一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒的间接ELISA检测方法与流程

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒的间接elisa检测方法。

背景技术

禽呼肠孤病毒属于呼肠孤病科(reovirdae)正呼肠孤病毒属(orthoreovirus)，可以引起禽类发生多种疾病，其临床表现因病毒毒株、毒力或感染宿主的不同而有差异。

2017年起，我国山东、河北、河南及江苏、安徽等地鸭大范围爆发以脾坏死为主要症状的传染性疾病，该病主要引起各个年龄阶段鸭脾脏肿大、出血和坏死，导致种鸭产蛋和肉鸭食欲减退、消瘦，生长发育不良，脾脏出现数个程度不同的坏死灶，肿大、出血、边缘增生。鸭料肉比升高，肉鸭出栏合格率显著降低，对肉鸭以及种鸭养殖业造成严重经济损失。

研究证实，这种以脾脏坏死为主要症状的高发病率鸭传染病的病原为一种新型的鸭呼肠孤病毒，属于新发传染病，对该病毒的生物学特性、致病机制等的研究尚处于起步阶段，目前仍缺少有效的疫苗免疫和预防控制措施，对于该新型病毒的血清学检测方法目前也尚未有报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒的间接elisa检测方法。可以对新爆发的以脾脏坏死为主要症状的新型鸭呼肠孤病毒的抗体进行快速、有效的检测，以监测鸭群中新型鸭呼肠孤病毒的流行情况。

该新型鸭呼肠孤病毒的保藏编号为cctccno：v201843，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年7月18日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，分类命名为新型鸭呼肠孤病毒n-drv-xt18株。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种检测新型鸭呼肠孤病毒抗体的间接elisa检测试剂盒，所述间接elisa检测试剂盒包含包被有新型鸭呼肠孤病毒σc蛋白重组抗原的酶标板；

所述新型鸭呼肠孤病毒σc蛋白重组抗原的制备方法如下：

以保藏编号为cctccno：v201843的鸭呼肠孤病毒的全基因序列为模板，利用引物对扩增得到σc基因片段，构建重组表达载体，通过原核表达系统表达新型鸭呼肠孤病毒σc蛋白重组抗原；

所述引物对包括：

上游引物σc-f:5，-atacgcctgatactttccct-3’；(seqidno.1)

下游引物σc-r:5’-gcgcaatgagaagagctattcatc-3’。(seqidno.2)

进一步的，将所述重组表达载体转化至bl21(de3)感受态细胞中，加入iptg进行诱导表达；将表达产物经过变性和复性后，获得纯化的新型鸭呼肠孤病毒σc蛋白重组抗原。

作为优选，所述新型鸭呼肠孤病毒σc蛋白重组抗原的包被量为500ng/孔。

进一步的，所述间接elisa检测试剂盒还包含：酶标抗体、样品稀释液、洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液a、b和终止液。

优选的，所述酶标抗体为酶标羊抗鸭抗体。

上述间接elisa检测试剂盒在新型鸭呼肠孤病毒的流行病学调查中的应用也是本发明的保护范围；

所述新型鸭呼肠孤病毒的保藏编号为cctccno：v201843。

本发明的第二方面，提供一种新型鸭呼肠孤病毒抗体的间接elisa检测方法，包括以下步骤：

(1)包被：以保藏编号为cctccno：v201843的新型鸭呼肠孤病毒σc重组蛋白作为包被抗原，将抗原稀释后加入到酶标板孔中，4℃孵育过夜或37℃孵育2-4h，采用含0.05％吐温的pbst洗涤；

(2)封闭：采用pbst稀释5％脱脂奶粉200μl/孔进行封闭，37℃条件下孵育1h后甩干，用pbst洗涤；

(3)血清作用条件：每孔加入待检血清稀释混合液，37℃条件下孵育1h后甩干，用pbst洗涤；

(4)添加酶标抗体：将酶标羊抗鸭抗体用pbst按1：500稀释，每孔加100μl，37℃条件下作用1h后甩干，用pbst洗涤；

(5)底物显色：tmb底物显色液100μl/孔，37℃条件下避光作用15min；

(6)终止反应：每孔加50μl终止液终止显色反应；采用酶标仪吸光度450nm下读取数据；

(7)阴阳性临界值的确定：根据公式：阴阳性临界值＝阴性样本od450平均值+标准偏差3sd，得到阴阳性临界值；当od450在0.072以上，判定为阳性。

步骤(1)中，所述新型鸭呼肠孤病毒σc重组蛋白由如下方法制备而成：

以保藏编号为cctccno：v201843的新型鸭呼肠孤病毒的全基因序列为模板，利用引物对扩增得到σc基因片段，构建重组表达载体；将重组表达载体转化至bl21(de3)感受态细胞中，加入iptg进行诱导表达；将表达产物经过变性和复性后，获得纯化的鸭呼肠孤病毒σc重组蛋白；

所述引物对包括：

上游引物σc-f:5，-atacgcctgatactttccct-3’；(seqidno.1)

下游引物σc-r:5’-gcgcaatgagaagagctattcatc-3’。(seqidno.2)

本发明的有益效果：

针对新发现的能够导致鸭脾脏坏死的新型鸭呼肠孤病毒，本发明建立了检测该新型鸭呼肠孤病毒抗体的间接elisa检测方法，该检测方法具有简便、快速、稳定、特异性强、灵敏度高等特性，能够对鸭群中新型鸭呼肠孤病毒σc特异性抗体进行检测，并以此为依据来检测鸭群中呼肠孤病毒的抗体水平，从而监测鸭群中新型鸭呼肠孤病毒的流行情况。

附图说明

图1：重组蛋白σc在bl21感受态中诱导表达及蛋白纯化sds-page分析图；其中，m泳道为蛋白质标准；第1泳道为空载，第2泳道为未诱导全菌，第3泳道为诱导菌裂解后上清，第4泳道为诱导菌裂解后沉淀。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所介绍的，2017年起，我国山东、河北、河南及江苏、安徽等地鸭大范围爆发以脾坏死为主要症状的传染性疾病。经研究发现该传染性疾病是由新型呼肠孤病毒所引起的。目前尚无能够有效控制该新型鸭呼肠孤病毒感染的药物和方法。基于此，本发明提出了一种能检测新型鸭呼肠孤病毒抗体的间接elisa检测试剂盒，对新爆发的以脾脏坏死为主要症状的新型鸭呼肠孤病毒的抗体进行快速、有效的检测，以监测鸭群中新型鸭呼肠孤病毒的流行情况，以便能及早发现感染鸭群对其采取隔离或扑杀措施，以减少新型鸭呼肠孤病毒感染所带来的损失。

我们知道，禽呼肠孤病毒的宿主范围较广，各种禽类中普遍存在这种病毒，自1954年以来已经在鸡、鹅、鸽子、鸵鸟、鸭、火鸡及其它野鸡等多种发病或是健康的禽类中分离到呼肠孤病毒，而从不同宿主中分离到的呼肠孤病毒其存在较大的变异性，其致病性、基因序列和主要蛋白的编码都存在差异。

本申请发明人从发病鸭脾脏组织中分离出一株鸭呼肠孤病毒n-drv-xt18，对上述新分离的鸭呼肠孤病毒n-drv-xt18进行了全基因组测序，并分别将10个基因片段与现有报道的禽呼肠孤病毒进行了序列比对和同源性分析，结果发现，新分离毒株n-drv-xt18的10个基因片段中l1、l2、l3、m1、m2、s3、s4均位于一个相对独立的分支中，且与目前已经上传在genbank中鸭源呼肠孤病毒序列变异性较大，说明新分离的毒株n-drv-xt18确实不同于其他的禽呼肠孤病毒，可以认定本发明中所发现的鸭呼肠孤病毒与现有已经报道的鸭呼肠孤病毒存在较大变异，为正呼肠孤病毒属的1个新的单独种。因此，本发明将该新型鸭呼肠孤病毒保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：v201843。

本发明首次用血清学的方法对新型的鸭呼肠孤病毒进行抗体检测。能够对新爆发的以脾脏坏死为主要症状的新型鸭呼肠孤病毒抗体进行快速有效地检测，是一种简便的适于基层使用的间接elisa检测方法。

在本发明的一个实施方案中，所给出的新型鸭呼肠孤病毒间接elisa检测方法，包括以下步骤：

(1)包被抗原的制备：

通过二代测序技术获得新型鸭呼肠孤病毒的全基因序列，全基因组序列中l1、l2、l3、m1、m2、m3、s1、s2、s3、s4这10个基因片段的序列分别如seqidno.3-seqidno.12所示。根据所获得的新型鸭呼肠孤病毒的σc蛋白基因序列，设计两条引物：

上游引物σc-f:5，-atacgcctgatactttccct-3’

下游引物σc-r:5’-gcgcaatgagaagagctattcatc-3’。

用上述引物通过普通pcr方法将反转录获得的cdna扩增出长度为980bp的σc基因序列(seqidno.13所示)，并通过凝胶电泳和胶回收的方式纯化，将纯化后的cdna克隆到原核表达载体pet-28a(+)中，构建重组原核表达载体pet28a-σc；将重组原核表达载体pet-σc转化至bl21(de3)感受态细胞中，经1mmiptg诱导高效表达了重组蛋白σc，该蛋白均以包涵体的形式存在，包涵体经过变性和复性，将纯化的呼肠孤病毒σc蛋白作为包被抗原。

(2)以纯化后的呼肠孤σc重组蛋白做包被抗原建立间接elisa：

①包被：抗原按所需浓度用pbs(ph＝7.2左右)或用1×碳酸盐缓冲液(ph＝9.6)稀释后包被到96孔酶标板(elisa板)中，保鲜膜包好，4℃孵育过夜或37℃孵育数小时，采用含0.05％吐温(质量浓度)的pbst洗涤三次，每遍4min；

②封闭：封闭采用pbst稀释5％脱脂奶粉(质量浓度)200μl/孔，37℃条件下孵育数小时后甩干，用pbst洗涤3遍，每遍4min；

③血清作用条件：每孔加入适量待检血清稀释混合液，37℃条件下孵育数小时后甩干，用pbst洗涤3遍，每遍4min；

④羊抗鸭酶标二抗作用条件：羊抗鸭酶标二抗用pbst做适量稀释后，每孔100μl，37℃条件下作用1h后甩干，用pbst洗涤4遍，每次4min；

⑤底物显色：tmb底物显色液100μl/孔，37℃条件下避光作用15min；

⑥终止反应：每孔加50μl2mh2so4终止液终止显色反应；

⑦读数：采用酶标仪吸光度450nm下读取数据。

(3)结果判定标准：

根据公式：阴阳性临界值＝阴性样本od450平均值+标准偏差3sd，得到阴阳性临界值；当od450在0.072以上，判定为阳性。

由于禽呼肠孤病毒为rna病毒，有多个分段，不同毒株间在抗原结构、致病性、细胞培养特性以及宿主特异性等方面存在一定的差异，在遗传进化时容易发生变异。因此，不同呼肠孤病毒的抗原性、致病性、基因序列和主要蛋白的编码都会存在差异。采用间接elisa检测呼肠孤病毒抗体，首要的是明确目标基因的序列，根据目标基因序列设计合成抗原蛋白进行检测。但是，本发明所要检测的导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒为新分离的毒株，其基因组成未知，而且与现有已经报道的鸭呼肠孤病毒存在较大变异，也无法根据现有的鸭呼肠孤病毒的基因组序列设计合成抗原蛋白。

对于该新型鸭呼肠孤病毒间接elisa检测而言，包被抗原的选择非常关键，直接决定检测方法的特异性。为优选包被抗原，本发明在试验过程中根据该新型鸭呼肠孤病毒的主要抗原位点区域分别设计引物对，扩增得到基因片段，构建重组表达载体；将重组表达载体转化至bl21(de3)感受态细胞中，加入iptg进行诱导表达；将表达产物经过变性和复性后，获得纯化重组蛋白，将获得的重组蛋白分别作为包被抗原，构建间接elisa检测试剂盒。应用临床上已确诊的血清样本对不同包被抗原制备的间接elisa检测试剂盒的特异性进行考察。结果显示，以本发明纯化的呼肠孤病毒σc蛋白作为包被抗原制备的间接elisa检测试剂盒对已确诊血清样本检测的准确率达100％，其检测的敏感性和特异性均显著优于以其他重组蛋白作为包被抗原制备的间接elisa检测试剂盒。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明中所用到的部分试剂及组分如下：

包被缓冲液：1×碳酸盐缓冲液(100ml，ph＝9.6)：na2co30.2756g，nahco30.6216g，用蒸馏水溶解并定容至100ml，ph值9.5-9.7，4℃保存。

pbs溶液：nacl4.25g，nah2po4·2h2o0.178g，na2hpo4·12h2o1.386g，用蒸馏水溶解并定容至500ml，ph值7.1-7.3。

pbst溶液：每1lpbs加入tween-200.5ml，充分混匀。

pbst封闭液：将5gdrymilk溶解于100mlpbst稀释液中，短期保存于4℃，长期保存于-20℃。

tmb显色液：

buffera：称取66.5063g柠檬酸钠用800ml蒸馏水溶解并用浓hcl调ph至4.0，加入h2o定容至1l，4℃保存；

bufferb：称取0.2956g四甲基联苯胺(tmb)，0.0633g四丁基硼氢化铵(tbabh)溶于30ml二甲基乙酰胺(dma)，4℃避光保存；

使用时，将buffera和bufferb以体积39:1的比例混合，现用现配。

2mh2so4终止液：将浓h2so4以体积比1:5的比例加入蒸馏水中，混匀冷却至室温即为2mh2so4终止液。

本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如j.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；d.l.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。

实施例1：包被抗原的制备

1.1特异性引物设计和合成：根据该新型鸭呼肠孤病毒(保藏编号为cctccno：v201843)全基因序列σc蛋白编码区设计一对引物，引物两段分别设有bamhⅰ和salⅰ酶切位点，预计可以扩增出该新型鸭呼肠孤病毒基因组中980bp的基因片段。

上游引物σc-f:5，-atacgcctgatactttccct-3’；

下游引物σc-r:5’-gcgcaatgagaagagctattcatc-3’。

1.2pet28a-σc原核表达载体的构建：

采用特异性上下游引物通过pcr扩增出σc基因片段，将纯化后的片段与pmd18-t载体连接，连接产物转化到dh5α感受态细胞中，挑取阳性菌落摇菌提取t-σ重组质粒。用限制性内切酶bamhⅰ和salⅰ(购自大连宝生物公司)分别对t-σ重组质粒和pet-28a(+)载体进行双酶切，用t4dna连接酶(购自大连宝生物公司)连接两者酶切产物。连接产物转化到dh5α感受态细胞中，采用pcr方法和酶切鉴定阳性克隆，阳性克隆送至青岛擎科生物技术有限公司测序。

挑取单个阳性克隆菌落pcr鉴定结果表明能扩增到980bp左右的目的条带，与预计的σc基因片段大小一致。挑取单个阳性克隆菌落进行增菌培养后提取质粒，用限制性内切酶bamhⅰ和salⅰ进行酶切鉴定，酶切条带正确。阳性克隆测序结果显示σc基因插入位置、插入方向和阅读框正确，结果表明重组载体pet28a-σc构建成功。

1.3重组蛋白σc诱导表达与鉴定：

将构建成功的重组载体pet28a-σc质粒转化到bl21感受态细胞中，挑取单个菌落进行增菌培养，次日按1:100的比例接种于含100μg/mlkan⁺的2×yt培养基中，37℃，200r/min震荡培养至od600在0.6-1.0之间取出1ml菌液作为诱导前对照，余下培养物中加入iptg至终浓度为1mm，继续37℃200r/min振荡培养6h，结束诱导。分别取诱导和非诱导菌液2ml，离心后收集细菌沉淀，用50μlpbs重悬细菌。样品加2×sds凝胶加样缓冲液50μl混匀，煮沸处理5min后震荡裂解细菌，稍离心后取上清进行sds-page，鉴定蛋白是否表达。取诱导培养菌液离心后弃上清收集细菌沉淀，用pbs悬浮细菌后超声波裂解至清亮，4℃条件下10,000×g/min离心5min，分别取上清和沉淀悬浮液加2×sds凝胶加样缓冲液混匀，煮沸处理5min后sds-page鉴定蛋白表达方式。

1.4蛋白纯化：

按照1.3中蛋白诱导表达条件进行大量诱导培养。取包涵体参照试剂盒说明书进行蛋白纯化，去回收蛋白质样品处理后，进行sds-page鉴定蛋白纯度。

sds-page分析显示，重组蛋白σc在bl21感受态细胞中成功表达，全部以包涵体的形式存在，蛋白分子量大小为40kda，与预期的重组σc大小一致(参见图1)。

1.5westernblotting分析：按照1.3中方法诱导表达蛋白，分别取诱导和非诱导全菌sds-page，参照常规westernblotting方法进行操作，最后采用增强hrp-dab底物显色试剂进行显色。结果显示：与sds-page对比，pet28a-σc转化bl21感受态细胞诱导后在westernblotting对应位置出现特异性的条带，而对照未诱导菌则无。结果表明重组蛋白sigmac能与阳性血清中抗体发生特异性抗原抗体反应。

实施例2：间接elisa检测新型鸭呼肠孤病毒抗体

取实施例1纯化重组蛋白σc做包被抗原建立间接elisa方法，采用方阵法摸索elisa最佳蛋白包被浓度和血清稀释浓度，以及elisa最佳反应条件。最终确定条件如下：

2.1包被：抗原用1×碳酸盐缓冲液(ph＝9.6)按1:1000稀释后，取10μl包被到96孔elisa板中，保鲜膜包好，37℃孵育2h，采用含0.05％吐温的pbst洗涤三次，每遍4min。检测孔σc蛋白包被量500ng/孔；

2.2封闭：封闭采用pbst稀释5％脱脂奶粉200μl/孔37℃条件下孵育1h后甩干，用pbst洗涤3遍，每遍4min；

2.3血清作用条件：每孔加入10μl待检血清和90μlpbst稀释的5％脱脂奶粉混合液，37℃条件下孵育1h后甩干，用pbst洗涤3遍，每遍4min；

2.4酶标羊抗鸭抗体作用条件：酶标羊抗鸭抗体用pbst按1：500稀释，每孔加100μl，37℃条件下作用1h后甩干，用pbst洗涤4遍，每次4min；

2.5底物显色：tmb底物显色液100μl/孔，37℃条件下避光作用15min；

2.6终止反应：每孔加50μl2mh2so4终止液终止显色反应；

2.7读数：采用酶标仪吸光度450nm下读取数据；

3、结果判定标准:

根据公式：阴阳性临界值＝阴性样本od450平均值+标准偏差3sd，得到阴阳性临界值；当od450在0.072以上，判定为阳性。

4、交叉反应性：用本发明建立的方法对鸭细小病毒、鸭坦布苏病毒、鸭腺病毒、鸭流感病毒、鸭呼肠孤病毒ndrv-jm85株、鸭呼肠孤病毒ndrv-th11株阳性血清及阴性血清进行检测，该方法只与新型鸭呼肠孤病毒(保藏编号为cctccno：v201843)阳性血清反应呈阳性，说明该方法具有很好的特异性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

sequencelisting

<110>山东农业大学

<120>一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒的间接elisa检测方法

<130>2018

<160>13

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atacgcctgatactttccct20

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gcgcaatgagaagagctattcatc24

<210>3

<211>3959

<212>dna

<213>毒株n-dav-xt18的l1基因

<400>3

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