漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，更具体涉及漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用。

背景技术

漆酶(laccase,ec1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于高等植物、真菌和昆虫中，其中白腐真菌被认为是目前最高效的漆酶生产者。漆酶是一种绿色环保酶，漆酶通过氧化反应，使底物失去电子形成自由基，而失去的电子又传递给分子氧形成水。漆酶的底物范围很广，可以催化多种芳香族化合物的氧化，但是漆酶对不同染料的作用效果不同，取决于漆酶的性质和染料的结构。小分子漆酶介体，如abts(2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)、hbt(1-hydroxybenzotriazole)、丁香醛(syringaldehyde,syd)、乙酰丁香酮(acetosyringone,ace)和丁香酸(syringicacid,sya)等可以拓宽漆酶的底物范围或提高催化速度。漆酶的低底物特异性使其在废水处理、纸浆漂白、生物能源、食品加工、生物修复等领域中有着广泛而重要的应用前景。

蛋白质的聚丙烯酰胺凝电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis)是当代实验室蛋白质分析和检测最常用技术之一。电泳结束后将凝胶浸泡在染料中，随后通过溶剂洗去多余染料(“脱色”)，使蛋白条带直接显示。常采用考马斯亮蓝(coomassiebrilliantblue,cbb)r-250或g-250进行染色。常用的染色液和脱色液中含有甲醇、冰醋酸等有机溶剂。要获得较好的脱色效果，需要较长脱色时间(过夜)，并更换多次脱色液，会产生大量的(有机)染料废液，若直接排放会造成污染。到目前为止，漆酶对染料废水脱色的研究局限于水溶液环境。本发明尝试将漆酶用于蛋白凝胶(固体)的脱色，使蛋白条带在清晰背景上显示，便于观察。

技术实现要素：

本发明提供了一种漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，利用漆酶进行染色蛋白凝胶的脱色，环保、快速、简便，不需要有机溶剂，节约能源，降低染料废水的污染。

本发明的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，将漆酶应用于蛋白凝胶电泳中常规染色后的脱色，并在脱色的同时实现染料的降解。

漆酶的应用方式包括漆酶或漆酶/介体系统。

所述蛋白凝胶电泳包括，但不局限于十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)。

所述蛋白染料包括，但不局限于考马斯亮蓝r250和g250。

所述漆酶包括，但不局限于真菌、细菌来源漆酶。

所述介体包括，但不局限于abts、hbt、ace、sya、syd。

本发明的技术方案详述如下：

本发明涉及高产漆酶的白腐真菌齿毛菌(cerrenasp.)hyb07菌株(参考文献：yangj,linq,ngtb,yex,linj.purificationandcharacterizationofanovellaccasefromcerrenasp.hyb07withdyedecolorizingability.plosone,2014,9:e110834)。

本发明涉及利用齿毛菌hyb07菌株发酵生产漆酶。

本发明还涉及利用齿毛菌hyb07菌株的发酵液对蛋白凝胶进行脱色。将发酵液稀释后直接用于蛋白凝胶的脱色，在不使用有机溶剂、不更换脱色液、较低温度的条件下获得满意的脱色效果，并在脱色同时实现染料降解。

本发明的脱色条件为：在温度25℃-45℃、漆酶酶活12-18u/ml、介体浓度1μm-3μm、脱色时间1h-2h。

更优选的脱色条件为：在温度40℃、漆酶酶活15u/ml、介体浓度2μm、脱色时间2h。

本发明利用漆酶进行蛋白凝胶脱色，脱色快速(2小时可获得低背景的清晰蛋白条带)，操作简便(不需要沸腾或更换脱色液)且环保(不使用传统脱色液所需的有机溶剂如甲醇、乙酸，在脱色的同时实现染料降解，无废液处理问题及费用)。通过优化漆酶浓度、介体种类和浓度、脱色时间等因素，在较短时间内获得了良好的脱色效果，操作简便且绿色环保。

附图说明

图1为漆酶对不同种类染料脱色效果的影响。从1～12依次是：考马斯亮蓝r250、甲基橙、甲基红、碱性品红、溴百里香酚蓝、中性红、结晶紫、酸性品红、刚果红、溴甲酚绿、亚甲基蓝、玫瑰红b)。

图2为考马斯亮蓝r250经漆酶脱色处理前后的uv-visible全波长扫描。

图3为不同介体对蛋白凝胶脱色效果的影响。从1～5依次是：ace(20μm)、sya(20μm)、hbt(20μm)、abts(2μm)、syd(20μm)。

图4为漆酶/abts系统中不同温度对蛋白凝胶脱色效果的影响。从1～6依次是：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃。

图5为漆酶/abts系统中漆酶酶活对蛋白凝胶脱色效果的影响。从1～6依次是：酶浓度3u/ml、6u/ml、9u/ml、12u/ml、15u/ml、18u/ml。

图6为介体abts浓度对蛋白凝胶脱色效果的影响。从1～6依次是：abts浓度0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、3μm、4μm。

图7为漆酶/abts系统中漆酶脱色时间对蛋白凝胶脱色效果的影响。从1～4依次是：0.5h、1h、1.5h、2h。

图8为漆酶/abts脱色系统的检测灵敏性。从1～9依次是：1000ng、500ng、250ng、100ng、80ng、60ng、40ng、20ng、10ng。

图9为漆酶/abts脱色系统与不同脱色体系试验对比。从1～5依次是：柠檬酸-na2hpo4缓冲液(ph7.0)、40℃、漆酶酶活15u/ml、abts2μm、脱色2h；dh2o、温度40℃、漆酶酶活15u/ml、abts2μm、脱色2h；dongetal.(2011)中描述的试验方案(蛋白凝胶染色后置于dh2o中煮沸30～60s，更换dh2o后再次煮沸，并重复多次)；在dh2o、40℃条件下脱色2h；在柠檬酸-na2hpo4缓冲液(ph7.0)、40℃条件下脱色2h。

图10为漆酶/abts对大肠杆菌裂解液总蛋白电泳的脱色。1，蛋白marker；2，iptg诱导前bl21大肠杆菌裂解液总蛋白；3，iptg诱导后bl21大肠杆菌裂解液总蛋白。

具体实施方式

以下根据具体的实施例充分说明本发明，但是本发明不仅限于此。

1.菌株

菌株来源于白腐真菌齿毛菌(cerrenaunicolor)hyb07菌株(参考文献：yangj,linq,ngtb,yex,linj.purificationandcharacterizationofanovellaccasefromcerrenasp.hyb07withdyedecolorizingability.plosone,2014,9:e110834)。大肠杆菌bl21购自北京全式金生物技术有限公司。

2.试剂

蛋白marker购自宝生物工程(大连)有限公司，abts购自sigma-aldrich公司，考马斯亮蓝r250购自生工生物工程(上海)股份有限公司，bsa购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

3.培养基

种子培养基：pda液体培养基。

液体产酶培养基(g/l)：麦芽糊精60，蛋白胨15，酒石酸铵2，kh2po46，mgso4·7h2o4.14，cacl20.3，nacl0.18，cuso4·5h2o0.0625，znso4·7h2o0.018，andvitaminb10.015。

4.本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均参照以下实验手册中的相关章节或部分进行，包括：[美]j.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南(第三版)；沈萍等，微生物学实验(第三版)。

5.漆酶活性采用以下方法检测：反应体系4.0ml，其中含1.95ml0.1mol/l乙酸-乙酸钠缓冲液(ph3.0)、2.00ml0.5mmol/labts溶液和50μl酶液。30℃恒温水浴反应，测定反应前5min反应体系在420nm处吸光度的增加值δod。以灭活的酶液作为空白对照。酶活定义：在上述条件下，每min催化氧化1μmolabts所需的酶量为1个酶活力单位(u)。

6.漆酶发酵液的获得参照以下进行：取斜面保藏的cerrenaunicolorhyb07菌株接种于pda固体平板，30℃恒温培养，活化3d。菌株经pda平板活化后，用5mm打孔器打出5块菌饼，接种于液体种子培养基(装液量为100ml/250ml)，200r/min，30℃培养2d，制成一级种子液。将一级种子液以6％(v/v)的接种量接入到二级种子液培养基中，装液量为150ml/500ml，200r/min，30℃恒温培养2d。将二级种子液以6％(v/v)的接种量接入到液体产酶培养基中，装液量为50ml/250ml，30℃,200r/min恒温摇瓶发酵6d。采用8000r/min离心5min分离菌丝体和发酵液。

7.sds-page：使用美国bio-rad的mini-protean蛋白电泳系统。浓缩胶5％，分离胶12％。

8.蛋白凝胶染色：将考马斯亮蓝cbb溶于蒸馏水配制成浓度为0.5g/l的染色液。将蛋白凝胶置于染色液中煮沸1min。(参考文献：dongwh,wangty,wangf,zhangjh.simple,time-savingdyestainingofproteinsforsodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresisusingcoomassieblue.plosone,2011,8:e22394)。

9.除非特殊说明，蛋白凝胶脱色体系含50ml脱色液，脱色条件为40℃、50r/min，脱色时间2h。

实施例1hyb07漆酶对不同染料的脱色

(1)将hyb07漆酶用于12种不同染料(考马斯亮蓝r250、甲基橙、甲基红、碱性品红、溴百里香酚蓝、中性红、结晶紫、酸性品红、刚果红、溴甲酚绿、亚甲基蓝、玫瑰红b)的脱色。脱色体系2ml，含有50mm柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph6.0)、染料(25-200mg/l)和酶(2u/ml)，室温下脱色24h。从图1可知，经漆酶处理后，考马斯亮蓝脱色率最高，达92.37％。

(2)对漆酶脱色前后的考马斯亮蓝r250溶液进行全波长扫描。从图2可见，脱色后染料的吸收峰降低。

实施例2利用漆酶/介体系统进行蛋白凝胶的脱色

(1)介体种类对蛋白凝胶脱色的影响

在ph7.0、20u/ml漆酶、条件下，检测不同漆酶介体，包括ace(20μm)、sya(20μm)、hbt(20μm)、abts(2μm)和syd(20μm)对蛋白凝胶脱色的影响。从图3可知，abts作为介体效果最好。

(2)温度对蛋白凝胶脱色的影响

在ph7.0、酶浓度20u/ml，abts2μm条件下，研究不同温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)对蛋白凝胶脱色的影响。从图4可知，40℃为脱色最适温度。

(3)漆酶酶活对蛋白凝胶脱色的影响

在ph7.0、温度40℃条件下，研究漆酶酶活(3u/ml、6u/ml、9u/ml、12u/ml、15u/ml、18u/ml)对蛋白凝胶脱色的影响。从图5中可知，15u/ml条件下脱色效果最好。

(4)介体浓度对蛋白凝胶脱色的影响

在ph7.0、温度40℃、漆酶酶活15u/ml条件下，研究不同介体浓度(0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、3μm、4μm)对蛋白凝胶脱色的影响。从图6中可知，介体浓度为2μm脱色效果最好。

(5)脱色时间对蛋白凝胶脱色的影响

在ph7.0、温度40℃、漆酶酶活15u/ml、abts2μm条件下，研究不同脱色时间(0.5h、1h、1.5h、2h)对蛋白凝胶脱色的影响。从图7可知，脱色2h条件下脱色效果最好。

实施例3漆酶/介体脱色系统的检测灵敏性

(1)在ph7.0、温度40℃、漆酶酶活15u/ml、abts2μm条件下脱色2h，检测漆酶/介体脱色系统的检测灵敏性。从图8可知，bsa低至10ng仍能检测到。

(2)比较不同脱色方法的效果。从图9可以看出，漆酶/介体脱色系统脱色效果最好，脱色液用缓冲液或蒸馏水配制差别不大。直接采用水煮沸脱色，易造成蛋白信号的损失。40℃下只用水或缓冲液脱色2h，背景较高，表明，漆酶不仅只降解溶液中的r-250，也有加速蛋白凝胶脱色的效果。与蛋白质结合的染料，不易被漆酶降解，从而使蛋白条带可以在清晰背景上显示。

实施例4漆酶/介体系统对复杂蛋白条带的脱色

在实施例2中的优化条件下，利用漆酶/介体系统检测bl21大肠杆菌裂解液蛋白。从图10可知，漆酶/介体系统对复杂蛋白样品凝胶电泳的脱色也具有较好的效果。