一种高光谱成像鉴定微生物的方法与流程

本发明属于高光谱遥感成像应用领域，具体涉及一种高光谱成像鉴定微生物的方法。
背景技术：
：果蔬在生长及存放过程中，往往会有病害腐败的现象发生。果蔬的病害腐败不仅会导致果农遭受严重的经济损失，而且会造成果蔬营养成分的流失；人们在接触到含有致病菌微生物的腐败水果之后也存在一定的致病率。造成果蔬腐败的关键致病菌主要为霉菌及酵母菌，霉菌主要有葡萄孢属、青霉属、镰刀菌属、链格孢属等，酵母菌主要包括掷孢酵母属、梅奇酵母属等。对果蔬关键致病菌进行快速鉴别，可以为果蔬的科学防治提供极具价值的参考信息。目前，微生物的菌种鉴定方法主要有分子生物学测序、菌种生化检测、菌种代谢组学检验及免疫学应用等。但以上方法耗时耗力，对检测设备以及检测技能的要求较高，导致检测成本居高不下。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种高光谱成像鉴定微生物的方法，从而解决现有方法存在的耗时耗力、检测成本高的问题。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种高光谱成像鉴定微生物的方法，包括以下步骤：1)对参考白板、已知微生物纯培养样品和待鉴定未知菌进行高光谱成像，得到相应样品的高光谱图像；所述参考白板为标准培养基；2)对步骤1)所得高光谱图像进行校正处理，得到高光谱校正图像；3)提取高光谱校正图像的光谱反射率信息，建立已知微生物和待鉴定未知菌的高光谱反射率曲线；4)对高光谱反射率曲线进行去噪平滑处理，得到高光谱吸收曲线；5)分析已知微生物的高光谱吸收曲线的特征差异，确定反映该特征差异的种属鉴定波段；6)对某已知微生物的多个平行处理样品的相应高光谱吸收曲线进行归一化处理，得到归一化曲线；在种属鉴定波段下，计算该已知微生物的各平行处理样品的高光谱吸收曲线与归一化曲线的残差平方和，确定用于菌种鉴定的残差平方和阈值；7)在种属鉴定波段下，计算待鉴定未知菌的高光谱吸收曲线与已知微生物的归一化曲线的残差平方和，根据步骤6)确定的残差平方和阈值判定待鉴定未知菌的种属关系，完成鉴定。本发明提供的高光谱成像鉴定微生物的方法，主要是利用微生物纯培养样品的表型及内部特征在特定波段上的特征吸收差异，实现微生物种属关系的鉴定，该方法不仅具有光谱分析快速高效的特点，而且鉴定成本低、鉴定准确度高，也可以作为其他鉴定手段的验证工具。高光谱遥感成像技术拥有图像分析和光谱分析的双重优势，可以对待测物的内外部信息进行可视化表达，是一种能够采集纳米级像素点信息的技术手段，它还是一种光学成像模式，结合了传统的数字成像和振动光谱以获得来自样品或场景的空间图像和光谱的指纹信息。微生物的表型差异可以理解为在颜色/光谱(光谱信息)、形态或频散类型(空间信息)和生长速率(时间信息)等方面的不同，不同微生物所具有的特定菌落表型特征及代谢产物使其在特定波段(紫外光区、可见光区、红外光区)或者全光谱具有明显区别于其他菌种的特征吸收。本发明正是基于上述事实，依据现有大量已知微生物的表型及其代谢产物的高光谱吸收特性，完成微生物种属关系的鉴定。步骤1)为待检样品的准备过程。该步骤中，控制已知微生物纯培养样品和未知菌纯培养样品的培养条件和涂布条件一致，以获得该同等条件下的高光谱响应。步骤2)中，所述校正处理为辐射校正或几何校正。该步骤可利用高光谱成像光谱仪自带的辐射校正工具，来获得反映真实样品信息的高光谱图像。步骤3)中，可运用图像处理envi软件打开高光谱校正图像，提取高光谱反射率信息，利用envi软件自带的经验线性校正工具结合参考白板的标准反射率光谱完成白板定标，得到高光谱反射率曲线。步骤4)中，去噪平滑处理可运用matlab等数据处理软件实现，如sg、snv及计算马氏距离等，获得未知与已知微生物种属的均一化、光滑化的光谱吸收数据线。步骤5)中，所述特征差异包括显著性光谱吸收差异、光谱反射率极值差异、局部显著性差异中的至少一种。特征差异反应了不同菌种的吸收强弱差异，其中既包括了微生物表型结构不同而产生的光谱反射率差异，还蕴含着由不同微生物的代谢产物所产生的光谱反射率差异，一般而言，不同种属的微生物的代谢产物有明显差异，而代谢产物的特征吸收主要表征在光谱的红外短波区(700-1100nm)，因而，优选的，所述种属鉴定波段选自红外短波区。步骤6)中，同一菌种在同等培养条件和涂布条件下，理论上应当获得一致的高光谱吸收曲线，该步骤是通过多个平行处理样品的归一化处理来去除涂布不均匀或涂布厚薄不同带来的光谱反射率变化，该归一化曲线即反映了该培养条件和涂布条件下的特征高光谱响应，而任一平行处理样品与该归一化曲线的差异应当在一有限范围内，两曲线间数据的残差平方和可以用来评价两曲线的接近程度，进而可以利用残差平方和阈值来反映该有限范围。步骤7)中，在反映特征差异的种属鉴定波段上，如果未知菌的高光谱吸收曲线与该已知微生物的归一化曲线的残差平方和能够满足该阈值条件，则有理由相信未知菌与该已知微生物的种属关系一致。基于上述微生物在特定培养条件和涂布条件下稳定的高光谱响应，可建立相应条件下的高光谱响应数据库信息，依据未知菌的高光谱吸收曲线与已知菌的归一化曲线的接近程度，即可批量化、快速、高效完成多个菌种的鉴定。本发明提供的高光谱成像鉴定微生物的方法，可利用高光谱成像采样密度大、光谱范围广的特点，对已知种属关系的菌种及待鉴定样品的任何一个部位进行精细鉴定，进而有利于借助微小差异表征种属关系。附图说明图1为本发明的实施例中部分微生物样品的高光谱图像；图中，①到⑧分别对应tpbp-1、节杆菌(tpbp-2)、tpbp-3、tpbp-4、间型假丝酵母菌(c.intermedia)、tpfp-9、大肠杆菌(e.coli)、纳豆芽孢杆菌(b.subtilisnatto)；图2为本发明的实施例中部分微生物样品的高光谱反射率曲线；其中，a为节杆菌，由上至下，各曲线分别代表最大值、正偏差、平均值、负偏差、最小值；b为大肠杆菌；c为间型假丝酵母菌；d为纳豆芽孢杆菌；图3为本发明的实施例中部分微生物样品的高光谱吸收曲线；图中，由上至下，各曲线分别对应黑曲霉(tpfp-1)、白边青霉(tpfp-5)、灰葡萄孢菌(tpfp-2)、节杆菌(tpbp-2)、仁果柱盘孢霉(tpfp-3)、tpbp-3、壳青霉(tpfp-4)、tpbp-4、纳豆芽孢杆菌(b.subtilisnatto)、tpfp-9、间型假丝酵母菌(c.intermedia)、尖孢镰刀菌(tpfp-6)、tpbp-1、大肠杆菌(e.coli)；图4为本发明的实施例中部分微生物样品在红外短波区的高光谱吸收曲线；图中，由上至下，各曲线分别对应黑曲霉(tpfp-1)、白边青霉(tpfp-5)、灰葡萄孢菌(tpfp-2)、节杆菌(tpbp-2)、仁果柱盘孢霉(tpfp-3)、tpbp-3、壳青霉(tpfp-4)、tpbp-4、纳豆芽孢杆菌(b.subtilisnatto)、tpfp-9、间型假丝酵母菌(c.intermedia)、尖孢镰刀菌(tpfp-6)、tpbp-1、大肠杆菌(e.coli)；图5为本发明的实施例的鉴定结果与已知菌(间型假丝酵母菌)的26srna核苷酸序列构建的菌种进化树。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作进一步说明。以下实施例以未知火龙果致腐菌为例，说明本发明的方法的具体实施过程。实施例1本实施例的高光谱成像鉴定微生物的方法，采用以下步骤：1)摆放参考白板：以微生物的纯净培养基(真菌采用pda培养基，细菌采用lb培养基)为参考白板，将其摆放在成像高光谱仪的运行轨道中心上。2)摆放已知微生物纯培养样品：以间型假丝酵母菌、大肠杆菌、纳豆芽孢杆菌、镰刀菌等数十种培养条件与涂布条件完全一致的已知真菌或细菌为标准菌，将标准菌摆放于成像高光谱仪的运行轨道中心上。该步骤中，标准菌涉及主要的水果致腐菌品种，本实施例中，标准菌为间型假丝酵母菌、大肠杆菌、纳豆芽孢杆菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌、白边青霉、节杆菌、仁果柱盘孢霉、壳青霉、尖孢镰刀菌。3)摆放待鉴定感兴趣菌种的纯培养样品：待鉴定感兴趣菌种为具有研究的价值的未知火龙果腐败微生物，其培养条件和涂布条件与标准菌相同，将其摆放于成像高光谱仪的运行轨道中心上。4)获取参考白板、已知微生物纯培养样品(标准菌)和待鉴定感兴趣菌种的纯培养样品的高光谱图像，高光谱图像应仅包含菌落，不可露出培养基及培养皿边缘，部分图像如图1所示。图1中，①到⑧分别为部分已知微生物在555nm处的高光谱图像，由图1可以看出，涂布均匀的微生物样品的高光谱图像显示出较大差异，这些高光谱图像包含了丰富的光谱反射率信息，这些光谱反射率信息反映了微生物样品的表型结构和代谢产物差异，进而为利用光谱反射率信息鉴定微生物提供了条件。5)对步骤4)获得的高光谱图像进行校正，得到微生物样品的高光谱校正图像。该步骤是用高光谱成像仪自带的辐射校正工具完成图像的辐射校正或几何校正，所得高光谱校正图像更符合微生物样品的高光谱成像特征。6)使用envi软件打开高光谱校正图像，提取高光谱反射率数据，利用envi软件自带的经验线性校正工具结合参考白板的标准反射率光谱完成白板定标，得到微生物样品的高光谱反射率曲线。部分微生物样品的高光谱反射率曲线如图2所示。7)对高光谱反射率曲线进行去噪平滑处理，得到微生物样品的高光谱吸收曲线。去噪平滑处理利用matlab数据处理软件的sg平滑、snv预处理实现，经过去噪平滑处理实现高光谱反射率曲线的均一化、平滑化，得到便于数据分析的高光谱吸收曲线。部分微生物样品的高光谱吸收曲线如图3所示，可以看出微生物样品的光谱反射率在可见-红外短波区变化多样，表征了丰富的微生物信息，其中不仅存在由微生物表型结构不同而产生的光谱反射率差异，还蕴含着由不同微生物的代谢产物差异所产生的光谱反射率差异。8)分析不同标准菌的高光谱吸收曲线的特征差异，确定反映该特征差异的种属鉴定波段。微生物样品在红外短波区的高光谱吸收曲线如图4所示，可以看出，在该区域下不同曲线的吸收强弱层次分明，能够很好的表征微生物样品的有机组成及代谢产物差异，因而以该区域反映的局部显著性差异以及显著性光谱吸收差异，作为适于种属鉴定的特征差异，选择该区域中波长为780-1023.82nm的波段为种属鉴定波段。9)针对某一标准菌，准备多组平行处理样品进行平行检测，计算平均值，得到该标准菌的归一化高光谱吸收曲线，计算各平行样品的高光谱吸收曲线与归一化高光谱吸收曲线在种属鉴定波段下的残差平方和，确定用于菌种鉴定的残差平方和阈值。表1列出了大肠杆菌(e.coli)、间型假丝酵母菌(c.intermedia)、纳豆芽孢杆菌(b.subtilisnatto)的平行处理样品的高光谱反射率与其平均值的残差平方和计算结果。表1部分微生物样品的残差平方和计算结果由表1的结果可知，某一标准菌的平行处理样品的高光谱反射率与其平均值在种属鉴定波段上的残差平方和最高在100左右，因而，同种菌的平行处理样品的高光谱反射率变化仅仅是由于涂布不均匀或涂布厚薄不同所致，若同一种菌的待检样品的涂布标准一致，在大数据汇总分析的结果下，单一菌种的高光谱反射率曲线可以稳定成一个特定曲线，即不同种的微生物具有较为稳定的高光谱响应，依据该次试验的残差平方和计算结果，可将用于菌种鉴定的残差平方和阈值定为100。10)计算在种属鉴定波段内，待鉴定感兴趣菌种的高光谱吸收曲线与各标准菌的归一化高光谱吸收曲线的残差平方和，根据步骤9)确定的残差平方和阈值，判定待鉴定感兴趣菌种的种属关系，完成鉴定。待鉴定感兴趣菌种与间型假丝酵母菌在种属鉴定波段内的残差平方和的计算结果如表2所示。表2待鉴定感兴趣菌种与间型假丝酵母菌的残差平方和计算结果项目平行1平行2平行3平行4平行5平行6平均值tpfp-941.2510.769.8549.651.7825.9838.65由表2的结果可知，该待鉴定感兴趣菌种(tpfp-9)与间型假丝酵母菌的高光谱反射率在种属鉴定波段内的残差平方和在50以内(与其他标准菌的归一化曲线的残差平方和在200以上)，tpfp-9与间型假丝酵母菌在红外短波区的光谱吸收数据吻合良好，且两种菌的培养特征相似、微生物表型特征接近，依据已知的六个间型假丝酵母菌平行处理样品与其高光谱平均反射率的残差平方和及其生物学鉴定结果，可判定tpfp-9为间型假丝酵母菌。未知菌tpbp-1、tpbp-3、tpbp-4与实施例中的已知菌的高光谱反射率在种属鉴定波段内的残差平方和均在200以上，可判定tpbp-1、tpbp-3、tpbp-4与实施例中的已知菌不属于同一种属。对高光谱成像技术鉴定未知微生物的结果进行确认，如图5所示，未知菌与间型假丝酵母菌26srna核酸差异序列构建的菌种进化树，其节点的bootstrap值大于70，证明两菌株同属一种，由此可以验证实施例检测结果的准确性。当前第1页12