一种荧光传感阵列及采用该阵列对微生物进行分型鉴定的方法与流程

本发明属于分子生物学材料领域，具体涉及一种荧光传感阵列及采用该阵列对微生物进行分型鉴定的方法。

背景技术：

细菌与真菌与人类具有紧密的关系，一方面，全球每年因为细菌或真菌的感染而死亡的人数达到2百万；另一方面，肠道内的细菌在食物消化，营养分子的合成及机体的免疫方面均具有重要的作用。基于此，分型鉴定微生物对于我们了解及利用微生物具有重要的意义。然而，目前的微生物主要基于微生物培养，其具有耗时久等缺点，同时，有些微生物的培养需要特殊的培养基。其它的技术，包括pcr、基因测序、表面增强拉曼及质谱的方法也都比较复杂和耗时耗力。发展新颖高效的微生物分型鉴定技术具有重要的意义。

生物模式识别技术已经被证明是针对复杂生物分子分型鉴定的强有力的方法。已经被应用于区分蛋白质，离子及挥发性气体。一般而言，生物识别技术主要基于分子传感阵列的构建而进行。基于待分析物与分子传感阵列间的非特异性相互作用而对不同的分析物产生特定的图案。目前，已有报道利用该技术实现细菌或肿瘤细胞的分型鉴定。然而目前为止，依然存在以下几个问题：1，在信号采集时常常用到复杂的设备，2，传统的荧光分子往往具有较强的荧光信号，3，目前细菌的鉴定区分往往使用的是活微生物，通常具有一定的感染性。

技术实现要素：

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种荧光传感阵列。本发明对的荧光传感阵列由具有聚集诱导发光(aggregation-inducedemission,aie)性质的荧光分子(aiegens)和氧化石墨烯(go)来构建荧光分子传感阵列。不同于传统的荧光分子，聚集诱导发光荧光分子在溶解状态下具有很弱的发光，而当分子运动受限时，其荧光发射效率大大增强。氧化石墨烯不仅可以进一步的猝灭背景荧光，还可以引入竞争性的生物分子之间的相互作用，从而提高分子传感阵列的区分能力。

本发明的另一目的在于提供一种采用上述荧光传感阵列对微生物进行分型鉴定的方法。

本发明的再一目的在于提供一种采用上述荧光传感阵列制备的微生物快速分型鉴定试剂盒。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种荧光传感阵列，由聚集诱导发光分子溶液和氧化石墨烯溶液混合组成；所述聚集诱导发光分子具有如下a1～a13中任一项所述的结构式：

(a1,anal.chem.2010,82,7035-7043；a2,chem-eur.j.2010,16,1232-1245；a3,chem.commun.2017,53,4795-4798；a4,chem.commun.2012,48,8637-8639；a5,j.med.chem.2007,50,663-673；a6,chem.sci.2017,8,1822-1830；a7,chem.sci.2017,8,1822-1830；a8,chem-eur.j.2010,16,1232-1245；a9,anal.chem.2015,87,9487-9493；a10,chem.commun.2014,50,8312-8315；a11-a13,cn.patent.105541660[p].2016-01-15)。

优选地，所述聚集诱导发光分子具有如下a1～a7任一项所述的结构式：

优选地，所述聚集诱导发光分子溶液的浓度为1～10mm，氧化石墨烯溶液的浓度为0.2～0.4mg/ml，聚集诱导发光分子溶液与氧化石墨烯溶液混合的体积比为1:(0.5～5)。

一种采用上述荧光传感阵列对微生物进行分型鉴定的方法，包括如下步骤：

将荧光传感阵列与微生物裂解液混合均匀进行孵育，根据产生的荧光信号的不同对微生物进行分型鉴定。

进一步地，所述孵育的时间为2h。

进一步地，所述产生的荧光信号通过酶标仪或荧光光谱仪进行采集，采集的信号通过主成分分析(principalcomponentanalysis，pca)的方法实现对微生物的分型鉴定。

进一步地，所述微生物包括真菌、革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌，具体包括白色念珠菌、酿酒酵母、铜绿色假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽胞杆菌。

一种采用上述荧光传感阵列制备的微生物快速分型鉴定试剂盒。

本发明的原理为：通过聚集诱导发光分子与氧化石墨烯构建的荧光分子阵列在与微生物裂解液作用之前荧光完全猝灭，微生物裂解液作为分析底物用来点亮荧光分子阵列。使得荧光分子阵列与微生物裂解液孵育后荧光得以不同程度的恢复。该荧光传感阵列对不同的微生物裂解液荧光响应强度不同，从而对特定微生物产生特异性荧光图案，最终结合模式识别技术实现不同微生物的区分。

相对于现有技术，本发明的荧光传感阵列及鉴定方法具有如下优点及有益效果：

(1)本发明的荧光传感阵列直接将聚集诱导发光分子与氧化石墨烯混合，即能实现对多种微生物的分型鉴定，不需要化学修饰，信号响应在2h内完成，可以通过酶标仪、荧光光谱仪及数码成像对数据进行采集，结合主成分分析对数据进行处理，具有安全、简便、高效、无复杂化学标记、背景信号低及特异性强的优势。

(2)本发明的鉴定方法选择微生物的裂解液作为分析底物，相比于微生物的外膜而言，微生物裂解液可以提供关于微生物更多的分子信息。同时，细菌裂解液可以更方便的长时间存放。

附图说明

图1为本发明实施例1中的荧光传感阵列在加入细菌裂解液(大肠杆菌)前后的荧光照片图。

图2为本发明实施例2中构建的荧光分子传感阵列与六种微生物裂解液作用后的荧光照片图。横坐标中x1～x7分别代表七种aie分子a1～a7，纵坐标y1～y6分别代表六种微生物。

图3为本发明实施例2中荧光分子传感阵列与六种微生物裂解液相互作用后提取的荧光强度信号。

图4为本发明实施例2中通过六种微生物裂解液产生的荧光信号进行主成分分析处理后得到的六种微生物的信号图案。

图5为本发明实施例3中分别往两套荧光分子传感阵列中(a,不含有氧化石墨烯，b,加入氧化石墨烯)加入细菌裂解液(铜绿假单胞菌、大肠杆菌)后的荧光照片图和相对荧光强度图。

图6为本发明氧化石墨烯诱导的竞争性作用的原理示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例的一种荧光传感阵列及对微生物进行分型鉴定的方法，具体步骤如下：

(1)配置aie分子的溶液；分别为a1(水溶解，1mm)，a2(水溶解，10mm)，a3(dmso溶解，1mm)，a4(dmso溶解，1mm)，a5(dmso溶解，10mm)，a6(dmso溶解，1mm)，a7(dmso溶解，1mm)；a1～a7的aie分子具有如下结构式：

(2)分别取10μlaie分子溶液加入96孔板中编号为1～7，其中1～6号管中加入50μl石墨烯溶液(浓度为0.4mg/ml)，7号管中加入5μl石墨烯溶液(浓度为0.2mg/ml)，混合均匀后制备成荧光分子传感阵列。

(3)往步骤(2)的每个试管中加入100μl的细菌裂解液(大肠杆菌)，混合均匀，室温孵育2h，紫外灯照射下拍照。

本实施例中的荧光传感阵列在加入细菌裂解液(大肠杆菌)前后的照片如图1所示。从图1可以看出在加入细菌裂解液前，荧光传感阵列的荧光被猝灭，只有96孔板材料的荧光，而加入细菌裂解液后，荧光传感阵列的荧光被点亮，每一个孔发出不同颜色、亮度的荧光。

实施例2

本实施例的一种荧光传感阵列及对微生物进行分型鉴定的方法，具体步骤如下：

(1)配置aie分子的溶液；分别为a1(水溶解，1mm)，a2(水溶解，10mm)，a3(dmso溶解，1mm)，a4(dmso溶解，1mm)，a5(dmso溶解，10mm)，a6(dmso溶解，1mm)，a7(dmso溶解，1mm)；

(2)分别取10μlaie分子溶液加入96孔板中并编号为x1～x7，其中x1～x6号管中加入50μl石墨烯溶液(浓度为0.4mg/ml)，x7号管中加入5μl石墨烯溶液(浓度为0.2mg/ml)，混合均匀后制备成荧光分子传感阵列。

(3)平行加样六组，制备针对六种微生物的荧光传感阵列，编号为y1～y6。

(4)每一组孔中加入一种细菌裂解液100μl，共六种。y1～y6分别对应白色念珠菌、酿酒酵母、铜绿色假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌，混合均匀，室温孵育2h，紫外灯照射下拍照。重复操作5遍。

(5)通过酶标仪测试每个孔中荧光光谱，获取荧光分子传感阵列对每一种微生物裂解液响应强度。

(6)通过主成分分析(canoco4.5软件)对数据进行分析制图。

本实施例中的荧光传感阵列在加入六种微生物裂解液后的荧光照片如图2所示。从图2可以看出，荧光传感阵列对于每一种微生物裂解液的响应不同，主要为荧光分子信号的强度不同。

本实施例中的六种微生物荧光信号响应强度的信号如图3所示。从图3中可以看出，每种微生物裂解液可以刺激荧光分子阵列产生特定的荧光强度阵列。

本实施例中的荧光信号数据处理如图4所示，从图4中可以看出，经过主成分分析处理后，六种微生物在得以很好的区分。

实施例3

本实施例的一种荧光传感阵列及对微生物进行分型鉴定的方法，具体步骤如下：

(1)配置aie分子的溶液；分别为a1(水溶解，1mm)，a2(水溶解，10mm)，a3(dmso溶解，1mm)，a4(dmso溶解，1mm)，a5(dmso溶解，10mm)，a6(dmso溶解，1mm)，a7(dmso溶解，1mm)；

(2)分别取1μlaie分子溶液加入试管中，试管编号为1～7，其中1～6号管中加入5μl石墨烯溶液(浓度为0.4mg/ml)，7号管中加入0.5μl石墨烯溶液(浓度为0.2mg/ml)，混合均匀后制备成荧光分子传感阵列。平行制备两份该传感阵列。

(3)另做一套不含有氧化石墨烯的荧光分子传感阵列，具体步骤如下：

(a)配置aie分子的溶液；分别为a1(水溶解，1mm)，a2(水溶解，10mm)，a3(dmso溶解，1mm)，a4(dmso溶解，1mm)，a5(dmso溶解，10mm)，a6(dmso溶解，1mm)，a7(dmso溶解，1mm)；

(b)分别取1μlaie分子(a1～a7)溶液加入七个试管中，试管编号为1～7，其中1～6号管中加入5μl水溶液，7号管中加入0.5μl水溶液，混合均匀后制备成不含石墨烯的荧光分子传感阵列。平行制备两份该传感阵列。

(c)分别往两套荧光分子传感阵列中加入细菌裂解液(铜绿假单胞菌、大肠杆菌)，孵育2小时，紫外灯照射下进行拍照。

本实施例中的荧光照片数据如图5所示，a，铜绿假单胞菌与大肠杆菌的细菌裂解液与不含有氧化石墨烯的aie分子相互作用，上为荧光照片图，下为两种细菌裂解液产生的相对荧光强度图。b，两种细菌裂解液与加入氧化石墨烯的荧光分子传感阵列相互作用，上为荧光照片图，下为两种细菌裂解液产生的相对荧光强度图。从图5中可以看出，不含有氧化石墨烯的荧光分子传感阵列对两种细菌裂解液均有响应，响应的程度相同，不能区分两种细菌。而加入氧化石墨烯的荧光分子阵列可以很好的区分两种细菌裂解液。其原因为氧化石墨烯诱导的竞争性作用对于提升传感阵列选择性的影响。氧化石墨烯诱导的竞争性作用的原理示意图如图6所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。