp110(q9hb58-sp110_human)的表达水平在酒精性心肌病人中的表达水平明显高于dcm患者以及健康人，提示核体蛋白sp110可作为酒精性心肌病的候选血清生物标志物，以期早期诊断和有效治疗acm。在上述研究的基础上，本发明提出了核体蛋白sp110在制备酒精性心肌病早期诊断试剂中的应用。进一步的，本发明还提出了一种用于酒精性心肌病早期诊断的试剂盒，所述的试剂盒中包括酶标板、人源核体蛋白sp110、包被缓冲液、标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液，其中，所述人源蛋白质sp110包被于所述酶标板上。其中，优选的，所述的人源核体蛋白sp110是从酿酒酵母中表达，亲和纯化而得到，浓度为10μg/ml。其中，优选的，所述的包被缓冲液中含有1.59g/lna2co3以及2.93g/lnahco3。其中，优选的，所述的标准血清包括标准血清a和标准血清b，所述标准血清a为健康人血清稀释于样品稀释液中；所述标准血清b为sp110抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中，浓度为100u/ml。其中，优选的，所述的酶标试剂中含偶联hrp的抗人igm的二抗，浓度为0.1-1μg/ml。其中，优选的，所述的酶底物溶液为tmb溶液，所述tmb溶液包括显色剂a和显色剂b，其中，显色剂a：500ml溶液中含有醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g和30％(v/v)双氧水0.3ml；显色剂b：500ml溶液中含有tmb350mg、dmso20ml和柠檬酸·h2o5.1g。其中，优选的，所述的封闭液中含有5g/lbsa、8g/lnacl、0.2g/lkh2po4、2.9g/lna2hpo4·12h2o和0.2g/lkcl。其中，优选的，所述的样品稀释液中含有8g/lnacl、0.2g/lkh2po4、2.9g/lna2hpo4·12h2o和0.2g/lkcl。其中，优选的，所述洗涤液中含有8g/lnacl、0.2g/lkh2po4、2.9g/lna2hpo4·12h2o、0.2g/lkcl和0.5ml/ltween-20；所述终止液为2mol/lh2so4溶液。其中，优选地，所述试剂盒中的试剂均可加入防腐剂。其中，优选的，使用本发明所述的试剂盒用于酒精性心肌病早期诊断时，按照以下方法进行：(1)包被：将纯化的人源核体蛋白sp110溶液用包被缓冲液稀释至1μg/ml，加入到96孔酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；洗涤液洗板3次，甩干；(2)封闭：加入封闭液200μl，室温孵育2小时；洗涤液洗板3次，甩干；(3)标准品与样品的稀释与加样：将标准品与待测血清样品1:100用样品缓冲液稀释至100μl，分别加入到各自的抗原测定孔板中；将样品加于酶标板孔底部，轻轻晃动混匀，酶标板上加覆膜；(4)温育：酶标板置于37℃反应120分钟，甩净孔中液体，不用洗涤；(5)加酶：每孔加偶联hrp的抗人igm的二抗100μl，37℃反应60分钟。甩净孔中液体，同上洗板5次拍干；(6)显色：拍干后各孔先滴加显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。(7)终止：依序每孔加终止液50μl，终止反应；(8)结果判定：a.用酶联仪在450nm波长依次测量各孔的吸光度抗sp110值＝(a450<样品>-a450<标准血清a>)/(a450<标准血清b>-a450<标准血清>)其中，a450表示450nm处吸光度；b.血清中抗sp110值的判定当抗sp110值＜2，则判定为健康；当2.7>抗sp110值≥2，则判定为高危；当抗sp110值≥2.7，则判定为酒精性心肌病。与现有技术相比，本发明有以下优点：1、提供一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定性测定人血清中抗sp110的igm抗体的水平，有助于辅助早期诊断酒精性心肌病；2、提供的血清标志物sp110的特异性为80％，敏感性为82％，具有高特异性和高敏感性的特点。附图说明图1为银染鉴定sp110的表达浓度、纯化状况的示意图；图中：1表示标准bsa溶液浓度为5μg/ml；2表示标准bsa溶液浓度为10μg/ml；3表示标准bsa溶液浓度为25μg/ml；4表示标准bsa溶液浓度为50μg/ml；5表示标准bsa溶液浓度为100μg/ml；6表示经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化后的sp110蛋白质样品(含gst标签)；7表示蛋白质分子量marker，从大到小分子量分别是：170kd，130kd，95kd，72kd，55kd；图2为western-blotting鉴定sp110的表达、纯化状况的示意图；图中：1表示经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)(国家生化工程技术研究中心)分离纯化后的sp110蛋白质样品(含gst标签)；2表示蛋白质分子量marker，从大到小分子量分别是：130kd，95kd，72kd，55kd；图3为健康人、高危、酒精性心肌病患者血清中抗蛋白质sp110的igg抗体的浓度变化曲线图。注：图中的数值是健康人、高危、酒精性心肌病患者各500份血清样本中的抗sp110的igm浓度的相对水平。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将随着描述而更为清楚，但该实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1候选血清生物标志物的确定本发明利用人蛋白质组芯片高通量、快速分析的优势，分析了酒精性心肌病人相关血清120份(酒精性心肌病人40份、dcm患者20份、健康人血清60份)，在较短时间内比较了酒精性心肌病人、dcm患者和健康人样品中的不同，结果发现核体蛋白sp110(q9hb58-sp110_human)的表达水平在酒精性心肌病人中的表达水平明显高于dcm患者以及健康人，提示核体蛋白sp110可作为酒精性心肌病的候选血清生物标志物，以期早期诊断和有效治疗acm。实施例2核体蛋白sp110在诊断酒精性心肌病中的应用1、表达、纯化及鉴定核体蛋白sp110人源核体蛋白sp110(q9hb58-sp110_human，含有689个氨基酸，78.4kda)是由基因工程改造过的酿酒酵母利用半乳糖诱导过量表达后，经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化而得到，对其进行银染定量和western-blotting鉴定的结果分别如图1和图2所示。2、血清样品的准备：全血标本于室温放置2小时后于2000g离心5分钟左右，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心，然后检测。所检测样品中不能含有nan3，因为nan3抑制辣根过氧化物酶的(hrp)活性。3、elisa法中各种缓冲液及试剂的配制方法：(1)包被缓冲液表1成分质量na2co31.59gnahco32.93gddh2o加至1000ml(2)样品稀释液表2成分质量nacl8gkh2po40.2gnahpo4.12h2o2.9gkcl0.2gddh2o加至1000ml(3)洗涤液表3成分质量nacl8gkh2po40.2gnahpo4.12h2o2.9gkcl0.2gtween-200.5mlddh2o加至1000ml(4)封闭液表4封闭液质量bsa5gnacl8gkh2po40.2gnahpo4.12h2o2.9gkcl0.2gddh2o加至1000ml(5)酶底物溶液：显色剂a和显色剂b表5(6)终止液表6成分质量98％硫酸22.2mlddh2o加至500ml4、elisa法测定血清中sp110的igm抗体的浓度，以辅助早期诊断酒精性心肌病：具体操作步骤如下：(1)包被：将纯化的人源sp110蛋白溶液用包被缓冲液稀释至1μg/ml，加入到96孔酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；洗涤液洗板3次，甩干。(2)封闭：加入封闭液200μl，室温孵育2小时；洗涤液洗板3次，甩干。(3)标准品与样品的稀释与加样：将标准品与待测血清样品1:100用样品缓冲液稀释至100μl，加入到各自的抗原测定孔板中。注意不要有气泡，将样品加于梅标板孔底部，轻轻晃动混匀，酶标板上加覆膜。标准品及待检测样品临用前15分钟内配制，用完丢弃，下次检测使用新鲜配制的标准品。(4)温育：酶标板置于37℃反应120分钟，甩净孔中液体，不用洗涤。(5)加酶：每孔加hrp标记的抗人igm抗体100μl，37℃反应60分钟。甩净孔中液体，同上洗板5次拍干。(6)显色：拍干后各孔先滴加显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。(7)终止：依序每孔加终止液50μl，终止反应。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。底物反应时间到后应尽快加入终止液。(8)结果判定：a.用酶联仪在450nm波长依次测量各孔的光密度(od值)。单位值(u/ml)＝(a450<样品>-a450<标准血清a>)/(a450<标准血清b>-a450<标准血清>)*a450是450nm处吸光度的缩写。*目前sp110抗体尚无国际通行的参考标准，因此本检测结果校准时采用了相对单位。b.血清中抗sp110值的判定结果如表7所示：表7抗sp110值判定＜2健康2.7>-≥2高危≥2.7酒精性心肌病c.质量控制每个检测结果必须符合以下标准：标准血清a的a450：≤0.100标准血清b的a450：≥0.700如不符合上述标准，则结果视为无效，必须重新检测。d.检验结果的解释对60例健康人血清、40例酒精性心肌病者血清、20例高危患者血清的roc分析，确立了以上参考值，图3为健康人、高危、酒精性心肌病患者血清中抗蛋白质sp110的igg抗体的浓度变化曲线图。5、特异性和敏感性检测：采用1500份酒精性心肌病相关患者的血清(酒精性心肌病患者500份，高危人群500份，健康人500份)对本发明的诊断试剂盒进行了特异性和敏感性检测。敏感性＝酒精性心肌病患者sp110抗体阳性例数/酒精性心肌病患者总例数特异性＝健康人sp110阴性例数/健康人总例数当抗sp110值>2.7则判定为阳性，当抗sp110值≤2，则判定为阴性。结果显示，在酒精性心肌病患者中有410例患者抗sp110值>2.7，敏感性＝410/500×100％＝82％，在健康人中有400例患者抗sp110值≤2，特异性＝400/500×100％＝80％，均大大高于现有技术中酒精性心肌病的诊断指标。当前第1页12