本发明涉及水体藻类水华领域，尤其涉及一种铜绿微囊藻胞外聚合物的提取方法。
背景技术
微生物菌群分泌的细胞外聚合物质(extracellularpolymericsubstance，eps)已经被认为是微生物聚集和生物膜形成的重要因素。蓝藻水华暴发的同时也会伴随着蓝藻胞外聚合物(eps)的产生。据报道，蓝藻eps也与微生物的聚集和发育有关。当外部环境条件适合蓝藻生长时，湖泊中产生eps的蓝藻菌落就会聚集在一起并浮到水面形成蓝藻水华。徐华成研究了eps在微囊藻聚集和水华形成中的作用，发现eps提取物会通过增加能垒和第二限能来降低微囊藻藻体的凝聚力。因此，我们可以推测eps在蓝藻水华的生长形成过程中具有关键性作用。
蓝藻胞外聚合物是一种有黏性的高分子化合物，可将几个到几百个直径为4～6μm的蓝藻细胞黏连在一起，形成不定形的蓝藻胶状群体，直径最大时，可达1cm。蓝藻eps被分为溶解型eps(sl-eps)和结合型eps，后者表现出动态的双层结构，可进一步分为松散结合型eps(lb-eps)和紧密结合型eps(tb-eps)。蓝藻eps主要以天然大分子有机质为主，多由多糖、蛋白质、核酸、脂类、糖醛酸、腐殖酸等成分组成，由于eps中的多糖、腐殖酸、蛋白质等成分含有大量的羧基、氨基、醛基、羟基、疏基及碳基等官能团，它们易与水中的金属离子和无机物结合形成有机性胶体，在水处理过程中很难去除，致使其在水环境中成为重要的有机污染源。
在对蓝藻eps进行组分和功能分析时，如何有效地将eps从藻体上提取和分离是进行后续研究的重要前提。目前，对于藻类eps的提取分离并没有一种广泛认可且有效的方法，因此研究蓝藻eps和蓝藻水华的研究者们一直致力于探究出一种高效的藻类eps提取方法。
授权公告号为cn103304626b的发明专利公开了一种分级提取蓝藻胞外聚合物的方法，该方法包括先通过中低速离心剪切获得可溶性及松散结合型胞外聚合物，再采用微碱热浴结合高速离心剪切提取紧密结合型胞外聚合物。理化分析结果表明，可溶性及松散结合型胞外聚合物有机物含量较少，而紧密结合型胞外聚合物包含大量有机物。三维荧光及红外光谱结果揭示，可溶性胞外聚合物主要由多糖、蛋白类及腐殖类物质组成，而松散结合型及紧密结合型胞外聚合物仅由多糖及蛋白类物质组成。
授权公告号为cn103275172b的发明专利公开了一种湖泊水华蓝藻胞外聚合物的制备方法及应用，该方法包括以下步骤：(1)原位获取湖泊水华蓝藻样品，采用微碱及热浴法实现胞外聚合物与藻体高效分离；(2)采用低温高速离心剪切作用获得胞外聚合物粗品；(3)微孔滤膜过滤，低压浓缩获得富含胞外聚合物的样品；(4)向上述样品中加入无水醇沉，过夜，分离取沉淀；(5)沉淀样品经透析脱盐纯化，冷冻干燥，得到湖泊蓝藻胞外聚合物。
迄今为止，尽管藻类eps在蓝藻水华过程中的重要作用或影响我们尚未知晓也未被系统地研究，但我们必须要认同在eps研究中的第一个重要步骤就是选择适当的提取方法以及探索其基质结构。
必须指出的是，高效可行的提取方法应该是在保证较低的细胞溶胞率的前提下，最大程度地分离出eps中的有机组分。即在提取分离过程中，应该尽量避免化学试剂及胞内物质对eps组分的污染，减少提取过程对eps物理、化学性质的改变。在获得最大的eps产量的同时，保证所提取的eps结构相对完整，物理及化学性质相对稳定。但也应该指出，适合且有效的提取方法应取决于所用的微生物样品，要根据不同样品做出调整。
技术实现要素：
本发明提供了一种铜绿微囊藻胞外聚合物的提取方法，该方法不仅能够大量提取藻类中的eps，而且能够不破坏藻细胞，不造成eps的污染，从而提取出有效的eps组分。
具体技术方案如下：
一种铜绿微囊藻胞外聚合物的提取方法，包括：
(1)取铜绿微囊藻的藻液，离心取上层清液，得到溶解型胞外聚合物；
(2)将步骤(1)中离心后的下层残余物悬浮于缓冲液中，离心取上层清液，得到松散附着型胞外聚合物；
(3)将步骤(2)中离心后的下层残余物悬浮于nacl缓冲液中，加入氢氧化钠，调节缓冲液的ph至11，在4℃、80～120rpm的条件下，搅拌10～20min后，再置于40～60℃下水浴加热20～40min；然后，将缓冲溶液离心，取离心液的上层清液，得到紧密结合型胞外聚合物。
作为优选，步骤(1)中，所述离心的条件为：在4℃下以2500g离心力离心15min。
作为优选，步骤(2)中，所述离心的条件为：在4℃下以8000g离心力离心20min。
作为优选，步骤(2)中，所述缓冲液为质量分数为0.05％的nacl缓冲液。
作为优选，步骤(3)中，所述nacl缓冲液的质量分数为0.05％。
作为优选，步骤(3)中，所述离心的条件为：在4℃下以15000g离心力离心20min。
作为优选，步骤(3)中，搅拌的转速为120rpm，时间为10min。
作为优选，步骤(3)中，水浴加热的温度为40℃，时间为40min。
作为优选，所述铜绿微囊藻为非产毒品系fachb-469。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明对铜绿微囊藻采用“naoh+加热”的组合方式进行胞外聚合物的提取，并严格控制提取的参数条件，不仅能够大量提取藻类中的eps，而且能够不破坏藻细胞，不造成eps的污染，从而提取出有效的eps组分。
附图说明
图1为实施例2中不同提取方法下eps有机组分的含量。
图2为实施例2中不同提取方法下eps有机组分的分布情况。
图3为实施例2中不同提取方法下eps的三维荧光光谱。
图4为实施例3和实施例4中不同提取条件下sl-eps、lb-eps或tb-eps中的toc含量。
图5为实施例3的步骤(3)中不同ph值下sl-eps、lb-eps或tb-eps的三维荧光光谱；
其中，a为ph＝7.5时的lb-eps；b为ph＝7.5时的sl-eps；c为ph＝8时的tb-eps；d为ph＝9时的tb-eps；e为ph＝10时的tb-eps；f为ph＝11时的tb-eps。
图6为实施例3的步骤(3)中不同搅拌速度和搅拌时间下tb-eps的三维荧光光谱；
其中，a为0rpm，0min；b为40rpm，5min；c为40rpm，10min；d为40rpm，15min；e为40rpm，20min。
图7为实施例3的步骤(3)中不同搅拌速度和搅拌时间下tb-eps的三维荧光光谱；
其中，a为80rpm，5min；b为80rpm，10min；c为80rpm，15min；d为80rpm，20min；e为120rpm，5min；f为120rpm，10min；g为120rpm，15min；h为120rpm，20min。
图8为实施例4的步骤(1)和(2)中不同离心条件下sl-eps、lb-eps或tb-eps的三维荧光光谱；
其中，a为步骤(1)中2500g离心15min，步骤(2)中8000g离心20min时的lb-eps；b为步骤(1)中2500g离心15min，步骤(2)中5000g离心15min时的lb-eps；c为步骤(1)中2500g离心15min，步骤(2)中5000g离心15min时的sl-eps；d为步骤(1)中2500g离心15min，步骤(2)中5000g离心15min时的tb-eps；e为步骤(1)中2500g离心15min，步骤(2)中8000g离心20min时的tb-eps；f为步骤(1)中2500g离心15min，步骤(2)中8000g离心20min时的sl-eps。
图9为实施例4的步骤(1)和(2)中不同离心条件下sl-eps、lb-eps或tb-eps的三维荧光光谱；
其中，a为步骤(1)中3000g离心20min，步骤(2)中5000g离心15min时的lb-eps；b为步骤(1)中3000g离心20min，步骤(2)中5000g离心15min时的sl-eps；c为步骤(1)中3000g离心20min，步骤(2)中5000g离心15min时的tb-eps；d为步骤(1)中3000g离心20min，步骤(2)中8000g离心20min时的lb-eps；e为步骤(1)中3000g离心20min，步骤(2)中8000g离心20min时的sl-eps；f为步骤(1)中3000g离心20min，步骤(2)中8000g离心20min时的sl-eps。
图10实施例3的步骤(3)中不同水浴加热温度下tb-eps的三维荧光光谱；
其中，a为40℃，20min；b为40℃，40min；c为60℃，20min；d为60℃，30min；e为60℃，40min；f为80℃，20min；g为80℃，40min。
具体实施方式
以下通过具体实施例和说明书附图对本发明进行更详细的说明。实施例仅是对本发明的一种说明，而不构成对本发明的限制。
下列实施案例中，各指标的测定方法如下：
(1)eps蛋白质含量的测定方法：采用bca试剂盒(上海生工c503061)测定蛋白质浓度。测定原理：在碱性环境下蛋白质分子中的肽键结构与cu2+络合并将cu2+还原成cu1+。bca试剂特异性地与cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有最大的光吸收值，并与蛋白质浓度成正比，可以根据吸收值测定蛋白质浓度。
具体步骤如下：
①配置bca工作液：bca工作液总体积＝(标准曲线测定点数+样品数)×重复次数×每个样品所需的bca工作液体积；根据所需的bca工作液总体积，定量取溶液a：溶液b：溶液c＝25：24：1，混匀，制成bca工作液。
②配置bsa标准溶液：取一定量的bsa标准溶液，用1xpbs溶液稀释为40mg/l。
③制作标准曲线：采用酶标板法，将bsa标准溶液与超纯水按一定比例混合后，在96孔板中分别加入100μl相应浓度的标准蛋白质溶液；再向各酶标孔加入100μlbca工作液，迅速混匀；在37℃保温30min；冷却至室温后，在酶标仪上测各孔的a562值(每个浓度设置3个平行样)。以标准组各孔a562平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，在microsoftexcel软件中绘制标准曲线。标准曲线的线性范围为2～40mg/l。实验得到线性回归方程式：y＝0.0053x+0.0014；r2＝0.9991。
④eps样测定：在96孔板中分别加入100μleps样品；再向各酶标孔加入100μlbca工作液，迅速混匀；在37℃保温30min；冷却至室温后，在酶标仪上测各孔的a562值(每个浓度设置3个平行样)。最后根据标准曲线计算样品的蛋白质浓度。
(2)eps多糖浓度的测定方法：采用蒽酮—硫酸比色法测定多糖浓度。测定原理：高温下糖类会被浓h2so4脱水生成糠醛或糠醛衍生物，并与蒽酮(c14h10o)缩合成蓝色化合物。在620nm处测定吸光度(721型分光光度计)，以葡萄糖的标准曲线可换算出多糖的含量。
具体步骤如下：
①配置标准葡萄糖溶液(100mg/l)：经105℃烘干至恒重的10mg葡萄糖溶解到超纯水中，定容到100ml备用。
②配置蒽酮试剂(0.2％)：取0.2g蒽酮溶解到浓h2so4中，以h2so4定容到100ml，当日配制使用。
③制作标准曲线：分别取标准葡萄糖溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于试管中，以超纯水定容至1ml(每个浓度设置3个平行样)，加入4ml蒽酮后马上放入冰水中摇晃均匀；放入沸水浴中准确煮沸10min；取出后马上用冰水冷却，放至室温后马上于620nm处测定吸光度(721型分光光度计)。以标准组a620平均值为纵坐标，对应的葡萄糖浓度为横坐标，在microsoftexcel软件中绘制标准曲线。标准曲线的线性范围为0～100mg/l。实验得到线性回归方程式：y＝0.0071x+0.0321；r2＝0.9995。
④eps样测定：在试管中加入1mleps样品，加入4ml蒽酮后马上放入冰水中摇晃均匀；放入沸水浴中准确煮沸10min；取出后马上用冰水冷却，放至室温后马上于620nm处测定吸光度(721型分光光度计)。最后根据标准曲线计算样品的多糖的浓度。
(3)eps中dna浓度的测定方法(紫外分光光度计)：测定eps样品于260nm处的吸光度，再根据计算公式ρdna＝a260nm/0.020，得到样品dna浓度。
(4)eps中toc含量的测定方法：分层eps样品toc含量由shimadzu总有机碳分析仪toc-vchp测得。
(5)eps的三维荧光光谱测定方法：三维荧光光谱参数设置以氙灯为激发光源，激发波长和发射波长分别为200nm～500nm和250nm～600nm；激发和发射狭缝设为5nm和2nm；扫描速度为12000nm/min。反应温度控制系统为高精度水浴控制系统，控制温度为25±1℃。以超纯水作为空白样本扣除。
蛋白质、多糖含量测定时，每个样品测量3次取平均值。用matlabr2007b软件绘制eps的三维荧光光谱图，excel2016软件进行绘图分析。
实施例1
1、铜绿微囊藻样品：取购于中国科学院野生生物种质库—淡水藻种库的铜绿微囊藻fachb-469，放置在光照培养箱内，以bg11培养基培养；培养温度为25℃，时间设置为12hr昼：12hr夜，光照条件为2000lux。取500ml藻液过滤，105℃下烘至恒重，得到藻液干物质量约为0.6g/l。实验前测得藻液藻密度约为7×108个/l，叶绿素含量约为3800mg/l，光合活性(fv/fm)约为0.4。
2、铜绿微囊藻eps的提取与分离
具体步骤如下：
(1)取铜绿微囊藻fachb-469藻液500ml，在超低温高速离心机中，以4℃、2500g离心力离心操作15分钟后，取上层清液得到溶解型粘液层(sl-eps)；
(2)将步骤(1)下层的残余物重悬浮于0.05％的nacl缓冲液中，在4℃下以5000g离心力离心操作15分钟后，取上清液得到松散附着型胞外聚合物(lb-eps)；
(3)将步骤(2)下层的残余物重悬浮于0.05％的nacl缓冲液中，加入氢氧化钠，调节缓冲液的ph至11，在4℃、80rpm的条件下，搅拌10min后，再置于60℃下水浴加热30min；然后，将缓冲溶液至于4℃下以15000g离心力离心操作20分钟，取上清液得到紧密结合型胞外聚合物(tb-eps)。
实施例2
本实施例采用不同方法对铜绿微囊藻eps进行提取与分离，除步骤(3)与实施例1不同外，其余步骤与实施例1完全相同。
步骤(3)的处理方法如下：
处理1(记为tb-1)：将步骤(2)下层的残余物重悬浮于0.05％的nacl缓冲液中，在120w、25khz的条件下超声2min；然后，将缓冲溶液至于4℃下以15000g离心力离心操作20分钟，取上清液得到紧密结合型胞外聚合物(tb-eps)。
处理2(记为tb-2)：将步骤(2)下层的残余物重悬浮于0.05％的nacl缓冲液中，60℃下水浴加热30min；然后，将缓冲溶液至于4℃下以15000g离心力离心操作20分钟，取上清液得到紧密结合型胞外聚合物(tb-eps)。
处理3(记为tb-3)：将步骤(2)下层的残余物重悬浮于0.05％的nacl缓冲液中，加70g/g干物质量的cer(阳离子交换树脂dowex50)，在4℃、600rpm条件下，搅拌3h；然后，将缓冲溶液至于4℃下以15000g离心力离心操作20分钟，取上清液得到紧密结合型胞外聚合物(tb-eps)。
处理4(记为tb-4)：将步骤(2)下层的残余物重悬浮于0.05％的nacl缓冲液中，在4℃下加2％的edta(乙二胺四乙酸)100ml，搅拌3h；然后，将缓冲溶液至于4℃下以15000g离心力离心操作20分钟，取上清液得到紧密结合型胞外聚合物(tb-eps)。
处理5(记为tb-5)：将步骤(2)下层的残余物重悬浮于0.05％的nacl缓冲液中，在4℃下加1m的氢氧化钠调ph至11，在80rpm的条件下，搅拌10min；然后，将缓冲溶液至于4℃下以15000g离心力离心操作20分钟，取上清液得到紧密结合型胞外聚合物(tb-eps)。
处理6(记为tb-6)：将步骤(2)下层的残余物重悬浮于0.05％的nacl缓冲液中，在4℃下加体积分数为37％～40％的甲醛0.5ml；然后，将缓冲溶液至于4℃下以15000g离心力离心操作20分钟，取上清液得到紧密结合型胞外聚合物(tb-eps)。
处理7(记为tb-7)：如实施例1所述。
处理8(记为tb-8)：将步骤(2)下层的残余物重悬浮于0.05％的nacl缓冲液中，在4℃下加体积分数为37％～40％的甲醛0.5ml，再在120w、25khz的条件下超声2min；然后，将缓冲溶液至于4℃下以15000g离心力离心操作20分钟，取上清液得到紧密结合型胞外聚合物(tb-eps)。
对照处理(记为tb-0)：将未经任何处理的铜绿微囊藻样品直接至于4℃下以15000g离心力下离心操作20分钟得到产物.
测定上述方法中获得的sl-eps、lb-eps和tb-eps中的蛋白含量、多糖浓度、dna浓度、toc含量以及eps的三维荧光光谱，结果如表1～2以及图1～3所示。
表1不同提取方法下得到的eps组分和含量
表2不同提取方法下eps的三维荧光峰位置及荧光强度
由图表1～2以及图1～3可知，不同的提取方法对铜绿微囊藻eps中各组分的提取效果影响很大。本次实验提取的铜绿微囊藻eps中多糖含量在30.21％-90％左右；而蛋白含量在1.66％～10.01％左右(加热提取法除外)。大部分提取方法提取的eps中主要成分为多糖，而加热法和氢氧化钠+加热的方法提取的eps中蛋白质的含量高于多糖。
由图1可知，加热法和氢氧化钠+加热的方法提取的eps中蛋白质含量为31.77±0.15mg·g-1drycell和96.13.±0.26mg·g-1drycell，而其他方法蛋白质的提取量很少，都在10mg·g-1drycell以下。这说明相比多糖，eps中的蛋白质更难被提取。进一步的分析表明，加热+氢氧化钠提取法中蛋白质/多糖＝2.1，单纯加热提取的蛋白质/多糖＝1.15，而氢氧化钠法提取的蛋白质/多糖<1，这说明加热使得eps中的蛋白质组分松动更容易被提取，表现出较高的蛋白提取效率。
另一方面，与其他方法相比，cer、edta、甲醛、甲醛+超声等提取方法提取的eps中dna含量均非常高，大约占eps总量的15.14％～67.85％。而liao等人认为eps中dna的含量可以反映eps提取过程中细胞溶胞的程度，当eps中dna的含量占总提取量的2％～15％时，我们可以认为在eps提取过程中没有发生严重的细胞溶解现象。这表明这四种方法均会导致严重的细胞裂解和胞内物泄漏，不适合用于铜绿微囊藻eps的提取。另外，用甲醛法和edta法提取的eps中toc的含量超过1000mg·g-1drycell，说明这两种方法的提取试剂和药品本身带来的影响太大，会对提取物产生污染。
从图3可以看出，不同的提取方法对铜绿微囊藻tb-eps的三维荧光特性有很大的影响。如荧光峰数量就有很大的差异，从1个荧光峰到4个荧光峰不等。用edta法提取的tb-eps中只有一个荧光峰，而氢氧化钠+加热法提取的tb-eps中则显示出四个荧光峰。从图3可知,大多数提取方法均能提取出eps中的2个荧光峰(峰a：ex/em＝220～225nm/304～342nm；峰b：ex/em＝275～280nm/306～348nm)，根据chenwen等人对三维荧光光谱的5个分区，峰a为芳香蛋白、峰b为可溶性微生物代谢产物。而edta法提取的eps只显示荧光峰b，未显示峰a的芳香蛋白类物质，这可能是edta与蓝藻eps中的芳香蛋白形成了非荧光络合物。另外，cer提取法在提取出荧光峰a、b的同时，还提取出荧光峰c，加热法则提取出荧光峰d，而氢氧化钠+加热法则同时提取出荧光峰c和d(峰c：ex/em＝275nm/438～440nm；峰d：ex/em＝365nm/442～448nm)。峰c、峰d均为类腐殖酸物质。
另一方面，由图3中可知，不同提取方法下eps荧光峰的荧光强度也大不相同。显然，加热法以及氢氧化钠+加热法提取的eps的荧光峰的荧光强度最大。特别是峰a和峰b，荧光强度在3506～5571r.u.左右，大约是其他提取法的4～60倍。峰a主要为芳香蛋白类物质，这与上文中这两种提取法蛋白/多糖>1的结果相一致，说明加热更容易使eps中蛋白类物质被提取。a、b峰为主峰可以得出芳香蛋白类物质和可溶性微生物代谢产物是本次提取实验中eps的主要荧光成分，且一般的，峰a的荧光强度要高于峰b。
所以，相比于其他提取方法，氢氧化钠+加热法提取的eps的荧光峰数量最多、荧光强度最大，更适宜于铜绿微囊藻eps的提取。对于需要对藻类eps进行三维荧光光谱分析的研究中，显然这是最佳提取方法。
不同的提取方法以及蓝藻eps本身的差异性都对eps中不同组分的提取量有很大影响。从eps中各组分的提取量以及细胞裂解的情况来看：cer、edta、甲醛、甲醛+超声等提取方法虽然对藻类eps提取总量很大，但对藻细胞破坏太大，eps污染严重；而超声、氢氧化钠等提取方法提取的eps总量太少，无法有效的提取铜绿微囊藻的eps；加热、加热+氢氧化钠等提取方法既能大量提取eps，又能不破坏藻细胞本身，从而提取出有效的eps组分。在三维荧光光谱分析中，相比于其他提取方法，氢氧化钠+加热法提取的荧光峰最多、荧光峰强度最高，说明其适于蓝藻eps的提取及进一步分析。
综上，氢氧化钠+加热为铜绿微囊藻eps的最佳提取方法。所应用的eps分层提取过程可以让我们对藻类eps的结构和组成有一个更深入的了解。此外，它也将是一个有用的概念工具，帮助我们更深层次的理解藻类eps的生物絮凝和吸附作用。
实施例3
本实施例探究ph值的改变、搅拌转速和时间的改变、水浴温度和时间的改变对eps污染情况和三维荧光特征的影响，除步骤(3)与实施例1不同外，其余步骤与实施例1完全相同。
步骤(3)的处理方法如下：
处理1：将步骤(2)下层的残余物重悬浮于0.05％的nacl缓冲液中，加入氢氧化钠，调节缓冲液的ph分别至8、9、10、11，在4℃、80rpm的条件下，搅拌10min后，再置于60℃下水浴加热30min；然后，将缓冲溶液至于4℃下以15000g离心力离心操作20分钟，取上清液得到紧密结合型胞外聚合物(tb-eps)。
处理2：将步骤(2)下层的残余物重悬浮于0.05％的nacl缓冲液中，加入氢氧化钠，调节缓冲液的ph至11，在4℃，40、80、120rpm的条件下，分别搅拌5、10、15、20min后，同时设置一组4℃，0rpm的条件下，搅拌0min的对照组，再置于60℃下水浴加热30min；然后，将缓冲溶液至于4℃下以15000g离心力离心操作20分钟，取上清液得到紧密结合型胞外聚合物(tb-eps)。
处理3：将步骤(2)下层的残余物重悬浮于0.05％的nacl缓冲液中，加入氢氧化钠，调节缓冲液的ph至11，在4℃、80rpm的条件下，搅拌10min后，再分别置于40℃、60℃、80℃下水浴加热20min和40min；然后，将缓冲溶液至于4℃下以15000g离心力离心操作20分钟，取上清液得到紧密结合型胞外聚合物(tb-eps)。
测定获得的sl-eps、lb-eps和tb-eps中的toc含量以及eps的三维荧光光谱，结果如表3以及图4所示。
实施例4
本实施例探究离心条件不同对eps污染情况和三维荧光特征的影响，除步骤(1)、(2)与实施例1不同外，其余步骤与实施例1完全相同。
步骤(1)的处理方法如下：
(1)取铜绿微囊藻fachb-469藻液500ml，在超低温高速离心机中，以4℃、2500g和4℃、3000g离心力离心操作15和20分钟后，取上层清液得到溶解型粘液层(sl-eps)；
(2)将步骤(1)下层的残余物重悬浮于0.05％的nacl缓冲液中，在4℃下以5000g和8000g离心力离心操作15和20分钟后，取上清液得到松散附着型胞外聚合物(lb-eps)；
测定获得的sl-eps、lb-eps和tb-eps中的toc含量以及eps的三维荧光光谱，结果如表3以及图4所示。
表3不同处理方法下得到的eps的toc含量
由表3和图4可知，在ph＝10时所测的toc含量最大，说明在ph＝10的条件下破坏藻细胞，造成eps的污染；在ph＝11时所测的toc含量最少，说明在ph＝11的条件下提取eps最合适，与上述实施例2中所得结论相吻合。
改变搅拌转速和时间的实验条件下，在转速和时间都为0的情况下所测得的toc值为最大值2.343mg/l，这表明我们在提取tb-eps时必须经过搅拌这一步骤，同时，在转速为120rpm，搅拌时间为10min的条件下测得的toc值最小，说明与实施例1中的搅拌条件相比，我们在提取tb-eps时可适当提高搅拌速度。
在改变水浴加热温度和时间的实验中，水浴温度为40℃，加热时间为40min的条件下所测的toc的浓度最低，说明在此条件下提取的eps受污染程度最小；而在实施例1中所选取的水浴温度为60℃，加热时间为30min的条件下所测的toc的浓度也比较小，不超过1mg/l，说明提取的tb-eps没受到太大污染；从图中进一步看出水浴加热温度为80℃的条件下，toc浓度较高，说明高温破坏藻细胞结构，造成藻细胞破裂，提取出的eps受污染程度较大，不适用于藻类eps的提取。
在改变离心条件的实验中，从图4中可看出最适宜藻类胞外聚合物提取的离心条件是步骤(1)中在4℃条件下离心力2500g，离心15min，步骤(2)中在4℃条件下离心力8000g，离心20min，在此条件下所测得的toc浓度最适宜。