一种用于黄曲霉毒素B1检测的电化学免疫传感器的制备及使用方法与流程

本发明涉及电化学免疫传感器的制备及使用方法，特别是指一种用于黄曲霉毒素b1检测的电化学免疫传感器的制备及使用方法。

背景技术：

黄曲霉毒素作为黄曲霉和寄生曲霉的次级代谢产物，在粮油食品中广泛存在，是自然界中已经发现污染农产品毒素最强的一类真菌毒素，对人和动物有强烈致癌性、致病性的一类霉菌毒素。常见的黄曲霉毒素根据化学结构的不同主要分为b1、b2、g1、g2四种，其中黄曲霉毒素b1的毒性最大，远超过砒霜、氰化钾的毒性。

目前黄曲霉毒素检测方法主要有酶联免疫法、高效液相色谱法(hplc)、薄层层析法（tlc）等。其中，酶联免疫吸附法特异性强、成本低，但由于酶的不稳定性，易导致复杂样品受干扰，致使检测准确度不高；hplc法选择性好、灵敏度高，但往往需要采用复杂、繁琐的样品净化手段以提高选择性，该方法不仅耗时，且仪器价格昂贵，对操作人员素质和实验条件均有较高要求；tlc法使用的设备试剂较为简单，但样品的前处理繁琐、耗时、准确性差，且使用大量有毒有机溶剂对实验人员有较大危害。

基于以上情况，亟需一种用于黄曲霉毒素b1检测的电化学免疫传感器的制备及使用方法，以解决以上电化学免疫传感器的制备及使用方法的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于黄曲霉毒素b1检测的电化学免疫传感器的制备及使用方法，以解决常见的电化学免疫传感器的制备及使用方法的成本高、效果差、危害大的问题。

为了达成目的，本发明提供一种用于黄曲霉毒素b1检测的电化学免疫传感器的制备及使用方法，包括：电化学免疫传感器的制备方法；

具体为：制备纳米金溶液，然后将氧化石墨烯、硫堇、纳米金溶液置于带盖称量瓶中，称量瓶中放置搅拌磁子，加盖后用磁力搅拌器搅拌2-8h使瓶内材料充分混匀得到氧化石墨烯/硫堇/纳米金复合材料，将氧化石墨烯/硫堇/纳米金复合材料1-3s内滴于活化后的玻碳电极表面，接着将玻碳电极置于2-8℃冰箱中保存10-14h，直至玻碳电极表面呈一层固体状薄膜，然后将黄曲霉毒素b1单克隆抗体和玻碳电极先后置于微孔反应板一中，在2-8℃冰箱中静置2-8h，然后将玻碳电极置于2-8℃冰箱中直至玻碳电极表面干燥，再将牛血清蛋白溶液和玻碳电极先后置于微孔反应板二中，在2-8℃冰箱中静置1-5min，取出玻碳电极，在2-8℃冰箱中晾干得到修饰玻碳电极，即电化学免疫传感器；

在氧化石墨烯/硫堇/纳米金复合材料配置过程中：所述氧化石墨烯的浓度为0.5-1.5wt%，其用量为1体积份a1，硫堇的用量为1重量份b1，纳米金溶液的量为5-12体积份a1；所述1体积份a1与1重量份b1的关联关系为：1毫升对应1-5毫克；

在电化学免疫传感器的制备过程中：所述氧化石墨烯/硫堇/纳米金复合材料用量为1体积份a2，黄曲霉毒素b1单克隆抗体的用量为100-120体积份a2，牛血清蛋白溶液用量为100-120体积份a2。

优选地，所述纳米金溶液是将1体积份a3的质量分数为0.005-0.05%的氯金酸溶液倒入容器，加热搅拌至溶液沸腾并持续1-10min,加入0.01-0.1体积份a3的质量分数为0.2-5%的柠檬酸钠溶液，继续反应1-20min至合成液不再变色，停止加热，继续搅拌，待合成液冷却至20-28℃后，装瓶放入2-8℃冰箱储存。

优选地，所述玻碳电极在氧化石墨烯/硫堇/纳米金复合材料滴在其上之前依次经0.1-0.6μm、0.01-0.1μm粒径的氧化铝粉末在麂皮上打磨至表面光滑、无肉眼可见刮痕，将抛光后玻碳电极上残留的氧化铝粉末用去离子水冲洗干净，然后将该玻碳电极先后放入无水乙醇、去离子水中均超声清洗2-10min，将清洗后的玻碳电极放入0.03-0.5mol/l的硫酸溶液中，然后用循环伏安扫描法在0-3.6v的电压范围内扫描2-15圈以活化电极，活化完毕后，用去离子水将活化电极冲洗干净。

优选地，所述牛血清蛋白溶液是将每0.1-0.5g的牛血清蛋白用ph6.5-7.4磷酸盐缓冲溶液溶解定容60-120ml，得到体积分数为0.1-0.4%的牛血清蛋白溶液。

优选地，所述ph6.5-7.4的磷酸盐缓冲溶液是由0.01-0.15mol/l的磷酸氢二钾和0.01-0.15mol/l磷酸二氢钠按1:0.9-0.5的比例混合成。

优选地，所述搅拌器为磁力搅拌器，磁力搅拌器包括搅拌磁子、磁力搅拌台，所述搅拌磁子置于称量瓶中，称量瓶置于磁力搅拌台上。

优选地，包括：电化学免疫传感器使用方法，具体为：制备ph6.5-7.4的磷酸盐缓冲溶液，然后取抗原原液加入到磷酸盐缓冲溶液中，多次稀释得到浓度不同且等比例缩小的多份抗原稀释液底液，然后分别将不同的底液用磁力搅拌器搅拌20-70s使其混合均匀，将不同的搅拌后的底液滴在玻碳电极表面，分别采用三电极系统进行检测。

优选地，所述三电极系统包括：修饰玻碳电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和氯化钾电极为参比电极。

优选地，所述电化学免疫传感器对于黄曲霉毒素b1的检测过程在氮气氛围中进行。

本发明至少包括以下有益效果：

1.本发明所述方法制备的复合材料探针，不仅导电能力强、吸附能力强，同时检测方法简便、携带方便等。

2.本发明所述氧化石墨烯具有很好的物理吸附作用，硫堇能增强导电效果，纳米金能增大比表面积，使得电化学免疫传感器灵敏度高、响应时间短且检测成本低，实现了对黄曲霉毒素b1的快速检测。

3.本发明所述电化学免疫传感器表现出了强特异性，样品中其他非特异性分子对检测结果无影响、高灵敏性、检测的快速性。

4.本发明所述黄曲霉毒素的玉米样品处理方法简单。

5.本发明所述方法可以对黄曲霉毒素b1进行准确地定性和定量检测，最低检出限可达到2.394×10^-12μg/kg，在2.394×10^-12—3.810×10^-11μg/kg和1.172×10^-10—0.7863×10^-9μg/kg和2.347×10^-8—1.169×10^-7μg/kg内呈现良好的线性关系。

附图说明

图1是本发明的电化学免疫传感器制备及该传感器与抗体特异性结合示意图。

图2是本发明的电化学免疫传感器制备及该传感器与抗体特异性结合的侧面解剖图。

附图说明：a-氧化石墨烯/硫堇/纳米金复合材料，b-氧化石墨烯/硫堇/纳米金复合材料滴于玻碳电极表面形成薄膜，c-黄曲霉毒素b1单克隆抗体吸附于玻碳电极的薄膜表面，d-牛血清蛋白封闭电极表面吸附的非特异性位点，e-黄曲霉毒素b1单克隆抗体与黄曲霉毒素b1抗原特异性结合，a-玻碳电极，b-氧化石墨烯/硫堇/纳米金复合材料滴于玻碳电极表面形成薄膜,c-黄曲霉毒素b1单克隆抗体吸附于玻碳电极的薄膜表面，d-牛血清蛋白封闭电极表面吸附的非特异性位点，e-黄曲霉毒素b1单克隆抗体与黄曲霉毒素b1抗原特异性结合。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术内容进行进一步说明：

实施例1

1.电化学免疫传感器的制备具体为：

制备纳米金溶液，然后将1体积份a1的浓度为1.01wt%的氧化石墨烯、1重量份b1的硫堇、8.333体积份a1的纳米金溶液置于带盖称量瓶中，1体积份a1与1重量份b1的关联关系为：1毫升对应1.25毫克，称量瓶中放置搅拌磁子，称量瓶加盖后放置在磁力搅拌台上搅拌4h左右使瓶内材料充分混匀得到氧化石墨烯/硫堇/纳米金复合材料，4℃保存，将1体积份a2的氧化石墨烯/硫堇/纳米金复合材料2s内滴于活化后的玻碳电极表面，接着将玻碳电极置于4℃冰箱中保存12h，直至玻碳电极表面呈一层固体状薄膜，然后将111.111体积份a2的黄曲霉毒素b1单克隆抗体和玻碳电极先后置于微孔反应板一中，在4℃冰箱中静置4h，然后将玻碳电极于4℃冰箱中直至玻碳电极表面干燥，再将111.111体积份a2的牛血清蛋白溶液和玻碳电极先后放于微孔反应板二中，在4℃冰箱中静置2min，取出玻碳电极，在4℃冰箱中晾干得到修饰玻碳电极，即电化学免疫传感器；

1）制备纳米金溶液。将1体积份a3的质量分数为0.01%的氯金酸溶液倒入容器，加热搅拌至溶液沸腾并持续2min,加入0.04体积份a3的质量分数为1%的柠檬酸钠溶液，继续反应10min至合成液不再变色，停止加热，继续搅拌，待合成液冷却至25℃后，装瓶放入4℃冰箱储存；纳米金溶液在合成过程中的变色情况为：无色→浅灰色→深灰色→深红色→紫红色→酒红色→透亮红色；制备出的纳米金溶液颜色透亮、澄清，透明度良好，几乎没有杂质颗粒，判断此溶液可使用。

2）制备活化的玻碳电极。依次用粒径为0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末在麂皮上打磨玻碳电极至表面光滑、无肉眼可见刮痕，将抛光后玻碳电极上残留的氧化铝粉末用去离子水冲洗干净，然后将该玻碳电极先后放入无水乙醇、去离子水中分别超声清洗5min，将清洗后的玻碳电极放入0.1mol/l的硫酸溶液中，然后用循环伏安扫描法在0-1.8v的电压范围内扫描10圈以活化电极，活化完毕后，用去离子水将活化电极冲洗干净。

3）制备牛血清蛋白溶液。将每0.2g的牛血清蛋白用ph7.0磷酸盐缓冲溶液溶解定容100ml，得到体积分数为0.2%的牛血清蛋白溶液，4℃保存。

4）制备ph7.0的磷酸盐缓冲溶液。将0.05mol/l的磷酸氢二钾和0.05mol/l磷酸二氢钠按1:0.7的比例混合，得到ph7.0的磷酸盐缓冲溶液。

2.电化学免疫传感器用于黄曲霉毒素b1的检测具体为：

制备ph7.0的磷酸盐缓冲溶液，然后取抗原原液加入到磷酸盐缓冲溶液中依次浓度梯度稀释配制成10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9μg/l的抗原稀释液底液，然后分别将底液用磁力搅拌器搅拌46s使其混合均匀，将搅拌后的不同的底液滴在玻碳电极表面，采用三电极系统分别进行检测，检测时，玻碳电极上的黄曲霉毒素b1单克隆抗体上的抗原结合簇与黄曲霉毒素b1抗原分子上的抗原决定簇相互吸引，使黄曲霉毒素b1单克隆抗体与黄曲霉毒素b1抗原特异性结合，发生电子转移，产生微弱的电信号，通过硫堇实现信号放大，最后在电化学工作站以循环伏安图像呈现。

1）所述三电极系统包括：修饰玻碳电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和氯化钾电极为参比电极。

2）所述电化学免疫传感器对于黄曲霉毒素b1的检测过程在氮气氛围中进行。

3）所述黄曲霉毒素的玉米样品处理方法：称取0.5g研磨成粉的玉米，混合于25ml甲醇水混合溶液（甲醇：去离子水=7：3），混合均匀后放入离心机，以4000r/min的速度离心5min，取上清液备用。

实施例2

1.电化学免疫传感器的制备具体为：

制备纳米金溶液，然后将1体积份a1的浓度为0.5wt%的氧化石墨烯、1重量份b1的硫堇、5体积份a1的纳米金溶液置于带盖称量瓶中，1体积份a1与1重量份b1的关联关系为：1毫升对应1毫克，称量瓶中放置搅拌磁子，称量瓶加盖后放置在磁力搅拌台上搅拌4h左右使瓶内材料充分混匀得到氧化石墨烯/硫堇/纳米金复合材料，2℃保存，将1体积份a2的氧化石墨烯/硫堇/纳米金复合材料1s内滴于活化后的玻碳电极表面，接着将玻碳电极置于2℃冰箱中保存10h，直至玻碳电极表面呈一层固体状薄膜，然后将100体积份a2的黄曲霉毒素b1单克隆抗体和玻碳电极先后置于微孔反应板一中，在2℃冰箱中静置2h，然后将玻碳电极于2℃冰箱中直至玻碳电极表面干燥，再将100体积份a2的牛血清蛋白溶液和玻碳电极先后放于微孔反应板二中，在2℃冰箱中静置1min，取出玻碳电极，在2℃冰箱中晾干得到修饰玻碳电极，即电化学免疫传感器；

1）制备纳米金溶液。将1体积份a3的质量分数为0.005%的氯金酸溶液倒入容器，加热搅拌至溶液沸腾并持续1min,加入0.01体积份a3的质量分数为0.2%的柠檬酸钠溶液，继续反应1min至合成液不再变色，停止加热，继续搅拌，待合成液冷却至20℃后，装瓶放入2℃冰箱储存；纳米金溶液在合成过程中的变色情况为：无色→浅灰色→深灰色→深红色→紫红色→酒红色→透亮红色；制备出的纳米金溶液颜色透亮、澄清，透明度良好，几乎没有杂质颗粒，判断此溶液可使用。

2）制备活化的玻碳电极。依次用粒径为0.1μm、0.01μm的氧化铝粉末在麂皮上打磨玻碳电极至表面光滑、无肉眼可见刮痕，将抛光后玻碳电极上残留的氧化铝粉末用去离子水冲洗干净，然后将该玻碳电极先后放入无水乙醇、去离子水中分别超声清洗2min，将清洗后的玻碳电极放入0.03mol/l的硫酸溶液中，然后用循环伏安扫描法在1.8-2.4v的电压范围内扫描2圈以活化电极，活化完毕后，用去离子水将活化电极冲洗干净。

3）制备牛血清蛋白溶液。将每0.1g的牛血清蛋白用ph6.5磷酸盐缓冲溶液溶解定容60ml，得到体积分数为0.1%的牛血清蛋白溶液，2℃保存。

4）制备ph6.5的磷酸盐缓冲溶液。将0.01mol/l的磷酸氢二钾和0.01mol/l磷酸二氢钠按1:0.9的比例混合，得到ph6.5的磷酸盐缓冲溶液。

2.电化学免疫传感器用于黄曲霉毒素b1的检测具体为：

制备ph6.5的磷酸盐缓冲溶液，然后取抗原原液加入到磷酸盐缓冲溶液中依次浓度梯度稀释配制成10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9μg/l的抗原稀释液底液，然后分别将底液用磁力搅拌器搅拌20s使其混合均匀，将搅拌后的不同的底液滴在玻碳电极表面，采用三电极系统分别进行检测，检测时，玻碳电极上的黄曲霉毒素b1单克隆抗体上的抗原结合簇与黄曲霉毒素b1抗原分子上的抗原决定簇相互吸引，使黄曲霉毒素b1单克隆抗体与黄曲霉毒素b1抗原特异性结合，发生电子转移，产生微弱的电信号，通过硫堇实现信号放大，最后在电化学工作站以循环伏安图像呈现。

1）所述三电极系统包括：修饰玻碳电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和氯化钾电极为参比电极。

2）所述电化学免疫传感器对于黄曲霉毒素b1的检测过程在氮气氛围中进行。

3）所述黄曲霉毒素的玉米样品处理方法：称取0.5g研磨成粉的玉米，混合于25ml甲醇水混合溶液（甲醇：去离子水=7：3），混合均匀后放入离心机，以4000r/min的速度离心5min，取上清液备用。

实施例3

1.电化学免疫传感器的制备具体为：

制备纳米金溶液，然后将1体积份a1的浓度为1.5wt%的氧化石墨烯、1重量份b1的硫堇、12体积份a1的纳米金溶液置于带盖称量瓶中，1体积份a1与1重量份b1的关联关系为：1毫升对应5毫克，称量瓶中放置搅拌磁子，称量瓶加盖后放置在磁力搅拌台上搅拌4h左右使瓶内材料充分混匀得到氧化石墨烯/硫堇/纳米金复合材料，8℃保存，将1体积份a2的氧化石墨烯/硫堇/纳米金复合材料3s内滴于活化后的玻碳电极表面，接着将玻碳电极置于8℃冰箱中保存14h，直至玻碳电极表面呈一层固体状薄膜，然后将120体积份a2的黄曲霉毒素b1单克隆抗体和玻碳电极先后置于微孔反应板一中，在8℃冰箱中静置8h，然后将玻碳电极于8℃冰箱中直至玻碳电极表面干燥，再将120体积份a2的牛血清蛋白溶液和玻碳电极先后放于微孔反应板二中，在8℃冰箱中静置5min，取出玻碳电极，在8℃冰箱中晾干得到修饰玻碳电极，即电化学免疫传感器；

1）制备纳米金溶液。将1体积份a3的质量分数为0.05%的氯金酸溶液倒入容器，加热搅拌至溶液沸腾并持续10min,加入0.1体积份a3的质量分数为5%的柠檬酸钠溶液，继续反应20min至合成液不再变色，停止加热，继续搅拌，待合成液冷却至28℃后，装瓶放入8℃冰箱储存；纳米金溶液在合成过程中的变色情况为：无色→浅灰色→深灰色→深红色→紫红色→酒红色→透亮红色；制备出的纳米金溶液颜色透亮、澄清，透明度良好，几乎没有杂质颗粒，判断此溶液可使用。

2）制备活化的玻碳电极。依次用粒径为0.6μm、0.1μm的氧化铝粉末在麂皮上打磨玻碳电极至表面光滑、无肉眼可见刮痕，将抛光后玻碳电极上残留的氧化铝粉末用去离子水冲洗干净，然后将该玻碳电极先后放入无水乙醇、去离子水中分别超声清洗10min，将清洗后的玻碳电极放入0.5mol/l的硫酸溶液中，然后用循环伏安扫描法在2.4-3.6v的电压范围内扫描15圈以活化电极，活化完毕后，用去离子水将活化电极冲洗干净。

3）制备牛血清蛋白溶液。将每0.5g的牛血清蛋白用ph7.4磷酸盐缓冲溶液溶解定容120ml，得到体积分数为0.4%的牛血清蛋白溶液，8℃保存。

4）制备ph7.4的磷酸盐缓冲溶液。将0.15mol/l的磷酸氢二钾和0.15mol/l磷酸二氢钠按1:0.5的比例混合，得到ph7.4的磷酸盐缓冲溶液。

2.电化学免疫传感器用于黄曲霉毒素b1的检测具体为：

制备ph7.4的磷酸盐缓冲溶液，然后取抗原原液加入到磷酸盐缓冲溶液中依次浓度梯度稀释配制成10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9μg/l的抗原稀释液底液，然后分别将底液用磁力搅拌器搅拌70s使其混合均匀，将搅拌后的不同的底液滴在玻碳电极表面，采用三电极系统分别进行检测，检测时，玻碳电极上的黄曲霉毒素b1单克隆抗体上的抗原结合簇与黄曲霉毒素b1抗原分子上的抗原决定簇相互吸引，使黄曲霉毒素b1单克隆抗体与黄曲霉毒素b1抗原特异性结合，发生电子转移，产生微弱的电信号，通过硫堇实现信号放大，最后在电化学工作站以循环伏安图像呈现。

1）所述三电极系统包括：修饰玻碳电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和氯化钾电极为参比电极。

2）所述电化学免疫传感器对于黄曲霉毒素b1的检测过程在氮气氛围中进行。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。