一种功能化的SERS平台制备方法及其对ATP的检测应用与流程

本发明属于生物检测技术领域，特别是涉及一种功能化的sers平台制备方法及其对atp的检测应用。

背景技术

在中国传统医学中，针灸作为补充和替代药物已有超过2000年的历史。在针灸疗法中，针灸在世界范围内被广泛接受并主要用于治疗急性和慢性疼痛，但对其治疗的了解甚少生物学基础。在最新的研究中，goldman等报道了针刺期间会释放三磷酸腺苷(atp)。atp释放后，它将作为与嘌呤受体结合的递质起作用，然后迅速降解为腺苷抑制疼痛。除了抗伤害感受作用之外，atp还在生物系统的能量储存和信号传导中起关键作用。最重要的是，人体体液中异常的atp水平与多种遗传疾病密切相关。因此，开发快速便捷的方法对于实时检测atp具有医疗诊断和治疗中的敏感性和选择性，是非常重要的。

就atp的选择性检测而言，atp的第一个结合系统是由生物学发现重要的无环多胺(如腐胺和亚精胺)引起的，其中胺的氢键除了静电外还能影响复合物与atp相互作用的稳定性和选择性。在早期研究的基础上，lehn和kimura提出了“对阴离子结合的大环效应”，这得益于天然存在的多胺的大环类似物能够强烈地结合阴离子比线性系统多1～2个数量级，这一事实与大环和atp之间的稳定常数及可用于静电和氢键相互作用的氮原子的数目有关。因此，涉及经典超高效液相色谱，电化学分析，以及荧光共振能量转移和光学表面等离子共振已被证明用于通过使用不同的大环来灵敏和选择性地检测atp。与其他光谱技术相比，表面增强拉曼散射(sers)作为功能强大的分析技术被开发出来，它可以提供超灵敏的特征和分子的光谱指纹信息。此外，它可以减少光漂白和峰重叠，由于水的拉曼散射截面小，适用生物样品的检测。此外，它能够在不需要复杂样品制备的情况下在各种基质中进行无损检测。这些优点使得sers技术成为生物分析应用(如atp)的最佳光谱技术之一。针灸是一种经典的中国医术，以最小的损伤插入到个体中。针灸针应该是实现快速无损采集样本以及监测sers信号的理想平台。

在这里，我们合成了化合物大环胺(ma)作为拉曼探针，以实现灵敏和选择性检测，比常规方法检测灵敏度提高1-2个数量级。其中，金纳米粒子利用3-atpms功能化，然后用拉曼探针ma(aunps/ma)进行表面修饰以获得强的sers信号。因此，针体表面结合的金纳米粒子和拉曼探针可以充当sers活性平台，允许从混合物中富集和检测目标分子atp。针刺sers平台不仅可以避免纳米粒子的聚集，而且对于检测生物分子atp具有快速反应和操作简单的灵敏度和可靠性。最重要的是，它为sers生物分析应用开辟了一个迅速发展的市场。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种功能化的sers平台制备方法及其对atp的检测应用，通过对针灸针依次进行金纳米颗粒修饰和拉曼探针功能化，并应用于atp检测，提高了检测的灵敏度，便于获得更强的sers信号。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明为一种功能化的sers平台制备方法，包括如下步骤：

步骤1、金纳米颗粒溶液制备；

通过柠檬酸三钠还原氯金酸的方法进行金纳米粒子的合成；

步骤2、金纳米颗粒修饰针灸针：

(1)、用乙醇清洗针灸针，清洗后将针灸针针体浸入10％(体积比)的3-巯基丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中4℃保持24小时；

(2)、将(1)得到的针灸针用乙醇洗涤2-5次并在氮气流下干燥；

(3)、将(2)得到的洗涤干燥的针灸针针体浸入步骤1得到金纳米颗粒溶液中；

步骤3、拉曼探针对针灸针的功能化：

将步骤2中制得的针灸针状sers底物在室温下浸泡在浓度为5×10^-5mol/l拉曼探针溶液中处理2-3小时；处理后取出干燥，用纯水洗涤并于室温下保存。

进一步地，所述步骤1制备的金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒的尺寸为50nm。

进一步地，所述50nm金纳米颗粒溶液的制备方法具体包括：

01、在250ml的三口烧瓶中分别加入99ml的超纯水和1ml质量分数为1％的氯金酸溶液，用加热套加热，开始沸腾时，边搅拌边快速加入10ml质量分数为1％的柠檬酸钠溶液，继续保持沸腾20分钟；

02、取25ml制备好的金纳米颗粒加入100ml的三口烧瓶中作为种子溶液，在室温搅拌的情况下依次加入1ml质量分数为1％的pvp溶液和20ml质量分数为0.02％的盐酸羟胺溶液；通过微量进样器以每分钟1毫升的速度往上述混合液中加入20ml质量分数为0.1％的氯金酸溶液；加入完成后，继续搅拌30分钟，即得50nm的金纳米颗粒溶液。

进一步地，所述步骤3中拉曼探针溶液的制备包括如下步骤：

s001、1,10-菲咯啉-2,9-二甲醛的合成；

s002、1-α-苯基-n-2,5-二氮杂戊烷的合成；

s003、拉曼标签ma的制备：将1-α-苯基-n-2,5-二氮杂戊烷在室温下搅拌溶于适量的乙醇后，再加入1,10-菲咯啉-2,9-二甲醛搅拌溶解；在冰水浴中加入nabh4，旋转蒸发溶剂并加入5ml水；

s004、将s003得到的含水混合物用ch2cl2萃取，将有机相合并并用mgso4干燥；

s005、将mgso4干燥后的混合物过滤并在旋转蒸发器上除去ch2cl2，得到黄色油；

s006、将得到的黄色油溶于少量的乙醇中，加入适量的hcl后，收集淡黄色沉淀。

进一步地，所述1,10-菲咯啉-2,9-二甲醛的合成包括：在室温下，将二氧化硒加入到2,9-二甲基-1,10-菲咯啉在1,4-二恶烷中的溶液中，然后将反应混合物在90℃加热回流3小时；混合溶液的颜色通过橙色和红色变成绿褐色；将加热回流3小时后的反应溶液直接过滤除去黑色沉淀，并使其缓慢冷却至室温；形成新的沉淀，然后滤出，用乙醚洗涤3-5次并真空干燥，得到的黄色固体即为1,10-菲咯啉-2,9-二甲醛。

进一步地，所述1-α-苯基-n-2,5-二氮杂戊烷的合成包括：将溶解有水杨醛的水杨醛甲醇溶液加入溶解有乙二胺的乙二胺甲醇溶液中，然后搅拌形成混合溶液，1小时后，将nabh4加入到该混合溶液中；继续搅拌3小时后，减压除去所有挥发物，得到白色固体；将得到的白色固体残余物溶于用饱和nahco3溶液萃取的ch2cl2中，将水层用ch2cl2萃取2-4次，将萃取得到的有机物合并，用食盐水洗涤并经无水mgso4干燥，最后，减压蒸发ch2cl2，得到的浅黄色固体即为1-α-苯基-n-2,5-二氮杂戊烷。

进一步地，所述s003拉曼标签ma的制备过程中，所述1-α-苯基-n-2,5-二氮杂戊烷、1,10-菲咯啉-2,9-二甲醛和nabh4三者的用量比为1-2：1-2：1-2。

一种功能化的sers平台在atp检测中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过对针灸针依次进行金纳米颗粒修饰和拉曼探针功能化，并应用于atp检测，提高了检测的灵敏度，便于获得更强的sers信号。

2、本发明通过在针表面上组装的均匀金纳米粒子可以提供有效的sers增强。

3、本发明获得功能化的针能够快速地从复杂的样品中收集目标分子，不仅可以避免具有可靠和可重现信号的金纳米粒子的聚集，而且还提高了检测效率并且响应快。

4、本发明通过用金纳米颗粒和拉曼探针修饰针体，功能化针灸针可作为sers活性传感器，用于检测复杂样品中涉及的各种分子，极大拓展应用范围。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为拉曼探针ma的合成示意图；

图2为金纳米颗粒aunps扫描电子显微镜(sem)图片；

图3为金纳米颗粒aunps功能化的针灸针表面的sem图片；

图4为浓度范围从100μm到1μm的探针ma的sers光谱；

图5为以50μmma为探针对系列浓度atp的sers光谱；

图6为功能化的针灸针对血清中atp检测的光谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1-4提及的aunps即为金纳米颗粒，提及的ma为拉曼探针。

实施例1

一种功能化的sers平台制备方法，包括如下步骤：

步骤1、金纳米颗粒溶液制备；

通过柠檬酸三钠还原氯金酸的方法进行金纳米粒子的合成；

步骤2、金纳米颗粒修饰针灸针：

(1)、用乙醇清洗针灸针，清洗后将针灸针针体浸入10％(体积比)的3-巯基丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中4℃保持24小时；

(2)、将(1)得到的针灸针用乙醇洗涤3次并在氮气流下干燥；

(3)、将(2)得到的洗涤干燥的针灸针针体浸入步骤1得到金纳米颗粒溶液中；

步骤3、拉曼探针对针灸针的功能化：

将步骤2中制得的针灸针状sers底物在室温下浸泡在浓度为5×10^-5mol/l拉曼探针溶液中处理2小时；处理后取出干燥，用纯水洗涤并于室温下保存。

优选地，步骤1制备的金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒的尺寸为50nm。

优选地，50nm金纳米颗粒溶液的制备方法具体包括：

01、在250ml的三口烧瓶中分别加入99ml的超纯水和1ml质量分数为1％的氯金酸溶液，用加热套加热，开始沸腾时，边搅拌边快速加入10ml质量分数为1％的柠檬酸钠溶液，继续保持沸腾20分钟；

02、取25ml制备好的金纳米颗粒加入100ml的三口烧瓶中作为种子溶液，在室温搅拌的情况下依次加入1ml质量分数为1％的pvp溶液和20ml质量分数为0.02％的盐酸羟胺溶液；通过微量进样器以每分钟1毫升的速度往上述混合液中加入20ml质量分数为0.1％的氯金酸溶液；加入完成后，继续搅拌30分钟，即得50nm的金纳米颗粒溶液。

优选地，步骤3中拉曼探针溶液的制备包括如下步骤：

s001、1,10-菲咯啉-2,9-二甲醛的合成；

s002、1-α-苯基-n-2,5-二氮杂戊烷的合成；

s003、拉曼标签ma的制备：将0.08g的1-α-苯基-n-2,5-二氮杂戊烷在室温下搅拌溶于5ml的乙醇后，再加入0.04g的1,10-菲咯啉-2,9-二甲醛搅拌溶解；在冰水浴中加入0.06g的nabh4，旋转蒸发溶剂并加入5ml水；

s004、将s003得到的含水混合物用25ml的ch2cl2萃取5次，每次ch2cl2的用量为5ml，将有机相合并并用mgso4干燥；

s005、将mgso4干燥后的混合物过滤并在旋转蒸发器上除去ch2cl2，得到黄色油；

s006、将得到的黄色油溶于少量的乙醇中，加入适量的hcl后，收集淡黄色沉淀。

优选地，1,10-菲咯啉-2,9-二甲醛的合成包括：在室温下，将0.8007g二氧化硒加入到0.35g的2,9-二甲基-1,10-菲咯啉在25ml的1,4-二恶烷中的溶液中，然后将反应混合物在90℃加热回流3小时；混合溶液的颜色通过橙色和红色变成绿褐色；将加热回流3小时后的反应溶液直接过滤除去黑色沉淀，并使其缓慢冷却至室温；形成新的沉淀，然后滤出，用乙醚洗涤3-5次并真空干燥，得到的0.2g黄色固体即为1,10-菲咯啉-2,9-二甲醛。

优选地，1-α-苯基-n-2,5-二氮杂戊烷的合成包括：将0.42ml水杨醛溶解在30ml的甲醇溶液形成水杨醛甲醇溶液；将0.72ml的溶解在10ml的甲醇溶液形成乙二胺甲醇溶液中，将水杨醛甲醇溶液加入乙二胺甲醇溶液中并搅拌形成混合溶液，1小时后，将0.303g的nabh4加入到该混合溶液中；继续搅拌3小时后，减压除去所有挥发物，得到白色固体；将得到的白色固体残余物溶于用130ml饱和nahco3溶液萃取的65mlch2cl2中，将水层用ch2cl2萃取3次，每次ch2cl2用量为50ml，将萃取得到的有机物合并，用100ml食盐水洗涤并经无水mgso4干燥，最后，减压蒸发ch2cl2，得到的浅黄色固体即为1-α-苯基-n-2,5-二氮杂戊烷；

如图1所示为具体的合成路线。

如图2所示，合成的粒子粒径大小均匀，紫外吸收波长在520nm处。

如图3所示，可看出纳米颗粒均匀修饰在针体表面。

实施例2

修饰有aunps的针灸针检测探针ma

配制7个系列浓度范围在100umol/l到1umol/l的ma溶液，取实施例1中aunps修饰后的7根针灸针分别置于7个浓度的溶液中浸泡5min，取出干燥，在拉曼光谱仪下测试，得到的光谱谱图。

7个系列浓度分别为1×10^-4mol/l、7.5×10^-5mol/l、5×10^-5mol/l、1×10^-5mol/l、7.5×10^-6mol/l、5×10^-6mol/l、1×10^-6mol/l；

如图4所示，活性针显示出对ma检测的高灵敏度和稳定的检测。

实施例3

aunps和ma功能化的针灸针检测atp

配制7个系列浓度范围在25nm至1000nm的atp溶液，取实施例1中aunps和ma修饰后的7根针灸针分别置于7个浓度的溶液中浸泡5min，取出干燥，在拉曼光谱仪下测试，得到的光谱图。

7个系列浓度分别为2.5×10^-8mol/l、5.0×10^-8mol/l、7.5×10^-8mol/l、1.0×10^-7mol/l、2.5×10^-7mol/l、5.0×10^-7mol/l、7.5×10^-7mol/l、1×10^-6mol/l；

如图5所示，通过使用静电吸附和au-n键，在sers活性针上修饰探针ma分子，表现出高sers信号；添加atp可以有效地抑制ma的sers信号；ma与atp之间的亲和力比ma与底物之间的亲和力强，因此atp的加入使ma远离底物伴随复合物的形成，从而降低ma信号；用拉曼探针装饰的针不仅实现了对atp的敏感和选择性检测，而且提供了可靠的sers信号。最重要的是，它强烈地间接简化了样品的检测，特别是对于复杂样品中涉及的目标分子。

实施例4

血清中atp的检测

从健康志愿者中随机收集人血清样品，取实施例1中aunps和ma修饰后的针灸针置于纯血清样品中浸泡5min，取出干燥后采集sers谱图。接下来，向血清中加入系列浓度的atp，同样的方法采集atp的sers信号。

如图6所示，当atp(100nm)掺入血清时，ma探针的sers特征表现出明显的atp信号响应，随着拉曼强度的降低和振动带的带移。由于目标分子atp和探针ma之间的高度化学相互作用，atp的sers反应可以有效地抑制血清样品可能产生干扰的拉曼特征。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。