一种凝胶电泳迁移实验的转膜方法与流程

本发明涉及蛋白检测技术领域，特别是涉及一种凝胶电泳迁移实验的转膜方法。

背景技术：

通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂(抗体)作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定对靶物质进行检测，蛋白质的western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定。

其中在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体(膜)上，是蛋白质的western印迹技术的核心环节，但是，传统的凝胶电泳迁移实验(emsa)中，需要将凝胶上的蛋白质与探针转移到尼龙膜上，以完成后续的电化学发光实验。通常使用的电转移方法为湿转，电压为100v-120v之间，转膜时间为30min-60min，其耗时较长，且试剂消耗量大，总体效率低。

因此，发明一种凝胶电泳迁移实验的转膜方法，充分提高转膜效率，减少转膜时间，对实验的整体流程具有优化效果，是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种凝胶电泳迁移实验的转膜方法，充分提高转膜效率，减少转膜时间，对实验的整体流程具有优化效果，能够应用于emsa实验和southernblotting的实验中。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种凝胶电泳迁移实验的转膜方法，包括以下步骤：

(1)根据凝胶大小，将滤纸和尼龙膜裁剪为与所述凝胶相同大小；

(2)其中按照滤纸-尼龙膜-凝胶-滤纸的顺序，从下向上放置实验材料，制备成转膜块；

(3)将4℃冷藏后的新鲜配制的转膜液1-5ml，均匀喷洒在步骤(2)中所述转膜块上，后将所述转膜块放入半干转膜仪中；

(4)打开仪器开关，设置转膜电压为25-30v，恒流电流为1a-0.3a，转膜时间为5min-15min；

(5)转膜完成后进行电化学发光实验和凝胶成像系统拍照。

本发明提供了一种凝胶电泳迁移实验的转膜方法，克服了传统湿转，其耗时较长，且试剂消耗量大，总体效率低的技术缺陷，达到了可在15min内完成转膜，提高了转膜效率的目的。

进一步地，步骤(2)的具体方法为：先将三层所述滤纸铺在底部，并去气泡；再将所述尼龙膜纸铺在所述滤纸上，并去气泡；将所述凝胶覆盖在所述尼龙膜上，并去气泡；最后再将三层所述滤纸覆盖在所述凝胶上。

其中滤纸、胶、膜之间不能有气泡，气泡的形成会造成短路。

进一步地，所述转膜液为0.5×tbe。

一种凝胶电泳迁移实验的转膜方法在emsa实验或southernblotting实验中应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种凝胶电泳迁移实验的转膜方法，具有如下技术优点：

本发明提供了一种凝胶电泳迁移实验的转膜方法，克服了传统湿转，其耗时较长，且试剂消耗量大，总体效率低的技术缺陷，达到了可在15min内完成转膜，提高了转膜效率的目的，对emsa实验具有优化效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的传统湿转法的实验结果；

其中泳道1为biotin-ebnacontroldna；泳道2为biotin-ebnacontroldna+ebnaextract；泳道3为biotin-ebnacontroldna+ebnaextract+200-foldmolarexcessofunlabeledebnadna；

图2附图为使用本发明提供的转膜方法的实验结果；

其中泳道1为biotin-ebnacontroldna；泳道2为biotin-ebnacontroldna+ebnaextract+200-foldmolarexcessofunlabeledebnadna；泳道3为biotin-ebnacontroldna+ebnaextract；

图3附图为使用本发明提供的转膜方法检测thp-1细胞中转录因子ap-1；

其中条带1为ap-1探针与核蛋白结合的位置，条带2部位为游离ap-1探针所在位置；

图4附图为使用本发明提供的转膜方法检测thp-1细胞中转录因子nf-kb；

其中条带1为nf-kb探针与核蛋白结合的位置，条带2部位为游离nf-kb探针所在位置。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明实施例公开了一种凝胶电泳迁移实验的转膜方法，即根据凝胶大小，将滤纸和尼龙膜裁剪为与凝胶相同大小的形状；按照滤纸-尼龙膜-凝胶-滤纸的顺序，从下向上放置实验材料，制备成转膜块；其中先将三层所述滤纸铺在底部，并去气泡；再将所述尼龙膜纸铺在所述滤纸上，并去气泡；将所述凝胶覆盖在所述尼龙膜上，并去气泡；最后再将三层所述滤纸覆盖在所述凝胶上。配制转膜液0.5×tbe，将配制好的转膜液4℃冷藏，并吸取3ml的转膜液均匀喷洒在转膜块上，后将转膜块放入半干转膜仪中。随后打开仪器开关，设置转膜电压为25v，恒流电流为0.3a，转膜时间为15min，转膜完成后进行电化学发光实验和凝胶成像系统拍照。上述转膜方法在emsa实验或southernblotting实验中应用。

实施例2

本发明实施例公开了一种凝胶电泳迁移实验的转膜方法，即根据凝胶大小，将滤纸和尼龙膜裁剪为与凝胶相同大小的形状；按照滤纸-尼龙膜-凝胶-滤纸的顺序，从下向上放置实验材料，制备成转膜块；其中先将三层所述滤纸铺在底部，并去气泡；再将所述尼龙膜纸铺在所述滤纸上，并去气泡；将所述凝胶覆盖在所述尼龙膜上，并去气泡；最后再将三层所述滤纸覆盖在所述凝胶上。配制转膜液0.5×tbe，将配制好的转膜液4℃冷藏，并吸取1ml的转膜液均匀喷洒在转膜块上，后将转膜块放入半干转膜仪中。随后打开仪器开关，设置转膜电压为30v，恒流电流为0.8a，转膜时间为5min，转膜完成后进行电化学发光实验和凝胶成像系统拍照。上述转膜方法在emsa实验或southernblotting实验中应用。

实施例3

本发明实施例公开了一种凝胶电泳迁移实验的转膜方法，即根据凝胶大小，将滤纸和尼龙膜裁剪为与凝胶相同大小的形状；按照滤纸-尼龙膜-凝胶-滤纸的顺序，从下向上放置实验材料，制备成转膜块；其中先将三层所述滤纸铺在底部，并去气泡；再将所述尼龙膜纸铺在所述滤纸上，并去气泡；将所述凝胶覆盖在所述尼龙膜上，并去气泡；最后再将三层所述滤纸覆盖在所述凝胶上。配制转膜液0.5×tbe，将配制好的转膜液4℃冷藏，并吸取5ml的转膜液均匀喷洒在转膜块上，后将转膜块放入半干转膜仪中。随后打开仪器开关，设置转膜电压为27v，恒流电流为1a，转膜时间为8min，转膜完成后进行电化学发光实验和凝胶成像系统拍照。上述转膜方法在emsa实验或southernblotting实验中应用。

实施例4

本实施例以thermochemiluminescentemsakit中的质控品，分别利用实施例1中的转膜方法和传统的湿法转膜法进行实验，结果如图1-2。其中湿法转膜法的具体步骤为：

由图1-2可知，两种转膜方法转膜结果一致，进一步说明了半干转膜方法可以应用于emsa实验，甚至可以应用于southernblotting的实验中。这种方法更加节省时间，提高了实验效率。

实施例5

本实施例以实施例3中的转膜方法检测thp-1细胞中转录因子ap-1和转录因子nf-kb，结果如图3-4所示。

本发明提供了一种凝胶电泳迁移实验的转膜方法，克服了传统湿转，其耗时较长，且试剂消耗量大，总体效率低的技术缺陷，达到了可在15min内完成转膜，提高了转膜效率的目的，对emsa实验具有优化效果。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。