一种光场Micro-PIV系统的标定方法与流程
本发明涉及一种光场micro-piv系统的标定方法，属于微尺度多相流测量技术领域。
背景技术
近年来，微流动器件应用成为国内外研究的热点，不同结构与功能的微流动器件具有不同的流动特性。研究表明，由于微流动器件流动特征尺度微小，流体分子间作用力、静电力等表面力效应相对增强，同时流动还受到微流体器件构型、壁面粗糙度和浸润性等因素影响，流动特性非常复杂，目前还没有合适的理论模型来对微流动器件内复杂的流动特性进行解释。流动可视化技术是微尺度流动特性研究的重要实验方法。显微粒子图像测速技术(micro-scaleparticleimagevelocimetry，简称micro-piv)可以实现无干扰、整场、瞬态、定量的微尺度速度场测量。光场micro-piv系统在显微镜筒镜与ccd相机之间加装微透镜阵列，由于微透镜阵列的存在，光场micro-piv系统一次曝光即可获得微尺度流场的光场信息，进一步利用图像处理技术可以得到流场中示踪粒子的三维信息。基于这一特点，光场micro-piv系统可通过单相机实现瞬时三维速度场的测量。
光场micro-piv系统要求微透镜阵列准确位于显微镜筒镜的成像面处，且ccd相机的传感器面准确位于微透镜阵列的后焦面处，此时，系统才能最大程度地获取光场的方向信息，同时可以为后续的反卷积重建提供准确的系统参数。而在实际安装微透镜阵列和ccd相机时，难以保证其处于准确位置，特别是微透镜阵列和ccd传感器之间的距离要精确到微米级别，这一精度无法通过直接测量距离的方式来实现。因此需要利用针对光场micro-piv系统的标定方法来准确安装微透镜阵列和ccd相机。
现有标定方法多用于宏观光场piv系统，仅针对ccd相机的传感器面和微透镜阵列的距离的标定，忽略了微透镜阵列和显微镜筒镜的距离的标定。该方法利用平行白光源来进行标定，平行白光经过微透镜被会聚，在ccd相机传感器面上形成焦斑，前后移动ccd相机，当焦斑最小时，即认为ccd相机的传感器面恰好位于微透镜阵列的后焦面处。然而利用现有标定方法进行标定时，平行白光源需直接照射微透镜阵列，而显微镜的特殊结构，导致平行白光源必须经过物镜和筒镜才能照射到微透镜阵列，现有标定方法无法用于光场micro-piv系统。因此，现在仍缺少针对光场micro-piv系统的标定方法。此外，入射光波长不同时，微透镜的焦距会产生变化，系统实际操作时采用波长584nm的单色荧光，而白光波长范围为380nm～780nm，因此，在对光场micro-piv系统进行标定时，不能采用平行白光源，否则会产生误差。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是针对上述光场micro-piv系统的标定方法的缺失，而提供一种光场micro-piv系统的标定方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种光场micro-piv系统的标定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：制备内部具有示踪粒子的浓、稀标定样品；
步骤二：选取浓标定样品，将其置于荧光显微镜的载物台上，打开激光器，通过目镜观察浓标定样品，调整其离物镜的距离，使得浓标定样品处于显微镜物镜焦面处；
步骤三：将ccd相机与中继系统通过卡口相连，此时ccd相机处于中继系统后焦面，整体移动ccd相机和中继系统，调整其与微透镜阵列的距离，使微透镜阵列处于中继系统前焦面；
步骤四：保持微透镜阵列、中继系统和ccd相机的相对距离不变，整体移动相机系统，改变微透镜阵列与显微镜筒镜的距离，用ccd相机记录不同距离下浓标定样品经过显微镜和微透镜阵列成像后形成的图像；
步骤五：计算步骤四所得图像的清晰度评估值，当清晰度评估值最大时，固定微透镜阵列的位置，此时微透镜阵列即处于显微镜筒镜成像面；
步骤六：整体平移中继系统和ccd相机，改变其与微透镜阵列的距离，直到ccd相机实时界面出现相邻子图像相切的情况，此时ccd相机的位置粗调完成；
步骤七：选取稀标定样品，将其置于荧光显微镜的载物台上，通过目镜观察稀标定样品，调整其离物镜的距离，使得稀标定样品处于显微镜物镜焦面处；
步骤八：转动显微镜细准焦螺旋，使得稀标定样品处于不同离焦深度，记录下不同离焦深度时，单个示踪粒子经过显微镜和微透镜阵列成像之后在ccd相机成像面形成的点扩散函数(以下简称psf)图像；
步骤九：计算步骤八所得的psf图像与通过阿贝成像理论计算得到的相同条件下的psf图像的相似度函数值；
步骤十：整体移动中继系统和ccd相机，微调其与微透镜阵列的距离，比较不同距离下通过步骤八和九得到的图像相似度函数值，当图像相似度函数值最大时，固定中继系统和ccd相机，完成标定。
步骤十中，利用笼板与笼杆对微透镜阵列、中继系统和ccd相机进行同轴固定。
所述标定样品采用荧光聚苯乙烯微球制备，其中浓标定样品的浓度为20～25g/l；稀标定样品的浓度为0.02～0.025g/l。
所述步骤九中，相似度函数值利用基于结构相似性的图像质量评价算法计算得到。
所述步骤五中，清晰度评估值采用基于点锐度的清晰度算法计算。
所述步骤八中，不同离焦深度分别为40μm、50μm、60μm、70μm、80μm和90μm。
光场micro-piv系统主要由激光器(λ＝532nm)、荧光显微镜、相机系统和计算机组成，其中，相机系统由微透镜阵列、中继系统和ccd相机组成。ccd相机安装在中继系统后侧，中继系统前侧安装微透镜阵列，相机系统整体通过接口与荧光显微镜相连。系统的标定目的主要有两点：一是确保微透镜阵列准确位于显微镜筒镜的成像面处；二是确保ccd相机的传感器面准确位于微透镜阵列的后焦面处。此时，系统才能最大程度地获取光场的方向信息，同时可以为后续的反卷积重建提供准确的系统参数，从而实现瞬时三维速度场的测量。
标定时，首先需要标定微透镜阵列和显微镜筒镜的距离，使得微透镜阵列准确位于显微镜筒镜的成像面处，然后标定ccd相机的传感器面和微透镜阵列的距离，使得ccd相机的传感器面准确位于微透镜阵列的后焦面处。如果先标定ccd相机的传感器面和微透镜阵列的距离，那么在标定微透镜阵列和显微镜筒镜的距离时，相机记录的是样品经过微透镜阵列作用之后形成的图像，为失真图像，而失真图像无法用于微透镜阵列和显微镜筒镜的距离的标定。因此，两个距离的标定要遵循先微透镜后传感器面的顺序。
有益效果
与现有标定方法相比，本发明具有如下优点：利用激光器和荧光聚苯乙烯微球代替平行白光源进行标定，可消除因入射光波长不同而带来的误差。利用浓标定样品配合基于点锐度的清晰度算法完成微透镜阵列和显微镜筒镜距离的标定，将标定与清晰度相联系，标定精度高；利用浓、稀标定样品配合基于结构相似性的图像质量评价算法完成ccd相机的传感器面和微透镜阵列的距离的标定，将标定与图像相似度相联系，标定精度高。现有标定方法是基于焦斑标定，平行白光源需直接照射微透镜阵列，而显微镜的特殊结构，导致平行白光源必须经过物镜和筒镜才能照射到微透镜阵列，因此现有标定方法无法用于光场micro-piv系统，采用本发明标定方法，最终标定精度可达6微米。
附图说明
图1系统结构图；
图2相对距离示意图；
图3清晰度评估值图；
图4微透镜阵列位置标定图；
图5中继镜和ccd相机位置标定图；
图6图像相似度函数值图；
图7实验psf和阿贝成像理论psf对比图。
其中：1-物镜焦平面、2-显微镜物镜、3-凸透镜、4-扩束镜、5-滤光片、6-二向色分光镜、7-滤波片、8-显微镜筒镜、9-荧光显微镜、10微透镜阵列、11-微透镜后焦面、12-中继系统、13-相机传感器面、14-ccd相机、15-激光器、16-计算机、17-笼杆、18-笼板。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作详细说明。
根据图1所示系统结构图，组装好光场micro-piv系统。光场micro-piv系统主要由激光器(λ＝532nm)、荧光显微镜、相机系统和计算机组成，其中，相机系统由微透镜阵列、中继系统和ccd相机组成。ccd相机安装在中继系统后侧，中继系统前侧安装微透镜阵列，相机系统整体通过接口与荧光显微镜相连。
如图2所示，显微镜筒镜8与微透镜阵列10的距离用l1表示，微透镜阵列10与中继系统11的前镜头距离用l2表示，中继系统11的后镜头与相机传感器面12的距离用l3表示，标定的主要目的即为确定这三个距离的大小。
本发明基于点扩散函数的光场micro-piv系统的标定方法，其具体步骤包括如下：
步骤一：使用荧光聚苯乙烯微球制作浓、稀标定样品。其中，浓标定样品的浓度为20～25g/l；稀标定样品的浓度为0.02～0.025g/l。浓标定样品中粒子连续分布，稀标定样品中粒子离散分布，由于实际测量时需要使用荧光聚苯乙烯微球作为示踪粒子，因此在标定时也采用该微球作为标定样本，这可以保证标定与实际测量时的系统参数的一致性；浓标定样品可将整个微透镜阵列照亮，从而使得微透镜阵列对应的传感器面像素点均有图像形成，用于微透镜阵列和显微镜筒镜的距离的准确标定以及ccd相机的传感器面和微透镜阵列的距离的粗调；稀标定样品可形成点扩散函数图像，用于ccd相机的传感器面和微透镜阵列的距离的准确标定；
步骤二：选取浓标定样品，将其置于荧光显微镜9的载物台上，打开激光器15，通过目镜观察浓标定样品，调整其离显微镜物镜2的距离，直到观察到的样品最为清晰，此时浓标定样品即处于显微镜物镜2的焦平面1处；
步骤三：打开相机软件，设定为实时界面，即计算机16显示的图像为ccd相机14实时拍摄的图像，将ccd相机14与中继系统12通过卡口相连，此时中继系统12的后镜头与相机传感器面13的距离l3与中继镜焦距相等，使得相机传感器面13处于中继系统12后焦面，l3标定完成，调整微透镜阵列10和中继系统12的距离l2，直到相机实时界面显示出最为清晰的微透镜网格，此时微透镜阵列10处于中继系统12前焦面，即微透镜阵列10可以1∶1的成像在相机传感器面13上；
步骤四：整体移动微透镜阵列10、中继系统12和ccd相机14，固定三者相对距离，即保持l2和l3大小不变，改变微透镜阵列10与显微镜筒镜8的距离l1，用ccd相机14记录不同l1值下浓标定样品经过荧光显微镜9和微透镜阵列10成像后形成的图像；
步骤五：计算步骤四所得图像的清晰度评估值，当清晰度评估值最大时，固定微透镜阵列10的位置，此时微透镜阵列10即处于显微镜筒镜9的成像面上，l1标定完成。
清晰度评估值的计算可采用基于brenner梯度函数、smd(灰度方差)函数、能量梯度函数等的多种清晰度算法以及基于点锐度的清晰度算法。基于点锐度的清晰度算法优点在于能够比较精确地反映图像的清晰度，计算也较快。在本实施例中选用基于点锐度的清晰度算法。
基于点锐度的清晰度算法的计算公式如下：
其中：eav表示清晰度评估值，m和n为图像的行数和列数，∑为累加符号，i和a为累加符号∑中的循环变量，di为灰度变化幅值，dx为像元间的距离增量。在实际应用中，di/dx可取像素8邻域进行计算，对于水平和竖直方向可取权重(距离增量)为1，而在45°和135°方向上可设为1/2。
取清晰度评估值最大时微透镜阵列10与显微镜筒镜9的距离l1为标定距离零点，清晰度评估值随标定距离的变化图如图3所示，清晰度评估值最大时ccd相机13记录的图像如图4所示。
步骤六：整体平移中继系统12和ccd相机14，改变其与微透镜阵列10的距离，即保持l1和l3的大小不变，只改变l2的大小，直到ccd相机14的实时界面出现相邻子图像相切的情况，如图5所示，此时ccd相机14的位置粗调完成；
步骤七：选取稀标定样品，将其置于荧光显微镜9的载物台上，通过目镜观察稀标定样品，调整其离物镜2的距离，直到观察到的样品最为清晰，使得稀标定样品处于显微镜物镜2焦面处，进一步微调ccd相机14的位置；
步骤八：转动荧光显微镜9的细准焦螺旋，使得稀标定样品处于不同离焦深度，记录下离焦深度分别为40μm、50μm、60μm、70μm、80μm和90μm时，单个示踪粒子经过荧光显微镜9和微透镜阵列10成像之后在相机传感器面13形成的图像，此即为实验获得的psf图像；
步骤九：计算步骤八所得的psf图像与通过阿贝成像理论计算得到的相同条件下的psf图像的相似度函数值。相似度函数值可通过基于结构相似性的图像质量评价算法、psnr以及余弦相似度等得出。psnr以及余弦相似度这些算法没有考虑图像的结构，psf图像的重点就是结构，所以本实施例优选基于结构相似性的图像质量评价算法。
基于结构相似性的图像质量评价算法的计算公式如下：
其中：ssim(t1，t2)为图像相似度函数值，t1，t2分别为比较的两张图像，μ1和μ2分别是t1和t2的平均值，σ12是t1和t2的协方差，
阿贝成像理论的psf计算公式如下：
其中：h(x，y，z)为psf，x，y，z分别为点源坐标，j为虚数单位，ξ和η分别为坐标x和y的空间频率；
其中：变量v和u表示图像面横向和轴向光学坐标，m为物镜的放大倍率，sin(α)＝na，α为物镜孔径角的半数，na为物镜的数值孔径，ρ是物镜孔径的规格化径向坐标，p(ρ)归一化光瞳函数，
步骤十：整体移动中继系统12和ccd相机14，微调其与微透镜阵列10的距离，即只改变l2的大小，比较不同l2值下通过步骤八和九得到的图像相似度函数值。不同离焦深度的图像为一组，不同距离(l2值)为不同组。离焦深度为50μm的粒子的psf的图像相似度随标定距离的变化图如图6所示，其中标定距离零点定义为图像相似度函数最大值对应的位置，由于只有当psf边缘发生一个像素的位移时才会引起图像相似度函数值的变化，而psf边缘发生一个像素的位移对应的l2值的变化，即标定精度可根据下式得出：
其中：δz为标定精度，px为像素宽度，num为微透镜阵列横向微透镜数量和纵向微透镜数量中的小值，d为单个微透镜孔径，fμl为单个微透镜在入射光波长为584nm时的焦距。本实施例的设备参数为：px＝5.5μm，num＝66，d＝136μm，fμl＝2260μm，因此本实施例的标定精度为6μm。
当图像相似度函数值最大时，固定中继系统12和ccd相机14，此时实验psf和阿贝成像理论psf对比图如图7所示，图像相似度函数值如表1所示，这时相机传感器面13记录的信息为微透镜阵列10后焦面11的光强分布，即微透镜阵列10的后焦面11的光强分布恰好可以通过中继系统12而1∶1的成像在相机传感器面13上，l2标定完成；
表1图像相似度函数值表
步骤十一：关闭激光器15，保持微透镜阵列10、中继系统12和ccd相机14同轴，利用笼杆17与笼板18进行固定。
标定完成。
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