一种双阀三泵高效液相色谱系统的制作方法

本发明涉及高效液相色谱技术领域，具体地说是一种双阀三泵高效液相色谱系统。

[背景技术]

从1903年色谱的使用开始，各种色谱技术应运而生，其中高效液相色谱由于分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广等优点，成为最为常用的分离和检测手段，在药物学、食品科学、环境监测领域等都有广泛应用。进入21世纪以来，色谱技术的发展已渐趋成熟，基础性的创新成果十分有限，但技术性的进步一直在进行着，尤其是与行业相关的应用性研究仍十分活跃。

2014年中粮营养健康研究院谢云峰等报道了在线固相萃取-高效液相色谱联用测定动物源食品中维生素a,e的方法，该方法利用双梯度液相色谱系统结合柱切换技术，通过一阀两泵和固相萃取柱及分析柱之间的流路切换设置实现了在线固相萃取与高效液相色谱的联用。此方法虽实现了在线净化，在维生素a,d,e的分析中，由于方法灵敏度的问题，仅适用于分析维生素a.e。不久，赛默飞发布了在线二维柱切换法同时测定饲料中维生素a,d,e的解决方案，该方法利用在线二维柱切换结合高效液相色谱，通过两阀两泵和两分析柱之间的流路切换设置实现了维生素a,d,e一次进样的同时检测。但由于方法前处理仍需皂化萃取浓缩等步骤，前处理过程繁琐复杂，耗时耗人力，大大影响样品的分析效率。

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技术实现要素：
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本发明的目的就是要解决上述的不足而提供一种双阀三泵高效液相色谱系统，能够应用于奶粉中维生素a,d,e的含量测试，且极大地简化了样品前处理操作步骤，节省了人力和试剂成本，显著提高了样品的分析效率。

为实现上述目的设计一种双阀三泵高效液相色谱系统，包括固相萃取进样泵1、自动进样器2、外置六通阀3、废液收集装置10、固相萃取柱11、一维分析泵12、一维分析柱13、可变波长检测器20、二维分析泵21、二维捕获柱22、二维分析柱23、二极管阵列检测器24、箱内六通阀25，所述外置六通阀3上设有外置第一阀口4、外置第二阀口5、外置第三阀口6、外置第四阀口7、外置第五阀口8、外置第六阀口9，所述箱内六通阀25上设有箱内第一阀口14、箱内第二阀口15、箱内第三阀口16、箱内第四阀口17、箱内第五阀口18、箱内第六阀口19，其中，所述固相萃取进样泵1与自动进样器2连接，用于实现样品分析溶液的吸取和进样；所述自动进样器2另一端与外置六通阀3的外置第一阀口4连接；所述固相萃取柱11两端分别与外置六通阀3的外置第二阀口5和外置第四阀口7连接，其正向流路用于实现样品分析溶液的一次净化，反向流路用于实现富集分析物的洗脱进样；所述废液收集装置10与外置六通阀3的外置第三阀口6连接，用于收集洗脱液；所述一维分析泵12与外置六通阀3的外置第五阀口8连接，用于运输流动相平衡一维分析柱13和反向洗脱富集在固相萃取柱11的目标物；所述一维分析柱13一端与外置六通阀3的外置第六阀口9连接，一维分析柱13另一端与箱内六通阀25的箱内第一阀口14连接，用于分析部分目标物；所述可变波长检测器20与箱内六通阀25的箱内第二阀口15连接，用于检测目标物；所述二维捕获柱22两端分别与箱内六通阀25的箱内第三阀口16和箱内第六阀口19连接，其正向流路用于实现富集分析物的洗脱进样，反向流路用于实现样品分析溶液的二次净化；所述二维分析泵21与箱内六通阀25的箱内第四阀口17连接，用于运输流动相平衡二维分析柱23和正向洗脱富集在二维捕获柱22的目标物；所述二维分析柱23一端与箱内六通阀25的箱内第五阀口18连接，所述二维分析柱23另一端与二极管阵列检测器24连接，用于检测目标物。

进一步地，还包括控制系统，所述控制系统为openlabcds2.2色谱数据系统。

进一步地，当固相萃取柱11处于上样状态时，一维分析柱13、二维捕获柱22及二维分析柱23处于平衡状态，外置六通阀3流路设置为：2→4→5→7→6→10；12→8→9→13；箱内六通阀25流路设置为：13→14→15→20；21→17→16→19→18→23。

进一步地，当固相萃取柱11处于洗脱状态时，目标物转移至一维色谱柱，二维捕获柱22及二维分析柱23处于平衡状态，外置六通阀3流路设置为：12→8→7→5→9→13；2→4→6→10；箱内六通阀25流路设置为：13→14→15→20；21→17→16→19→18→23。

进一步地，当固相萃取柱11处于洗清状态时，目标物从一维色谱柱洗脱，二维捕获柱22及二维分析柱23处于平衡状态，外置六通阀3流路设置为：2→4→5→7→6→10；12→8→9→13；箱内六通阀25流路设置为：13→14→15→20；21→17→16→19→18→23。

进一步地，当固相萃取柱11处于洗清状态时，部分目标物从一维色谱柱转移至二维捕获柱22，二维分析柱23处于平衡状态，外置六通阀3流路设置为：2→4→5→7→6→10；12→8→9→13；箱内六通阀25流路设置为：21→17→18→23；13→14→19→16→15→20。

进一步地，当固相萃取柱11处于平衡状态时，部分目标物从二维捕获柱22转移至二维分析柱23，一维分析柱13处于平衡状态，外置六通阀3流路设为：2→4→5→7→6→10；12→8→9→13；箱内六通阀25流路设置为：13→14→15→20；21→17→16→19→18→23。

本发明还提供了一种配有双阀三泵的高效液相色谱系统测定奶粉中维生素a,d,e的方法，包括以下步骤：

1)样品处理：将奶粉样品混匀，称取适量，加入水、无水乙醇、抗坏血酸、bht及koh水溶液，加热皂化，皂化完成后冷却定容；

2)采用配有双阀三泵系统的高效液相色谱仪测定步骤1)所得的溶液中是否含有维生素a,d,e：若一维液相色谱结果显示样品疑似含有维生素a,e时，则比较样品与维生素a,e标准物质的保留时间，以确认样品中是否含有维生素a,e；若二维液相色谱显示样品疑似含有维生素d时，则比较样品与维生素d标准物质的保留时间，以确认样品中是否含有维生素d；

3)若确认样品中含有维生素a,d,e，则通过公式计算样品中维生素a,d,e的含量。

本发明同现有技术相比，具有如下优点：

(1)本发明建立了一种结合多种分离机理的配有双阀三泵，可实现在线固相萃取净化和分析的高效液相色谱系统，并将其应用于奶粉中维生素a,d,e的含量测试，一次进样同时检测，简化操作步骤，大大缩短前处理的时间，节省人力和试剂成本，实现自动在线净化检测，提高灵敏度，保证测试结果的准确性和再现性，从源头防止维生素强化剂量不准给消费者健康带来的不利影响。

(2)本发明为配有双阀三泵连接四根色谱柱的高效液相色谱系统，通过固相萃取与高效液相色谱系统在线连接，同时结合柱切换技术，实现了样品溶液的净化与二维色谱分析的自动连接；固相萃取柱在线净化分析溶液，一维色谱分析部分目标物，二维色谱分析部分目标物；同时，二维色谱中首次使用了捕获柱，有效解决了由于目标物在二维色谱分配行为过程中由于扩散现象而导致的色谱峰过宽灵敏度降低的问题。

(3)本发明中目标物富集在净化柱和捕获柱后，均采用与净化过程流路相反方向洗脱的方式，将目标物转移至分析柱中，获得的色谱峰，峰宽适中，对称性好。

(4)本发明中采用的色谱柱填料均为耐强碱的物质。

(5)本发明成功应用在奶粉中维生素a,d,e的同时测定中，通过皂化液直接定容后上机分析，巧妙的避免了有机溶剂转相、浓缩、复溶的步骤，极大的简化样品前处理操作步骤，显著提高样品的分析效率。同时，由于前处理过程简化，降低了维生素a,d,e在分析过程中氧化降解的风险，确保测试结果的准确性和再现性。

[附图说明]

图1是本发明spe上样时分析溶液流路示意图；

图2是本发明spe洗脱，目标物转移至一维色谱柱时分析溶液流路示意图；

图3是本发明spe清洗，部分目标物从一维色谱柱洗脱时分析溶液流路示意图；

图4是本发明spe清洗，部分目标物从一维色谱柱转移至捕获柱时分析溶液流路示意图；

图5是本发明spe平衡，部分目标物从捕获柱转移是二维分析柱时分析溶液流路示意图；

图中：1、固相萃取进样泵2、自动进样器3、外置六通阀4、外置第一阀口5、外置第二阀口6、外置第三阀口7、外置第四阀口8、外置第五阀口9、外置第六阀口10、废液收集装置11、固相萃取柱12、一维分析泵13、一维分析柱14、箱内第一阀口15、箱内第二阀口16、箱内第三阀口17、箱内第四阀口18、箱内第五阀口19、箱内第六阀口20、可变波长检测器21、二维分析泵22、二维捕获柱23、二维分析柱24、二极管阵列检测器25、箱内六通阀。

[具体实施方式]

本发明提供了一种结合多种分离机理的配有双阀三泵连接四根色谱柱，可实现在线固相萃取净化和分析的双阀三泵高效液相色谱系统，包括固相萃取进样泵1、自动进样器2、外置六通阀3、废液收集装置10、固相萃取柱11、一维分析泵12、一维分析柱13、可变波长检测器20、二维分析泵21、二维捕获柱22、二维分析柱23、二极管阵列检测器24、箱内六通阀25及控制系统，外置六通阀3上设有外置第一阀口4、外置第二阀口5、外置第三阀口6、外置第四阀口7、外置第五阀口8、外置第六阀口9，箱内六通阀25上设有箱内第一阀口14、箱内第二阀口15、箱内第三阀口16、箱内第四阀口17、箱内第五阀口18、箱内第六阀口19；固相萃取进样泵1与自动进样器2连接，用于实现样品分析溶液的吸取和进样；自动进样器2另一端与外置六通阀3的外置第一阀口4连接；固相萃取柱11两端分别与外置六通阀3的外置第二阀口5和外置第四阀口7连接，其正向流路用于实现样品分析溶液的一次净化，反向流路用于实现富集分析物的洗脱进样；废液收集装置10与外置六通阀3的外置第三阀口6连接，用于收集洗脱液；一维分析泵12与外置六通阀3的外置第五阀口8连，用于运输流动相平衡一维分析柱13和反向洗脱富集在固相萃取柱11的目标物；一维分析柱13一端与外置六通阀3的外置第六阀口9连接，一维分析柱13另一端与箱内六通阀25的箱内第一阀口14连接，用于分析部分目标物；可变波长检测器20与箱内六通阀25的箱内第二阀口15连接，用于检测目标物；二维捕获柱22两端分别与箱内六通阀25的箱内第三阀口16和箱内第六阀口19连接，其正向流路用于实现富集分析物的洗脱进样，反向流路用于实现样品分析溶液的二次净化；二维分析泵21与箱内六通阀25的箱内第四阀口17连接，用于运输流动相平衡二维分析柱23和正向洗脱富集在二维捕获柱22的目标物；二维分析柱23一端与箱内六通阀25的箱内第五阀口18连接，二维分析柱23另一端与二极管阵列检测器24连接，用于检测目标物；控制系统为openlabcds2.2色谱数据系统。

其中，控制系统为openlabcds2.2，利用控制平台和供电系统与各装置之间建立连接与通讯，将测试方法、测试逻辑、判断标准编辑成测试流程软件，通过控制测试系统来替代人员操作，采用该自动化测试流程进行测试。

当固相萃取柱处于上样状态时，一维分析柱，二维捕获柱及二维分析柱处于平衡状态，外置六通阀3流路设置为：2→4→5→7→6→10；12→8→9→13；箱内六通阀25流路设置为：13→14→15→20；21→17→16→19→18→23。

当固相萃取柱洗脱处于状态时，目标物转移至一维色谱柱，二维捕获柱及二维分析柱处于平衡状态，外置六通阀3流路设置为：12→8→7→5→9→13；2→4→6→10；箱内六通阀25流路设置为：13→14→15→20；21→17→16→19→18→23。

当固相萃取柱处于洗清状态时，目标物从一维色谱柱洗脱，二维捕获柱及二维分析柱处于平衡状态，外置六通阀3流路设置为：2→4→5→7→6→10；12→8→9→13；箱内六通阀25流路设置为：13→14→15→20；21→17→16→19→18→23。

当固相萃取柱处于洗清状态时，部分目标物从一维色谱柱转移至二维捕获柱，二维分析柱处于平衡状态，外置六通阀3流路设置为：2→4→5→7→6→10；12→8→9→13；箱内六通阀25流路设置为：21→17→18→23；13→14→19→16→15→20。

当固相萃取柱处于平衡状态时，部分目标物从二维捕获柱转移至二维分析柱，一维分析柱处于平衡状态，外置六通阀3流路设置为：2→4→5→7→6→10；12→8→9→13；箱内六通阀25流路设置为：13→14→15→20；21→17→16→19→18→23。

本发明成功应用于奶粉中维生素a,d,e的测试，通过固相萃取与高效液相色谱系统在线连接，实现了样品溶液的净化与二维色谱分析的自动连接。一维色谱分析部分目标物，二维色谱分析部分目标物。同时二维色谱中首次使用了捕获柱，有效解决了由于目标物在色谱分配行为过程中由于扩散现象而导致的色谱峰过宽灵敏度降低的问题。

本发明所述的配有双阀三泵的高效液相色谱系统测定奶粉中维生素a,d,e的方法，包括以下步骤：

1)样品处理：将奶粉样品混匀，称取适量，加入水，无水乙醇，抗坏血酸，bht及koh水溶液，加热皂化，皂化完成后冷却定容。

2)采用配有双阀三泵系统的高效液相色谱仪测定步骤1)所得的溶液中是否含有维生素a,d,e：若一维液相色谱结果显示样品疑似含有维生素a,e时，则比较样品与维生素a,e标准物质的保留时间，以确认样品中是否含有维生素a,e；若二维液相色谱显示样品疑似含有维生素d时，则比较样品与维生素d标准物质的保留时间，以确认样品中是否含有维生素d。

3)若确认样品中含有维生素a,d,e，则通过公式计算样品中维生素a,d,e的含量。

本发明并不受上述实施方式的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。