本发明属于藻类生物学领域，具体涉及一种利用超声波破碎藻类细胞测定叶绿素的分光光度方法。
背景技术：
藻类植物的大量生长是水体富营养化的主要现象，其中叶绿素a是所有浮游植物门类都含有的叶绿素类型，不仅作为水体营养状态划分的重要指标，而且可用于表征浮游植物的现存量，因此，叶绿素a在水体富营养状况评价中起关键性作用。水中藻类植物属于微小植物，要提取其叶绿素a大多采用化学试剂法、研磨法、反复冻溶法进行细胞破碎处理，但是化学试剂法对细胞有毒害作用，时间长，效率低；研磨法耗时间、耗费人力，研磨不充分，破碎提取率低；反复冻融法是通过将细胞置于极端低温下和常温下进行热胀冷缩进行破碎，耗时长，破碎提取率低，低温情况下容易使得细胞变性。脱镁叶绿素a能干扰叶绿素a的测定，目前的现有技术中，没有好的方法去校正脱镁叶绿素a的干扰，从而在测定时会影响测定结果。因此，有必要研究一种高效的破碎藻类细胞以及准确测定水质叶绿素的方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种利用超声波破碎藻类细胞测定叶绿素的分光光度方法。本发明的目的是这样实现的，包括以下步骤：1)预处理：采集地表水样于棕色或者深色瓶中，加入碳酸镁悬浊液,混匀，取定量体积的混匀水样，放入带有滤膜的真空抽滤装置上进行抽滤处理，获得藻类细胞；2）叶绿素提取：将经过抽滤的藻类细胞使用超声波破碎，再加入10ml丙酮溶液，放置于4℃温度下中避光浸泡4~12h备用，浸泡期间再摇振3~4次，之后使用离心机离心，取上清液；3）分光光度法测定及计算：将经过离心得到的上清液倒入比色皿中，采用分光光度计分别在750nm、664nm、647nm、630nm的波长下进行测定，按照三色方程公式计算地表水体中浮游藻类细胞的叶绿素a、b、c，再测定脱镁叶绿素校正含量，并用单色方程公式计算脱镁叶绿素校正含量。与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：1、利用超声波的空化效应及其机械振动进行细胞破碎，能够加快细胞破碎进度，破碎更为完全，有效提取大部分藻类细胞中的叶绿素。2、在校正脱镁叶绿素a时，分别测定酸化前后吸收池内的吸光度，代入公式中计算，以校正脱美叶绿素a对叶绿素a的干扰，该方法使得测定叶绿素的结果更为准确。3、不需要在冷冻条件下进行操作，不会使得浮游藻类细胞变性，能有效缩短破碎时间，提高破碎提取率，能处理大量细胞，具有很好的市场推广前景。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。一种利用超声波破碎藻类细胞测定叶绿素的分光光度方法，包括以下步骤：1)预处理：采集地表水样于棕色或者深色瓶中，加入碳酸镁悬浊液,混匀，取定量体积的混匀水样，放入带有滤膜的真空抽滤装置上进行抽滤处理，获得藻类细胞；2）叶绿素提取：将经过抽滤的藻类细胞使用超声波破碎，再加入10ml丙酮溶液，放置于4℃温度下中避光浸泡4~12h备用，浸泡期间再摇振3~4次，之后使用离心机离心，取上清液；3）分光光度法测定及计算：将经过离心得到的上清液倒入比色皿中，采用分光光度计分别在750nm、664nm、647nm、630nm的波长下进行测定，按照三色方程公式计算地表水体中浮游藻类细胞的叶绿素a、b、c，再测定脱镁叶绿素校正含量，并用单色方程公式计算脱镁叶绿素校正含量。进一步的，所述的步骤1）中过滤所得的藻类细胞需要避光并在-20℃温度下保存，低温运输；抽滤后的藻类细胞需要于外面包裹一层铝箔，在-20℃以下温度中保存，并于25d内分析测试完毕。进一步的，所述的步骤1）中的碳酸镁悬浊液为浓度1%的碳酸镁悬浊液，加入量为每升水样加入1ml，所述的碳酸镁悬浊液的配制方法为取1.0g碳酸镁粉末，加人100ml纯水，搅拌成悬浊液，每次使用时充分摇匀。进一步的，所述的步骤1）中的滤膜为玻璃纤维滤膜，直径为47mm、孔径为0.7μm；所述的步骤1）中的抽滤的负压小于20kpa，逐渐减压，在水样刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干剩余水分。进一步的，所述的步骤2）中的超声波破碎是采用超声波清洗器进行超声，超声的频率为50~200khz，处理时间为10~30min；所述的步骤2）中的丙酮溶液浓度为90%，配制方法为900ml丙酮中加100ml纯水；所述的步骤2）中的离心机的离心速度为3500~4200r/min，离心时间为10~30min。进一步的，所述的步骤3）中的分光光度法具体采用光程为1cm的比色皿，90%丙酮溶液作参比液进行比色，分光光度计采用波长为380~780nm的分光光度计，进行测定过程中的注意事项为测定750nm波长处的吸光度大于0.005，需用孔径为0.45μm的聚四氟乙烯有机相针式过滤器进行过滤后在测定。进一步的，所述的步骤3）中的三色方程公式为：ρchl-a=[11.85(a647-a750)-1.54(a664-a750)-0.08(a630-a750)]v1/(v2l),ρchl-b=[21.03(a647-a750)-5.43(a664-a750)-2.66(a630-a750)]v1/(v2l),ρchl-c=[24.52(a630-a750)-7.60(a647-a750)-1.67(a664-a750)]v1/(v2l);其中，pchl-a为水样中叶绿素a的质量浓度，单位为μg/l，pchl-b为水样中叶绿素b的质量浓度，单位为μg/l，ρchl-c为水样中叶绿素c的质量浓度，单位为μg/l，a750为提取液在波长750nm处的吸光度值，a664为提取液在波长664nm处的吸光度值，a647为提取液在波长647nm处的吸光度值，a630为提取液在波长630nm处的吸光度值，v1为提取液体积，单位为ml，v2为水样体积，单位为l；l为比色皿光程，单位为cm。进一步的，所述的步骤3）中的单色方程公式计算脱镁叶绿素校正含量的具体操作步骤为向装有离心上清液的1cm比色皿内滴加40μl的0.1mol/l的盐酸溶液,处理时间为10~30min，然后于750nm、665nm处测定吸光度。进一步的，所述的步骤3）中的单色方程公式为:ρ,chl-a=26.7[(a664-a750)-(a665a-a750a)]v1/（v2l），ρphe-a=26.7[1.7(a665a-a750a)-(a664-a750)]v1/（v2l）；其中，p,chl-a为水样中校正脱镁叶绿素a后叶绿素a的质量浓度，单位为μg/l；pphe-a为水样中脱镁叶绿素a的质量浓度，单位为μg/l；a750为提取液酸化前在波长750nm处的吸光度值；a664为提取液酸化前在波长664nm处的吸光度值；a750a为提取液酸化后在波长750nm处的吸光度值；a665a为提取液酸化后在波长665nm处的吸光度值；v1为提取液体积，单位为ml；v2为水样体积，单位为l；l为比色皿光程，单位为cm。实施例1一种利用超声波破碎藻类细胞测定叶绿素的分光光度方法，包括以下步骤：1.适用范围本方法规定了测定水中叶绿素的分光光度法。本标准适用于地表水中叶绿素的测定。水样体积为300ml，使用1cm比色皿时，叶绿素a的检出限为0.11μg/l,测定下限为0.5μg/l；叶绿素b的检出限为0.25μg/l,测定下限为1.0μg/l；叶绿素c的检出限为0.25μg/l.测定下限为1.0μg/l。2.方法原理将一定量水样用玻璃纤维膜过滤，收集藻类，使用超声波对藻类细胞进行破碎，用90%丙酮溶液提取叶绿素，根据叶绿素光谱特性依次测定750nm、664nm、647nm、630nm波长下的吸光度，计算叶绿素的含量。3干扰及消除脱镁叶绿素a能干扰叶绿素a的测定，当含有脱镁叶绿素a时，应在测定叶绿素a的同时测定脱镁叶绿素a的含量，以校正干扰。校正脱镁叶绿素a时，分别测定酸化前后吸收池内的吸光度，代入公式中计算，以校正脱美叶绿素a对叶绿素a的干扰。4.试剂和材料除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂和纯水。4.1碳酸镁悬浊液:w(mgco3,)=1%，于1.0g碳酸镁粉末中加人100ml纯水，搅拌成悬浊液。每次使用时应充分摇匀。4.2丙酮溶液:(c3h6o)=90%，在900ml丙酮中加100ml纯水。4.3盐酸溶液:c(hc1)=0.1mol/l，将8.5ml浓盐酸加人到500ml纯水中，冷却至室温后稀释至1000ml。5.仪器和设备分析时均使用符合国家标准的a级玻璃量器。5.1可见分光光度计。5.2抽滤器。5.3微孔滤膜：直径为47mm、孔径为0.7μm的玻璃纤维滤膜。5.4超声波清洗器。5.5离心机：转速能达到3500~4200r/min,使用带控温装置的离心机。5.6培养皿：用来盛放、转移滤膜。5.7具塞玻璃离心管：10ml或15ml。5.8铝箔。5.9镊子。5.10针式过滤器：0.45μm孔径的聚四氟乙烯有机相针式过滤器。5.11实验室常用仪器。6.水样的采集和保存6.1水样的采集根据不同的水体，采集1000ml水样于深色塑料瓶中，加人1ml的1%碳酸镁悬浊液，以防止酸化引起的色素溶解。6.2水样的保存水样应避光保存，低温运输。采样后24h内用玻璃纤维滤膜过滤水样，过滤后的滤膜在-20℃以下的冰箱内保存，并于25d内分析测试完毕。7.分析步骤7.1抽滤将微孔滤膜(见5.3条)放置在连接有真空泵的抽滤器上，根据水样中叶绿素的浓度准确量取定量体积的混匀水样进行抽滤，抽滤时负压为15kpa,逐渐减压，在水样刚刚完全通过滤膜时结束抽滤。用镊子小心将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干剩余水分。如果样品不能及时提取，应将吸干水分的滤膜放人培养皿中，外面包裹一层铝箔，放人-20℃以下的冰箱中保存。7.2提取将过滤后的滤膜放人具塞玻璃离心管中，盖紧塞帽，放入超声波清洗器超声，超声的频率为200khz，处理时间为20min，向离心管中加入10ml的浓度为90%丙酮溶液，盖紧塞帽剧烈摇振片刻，放置于4℃冰箱中避光浸泡8h，在浸泡过程中应再摇振3次。7.3离心将离心管放人离心机中，以4200r/min的速度离心20min。7.4测定将离心后的上清液倒人1cm比色皿中，以90%丙酮溶液做参比，分别在750nm、664nm、647nm、630nm波长处测定吸光度值。当含有脱镁叶绿素a时，应在测定叶绿素a的同时测定脱镁叶绿素a的含量。具体做法是：向装有离心上清液的1cm比色皿内滴加40μl盐酸溶液，酸化20min后测定750nm、665nm波长处吸光度值。8结果计算8.1叶绿素计算公式按照下式计算水体中叶绿素的浓度:ρchl-a=[11.85(a647-a750)-1.54(a664-a750)-0.08(a630-a750)]v1l/(v2l),ρchl-b=[21.03(a647-a750)-5.43(a664-a750)-2.66(a630-a750)]v1l/(v2l),ρchl-c=[24.52(a630-a750)-7.60(a647-a750)-1.67(a664-a750)]v1l/(v2l);其中，pchl-a为水样中叶绿素a的质量浓度，单位μg/l，pchl-b为水样中叶绿素b的质量浓度，单位μg/l，ρchl-c为水样中叶绿素c的质量浓度，单位μg/l，a750为提取液在波长750nm处的吸光度值，a664为提取液在波长664nm处的吸光度值，a647为提取液在波长647nm处的吸光度值，a630为提取液在波长630nm处的吸光度值，v1为提取液体积，单位为ml，v2为水样体积，单位为l；l为比色皿光程，单位为cm。8.2校正脱镁叶绿素a的计算公式按照下式计算校正脱镁叶绿素a后叶绿素a及中脱镁叶绿素a的浓度:ρ,chl-a=26.7[(a664-a750)-(a665a-a750a)]v1/（v2l），ρphe-a=26.7[1.7(a665a-a750a)-(a664-a750)]v1/（v2l）；其中，p,chl-a为水样中校正脱镁叶绿素a后叶绿素a的质量浓度，单位为μg/l；pphe-a为水样中脱镁叶绿素a的质量浓度，单位为μg/l；a750为提取液酸化前在波长750nm处的吸光度值；a664为提取液酸化前在波长664nm处的吸光度值；a750a为提取液酸化后在波长750nm处的吸光度值；a665a为提取液酸化后在波长665nm处的吸光度值；v1为提取液体积，单位为ml；v2为水样体积，单位为l；l为比色皿光程，单位为cm。表1叶绿素a不同方法的检测结果比对单位：mg/l监测方法概要水样体积（ml）1234平均备注sl88-2012规范监测3000.08330.08460.08400.08390.0840严格按规范做4个平行样,加丙酮10ml放置8h,离心20min测定本发明的方法3000.08400.08330.08380.08390.0838做4个平行样,不冻，不加丙酮超声20min后加丙酮10ml，放置8h，离心20min测定从表1可看出，使用《sl88-2012水质叶绿素的测定分光光度法》的冰箱反复冷冻解冻法所测结果（0.0840mg/l）与本发明的方法检测结果（0.0838mg/l）是一致的。从表1可看出两种方法所测结果有规范监测大于超声波法监测的，也有超声波法监测大于规范监测，虽然4个数据的平均值超声波法监测比规范监测小了0.21%，但从表1可看出可能是由规范监测的第2个组据略有编大造成。通过两种方法的监测结果对比可看出，使用超声波破碎法监测水体中的叶绿素方法所得数据是可靠的，且大大提高了工作效率，值得推广应用。实施例2一种利用超声波破碎藻类细胞测定叶绿素的分光光度方法，包括以下步骤：1)预处理：采集1000ml地表水样于棕色瓶中，加入1%碳酸镁悬浊液,然后用直径为47mm、孔径为0.7μm的玻璃纤维滤膜进行过滤，获得藻类细胞，再放置到真空泵上进行抽滤处理，抽滤时负压为20kpa，逐渐减压，在水样刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干剩余水分；其中，碳酸镁悬浊液配制方法为取1.0g碳酸镁粉末，加人100ml纯水，搅拌成悬浊液，每次使用时充分摇匀。其中，过滤所得的藻类细胞需要避光并在-20℃温度下保存，低温运输；抽滤后的藻类细胞需要于外面包裹一层铝箔，在-20℃以下温度中保存。2）叶绿素提取：将经过抽滤的藻类细胞使用超声波清洗器破碎，超声的频率为50khz，处理时间为30min，之后加入10ml丙酮溶液，放置于4℃温度下中避光浸泡12h，在浸泡过程中再摇振4次，之后使用离心机离心，离心速度为4000r/min，离心时间为30min，离心后取上清液；其中，丙酮溶液浓度为90%，配制方法为900ml丙酮中加100ml纯水。3）分光光度法测定及计算：将经过离心得到的上清液倒入比色皿中，采用分光光度计分别在750nm、664nm、647nm、630nm的波长下进行测定，按照三色方程公式计算地表水体中浮游藻类细胞的叶绿素a、b、c，再测定脱镁叶绿素校正含量，并用单色方程公式计算脱镁叶绿素校正含量。其中，分光光度法具体采用光程为1cm的比色皿，90%丙酮溶液作参比液进行比色，分光光度计采用波长为380~780nm的分光光度计，测定注意事项为测定750nm波长处的吸光度大于0.005，需用孔径为0.45μm聚四氟乙烯有机相针式过滤器过滤后在测定。其中，三色方程公式为：ρchl-a=[11.85(a647-a750)-1.54(a664-a750)-0.08(a630-a750)]v1/(v2l),ρchl-b=[21.03(a647-a750)-5.43(a664-a750)-2.66(a630-a750)]v1/(v2l),ρchl-c=[24.52(a630-a750)-7.60(a647-a750)-1.67(a664-a750)]v1/(v2l);pchl-a为水样中叶绿素a的质量浓度，单位μg/l，pchl-b为水样中叶绿素b的质量浓度，单位μg/l，ρchl-c为水样中叶绿素c的质量浓度，单位μg/l，a750-为提取液在波长750nm处的吸光度值，a664为提取液在波长664nm处的吸光度值，a647为提取液在波长647nm处的吸光度值，a630为提取液在波长630nm处的吸光度值，v1为提取液体积，单位为ml，v2为水样体积，单位为l；l为比色皿光程，单位为cm。其中，单色方程测定脱镁叶绿素校正含量，具体测量步骤为向装有离心上清液的1cm比色皿内滴加40μl盐酸溶液进行酸化处理,处理时间为30min，然后于750nm、665nm处测定吸光度。其中，盐酸溶液为c(hc1)=0.1mol/l，配制方法是将8.5ml浓盐酸加人到500ml纯水中，冷却至室温后稀释至1000ml。其中，单色方程公式为:ρ,chl-a=26.7[(a664-a750)-(a665a-a750a)]v1/（v2l），ρphe-a=26.7[1.7(a665a-a750a)-(a664-a750)]v1/（v2l）；p,chl-a为水样中校正脱镁叶绿素a后叶绿素a的质量浓度，单位为μg/l；pphe-a为水样中脱镁叶绿素a的质量浓度，单位为μg/l；a750为提取液酸化前在波长750nm处的吸光度值；a664为提取液酸化前在波长664nm处的吸光度值；a750a为提取液酸化后在波长750nm处的吸光度值；a665a为提取液酸化后在波长665nm处的吸光度值；v1为提取液体积，单位为ml；v2为水样体积，单位为l；l为比色皿光程，单位为cm。实施例3一种利用超声波破碎藻类细胞测定叶绿素的分光光度方法，包括以下步骤：1)预处理：采集1000ml地表水样于棕色瓶中，加入1%碳酸镁悬浊液,然后用直径为47mm、孔径为0.7μm的玻璃纤维滤膜进行过滤，获得藻类细胞，再放置到真空泵上进行抽滤处理，抽滤时负压为20kpa，逐渐减压，在水样刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干剩余水分；其中，碳酸镁悬浊液配制方法为取1.0g碳酸镁粉末，加人100ml纯水，搅拌成悬浊液，每次使用时充分摇匀。其中，过滤所得的藻类细胞需要避光并在-20℃温度下保存，低温运输；抽滤后的藻类细胞需要于外面包裹一层铝箔，在-20℃以下温度中保存。2）叶绿素提取：将经过抽滤的藻类细胞使用超声波清洗器破碎，超声的频率为200khz，处理时间为30min，之后加入10ml丙酮溶液，放置于4℃温度下中避光浸泡10h，在浸泡过程中再摇振4次，之后使用离心机离心，离心速度为4200r/min，离心时间为30min，离心后取上清液；其中，丙酮溶液浓度为90%，配制方法为900ml丙酮中加100ml纯水。3）分光光度法测定及计算：将经过离心得到的上清液倒入比色皿中，采用分光光度计分别在750nm、664nm、647nm、630nm的波长下进行测定，按照三色方程公式计算地表水体中浮游藻类细胞的叶绿素a、b、c，再测定脱镁叶绿素校正含量，并用单色方程公式计算脱镁叶绿素校正含量。其中，分光光度法具体采用光程为1cm的比色皿，90%丙酮溶液作参比液进行比色，分光光度计采用波长为380~780nm的分光光度计，测定注意事项为测定750nm波长处的吸光度大于0.005，需用孔径为0.45μm聚四氟乙烯有机相针式过滤器过滤后在测定。其中，三色方程公式为：ρchl-a=[11.85(a647-a750)-1.54(a664-a750)-0.08(a630-a750)]v1/(v2l),ρchl-b=[21.03(a647-a750)-5.43(a664-a750)-2.66(a630-a750)]v1/(v2l),ρchl-c=[24.52(a630-a750)-7.60(a647-a750)-1.67(a664-a750)]v1/(v2l);pchl-a为水样中叶绿素a的质量浓度，单位μg/l，pchl-b为水样中叶绿素b的质量浓度，单位μg/l，ρchl-c为水样中叶绿素c的质量浓度，单位μg/l，a750-为提取液在波长750nm处的吸光度值，a664为提取液在波长664nm处的吸光度值，a647为提取液在波长647nm处的吸光度值，a630为提取液在波长630nm处的吸光度值，v1为提取液体积，单位为ml，v2为水样体积，单位为l；l为比色皿光程，单位为cm。其中，单色方程测定脱镁叶绿素校正含量，具体测量步骤为向装有离心上清液的1cm比色皿内滴加40μl盐酸溶液进行酸化处理,处理时间为30min，然后于750nm、665nm处测定吸光度。其中，盐酸溶液为c(hc1)=0.1mol/l，配制方法是将8.5ml浓盐酸加人到500ml纯水中，冷却至室温后稀释至1000ml。其中，单色方程公式为:ρ,chl-a=26.7[(a664-a750)-(a665a-a750a)]v1/（v2l），ρphe-a=26.7[1.7(a665a-a750a)-(a664-a750)]v1/（v2l）；p,chl-a为水样中校正脱镁叶绿素a后叶绿素a的质量浓度，单位为μg/l；pphe-a为水样中脱镁叶绿素a的质量浓度，单位为μg/l；a750为提取液酸化前在波长750nm处的吸光度值；a664为提取液酸化前在波长664nm处的吸光度值；a750a为提取液酸化后在波长750nm处的吸光度值；a665a为提取液酸化后在波长665nm处的吸光度值；v1为提取液体积，单位为ml；v2为水样体积，单位为l；l为比色皿光程，单位为cm。实施例4一种利用超声波破碎藻类细胞测定叶绿素的分光光度方法，包括以下步骤：1)预处理：采集1000ml地表水样于棕色瓶中，加入浓度为1%碳酸镁悬浊液,然后用直径为47mm、孔径为0.7μm的玻璃纤维滤膜进行过滤，获得藻类细胞，再放置到真空泵上进行抽滤处理，抽滤时负压为10kpa，逐渐减压，在水样刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干剩余水分；其中，碳酸镁悬浊液配制方法为取1.0g碳酸镁粉末，加人100ml纯水，搅拌成悬浊液，每次使用时充分摇匀。其中，过滤所得的藻类细胞需要避光并在-20℃温度下保存，低温运输；抽滤后的藻类细胞需要于外面包裹一层铝箔，在-20℃以下温度中保存。2）叶绿素提取：将经过抽滤的藻类细胞使用超声波清洗器破碎，超声的频率为75khz，处理时间为10min，之后加入10ml丙酮溶液，放置于4℃温度下中避光浸泡8h，在浸泡过程中再摇振3次，之后使用离心机离心，离心速度为3800r/min，离心时间为10min，离心后取上清液；其中，丙酮溶液浓度为90%，配制方法为900ml丙酮中加100ml纯水。3）分光光度法测定及计算：将经过离心得到的上清液倒入比色皿中，采用分光光度计分别在750nm、664nm、647nm、630nm的波长下进行测定，按照三色方程公式计算地表水体中浮游藻类细胞的叶绿素a、b、c，再测定脱镁叶绿素校正含量，并用单色方程公式计算脱镁叶绿素校正含量。其中，分光光度法具体采用光程为1cm的比色皿，90%丙酮溶液作参比液进行比色，分光光度计采用波长为380~780nm的分光光度计，测定注意事项为测定750nm波长处的吸光度大于0.005，需用孔径为0.45μm聚四氟乙烯有机相针式过滤器过滤后在测定。其中，三色方程公式为：ρchl-a=[11.85(a647-a750)-1.54(a664-a750)-0.08(a630-a750)]v1/(v2l),ρchl-b=[21.03(a647-a750)-5.43(a664-a750)-2.66(a630-a750)]v1/(v2l),ρchl-c=[24.52(a630-a750)-7.60(a647-a750)-1.67(a664-a750)]v1/(v2l);pchl-a为水样中叶绿素a的质量浓度，单位μg/l，pchl-b为水样中叶绿素b的质量浓度，单位μg/l，ρchl-c为水样中叶绿素c的质量浓度，单位μg/l，a750-为提取液在波长750nm处的吸光度值，a664为提取液在波长664nm处的吸光度值，a647为提取液在波长647nm处的吸光度值，a630为提取液在波长630nm处的吸光度值，v1为提取液体积，单位为ml，v2为水样体积，单位为l；l为比色皿光程，单位为cm。其中，单色方程测定脱镁叶绿素校正含量，具体测量步骤为向装有离心上清液的1cm比色皿内滴加40μl盐酸溶液进行酸化处理,处理时间为10min，然后于750nm、665nm处测定吸光度。其中，盐酸溶液为c(hc1)=0.1mol/l，配制方法是将8.5ml浓盐酸加人到500ml纯水中，冷却至室温后稀释至1000ml。其中，单色方程公式为:ρ,chl-a=26.7[(a664-a750)-(a665a-a750a)]v1/（v2l），ρphe-a=26.7[1.7(a665a-a750a)-(a664-a750)]v1/（v2l）；p,chl-a为水样中校正脱镁叶绿素a后叶绿素a的质量浓度，单位为μg/l；pphe-a为水样中脱镁叶绿素a的质量浓度，单位为μg/l；a750为提取液酸化前在波长750nm处的吸光度值；a664为提取液酸化前在波长664nm处的吸光度值；a750a为提取液酸化后在波长750nm处的吸光度值；a665a为提取液酸化后在波长665nm处的吸光度值；v1为提取液体积，单位为ml；v2为水样体积，单位为l；l为比色皿光程，单位为cm。实施例5一种利用超声波破碎藻类细胞测定叶绿素的分光光度方法，包括以下步骤：1)预处理：采集1000ml地表水样于棕色瓶中，加入1%碳酸镁悬浊液,然后用直径为47mm、孔径为0.7μm的玻璃纤维滤膜进行过滤，获得藻类细胞，再放置到真空泵上进行抽滤处理，抽滤时负压为18kpa，逐渐减压，在水样刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干剩余水分；其中，碳酸镁悬浊液配制方法为取1.0g碳酸镁粉末，加人100ml纯水，搅拌成悬浊液，每次使用时充分摇匀。其中，过滤所得的藻类细胞需要避光并在-20℃温度下保存，低温运输；抽滤后的藻类细胞需要于外面包裹一层铝箔，在-20℃以下温度中保存。2）叶绿素提取：将经过抽滤的藻类细胞使用超声波清洗器破碎，超声的频率为100khz，处理时间为25min，之后加入10ml丙酮溶液，放置于4℃温度下中避光浸泡6h，在浸泡过程中再摇振3次，之后使用离心机离心，离心速度为3600r/min，离心时间为25min，离心后取上清液；其中，丙酮溶液浓度为90%，配制方法为900ml丙酮中加100ml纯水。3）分光光度法测定及计算：将经过离心得到的上清液倒入比色皿中，采用分光光度计分别在750nm、664nm、647nm、630nm的波长下进行测定，按照三色方程公式计算地表水体中浮游藻类细胞的叶绿素a、b、c，再测定脱镁叶绿素校正含量，并用单色方程公式计算脱镁叶绿素校正含量。其中，分光光度法具体采用光程为1cm的比色皿，90%丙酮溶液作参比液进行比色，分光光度计采用波长为380~780nm的分光光度计，测定注意事项为测定750nm波长处的吸光度大于0.005，需用孔径为0.45μm聚四氟乙烯有机相针式过滤器过滤后在测定。其中，三色方程公式为：ρchl-a=[11.85(a647-a750)-1.54(a664-a750)-0.08(a630-a750)]v1/(v2l),ρchl-b=[21.03(a647-a750)-5.43(a664-a750)-2.66(a630-a750)]v1/(v2l),ρchl-c=[24.52(a630-a750)-7.60(a647-a750)-1.67(a664-a750)]v1/(v2l);pchl-a为水样中叶绿素a的质量浓度，单位μg/l，pchl-b为水样中叶绿素b的质量浓度，单位μg/l，ρchl-c为水样中叶绿素c的质量浓度，单位μg/l，a750-为提取液在波长750nm处的吸光度值，a664为提取液在波长664nm处的吸光度值，a647为提取液在波长647nm处的吸光度值，a630为提取液在波长630nm处的吸光度值，v1为提取液体积，单位为ml，v2为水样体积，单位为l；l为比色皿光程，单位为cm。其中，单色方程测定脱镁叶绿素校正含量，具体测量步骤为向装有离心上清液的1cm比色皿内滴加40μl盐酸溶液进行酸化处理,处理时间为25min，然后于750nm、665nm处测定吸光度。其中，盐酸溶液为c(hc1)=0.1mol/l，配制方法是将8.5ml浓盐酸加人到500ml纯水中，冷却至室温后稀释至1000ml。其中，单色方程公式为:ρ,chl-a=26.7[(a664-a750)-(a665a-a750a)]v1/（v2l），ρphe-a=26.7[1.7(a665a-a750a)-(a664-a750)]v1/（v2l）；p,chl-a为水样中校正脱镁叶绿素a后叶绿素a的质量浓度，单位为μg/l；pphe-a为水样中脱镁叶绿素a的质量浓度，单位为μg/l；a750为提取液酸化前在波长750nm处的吸光度值；a664为提取液酸化前在波长664nm处的吸光度值；a750a为提取液酸化后在波长750nm处的吸光度值；a665a为提取液酸化后在波长665nm处的吸光度值；v1为提取液体积，单位为ml；v2为水样体积，单位为l；l为比色皿光程，单位为cm。实施例6一种利用超声波破碎藻类细胞测定叶绿素的分光光度方法，包括以下步骤：1)预处理：采集500ml地表水样于棕色瓶中，加入1%碳酸镁悬浊液,然后用直径为47mm、孔径为0.7μm的玻璃纤维滤膜进行过滤，获得藻类细胞，再放置到真空泵上进行抽滤处理，抽滤时负压为12kpa，逐渐减压，在水样刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干剩余水分；其中，碳酸镁悬浊液配制方法为取0.5g碳酸镁粉末，加人50ml纯水，搅拌成悬浊液，每次使用时充分摇匀。其中，过滤所得的藻类细胞需要避光并在-20℃温度下保存，低温运输；抽滤后的藻类细胞需要于外面包裹一层铝箔，在-20℃以下温度中保存。2）叶绿素提取：将经过抽滤的藻类细胞使用超声波清洗器破碎，超声的频率为150khz，处理时间为15min，之后加入10ml丙酮溶液，放置于4℃温度下中避光浸泡4h，在浸泡过程中再摇振3次，之后使用离心机离心，离心速度为3500r/min，离心时间为15min，离心后取上清液；其中，丙酮溶液浓度为90%，配制方法为900ml丙酮中加100ml纯水。3）分光光度法测定及计算：将经过离心得到的上清液倒入比色皿中，采用分光光度计分别在750nm、664nm、647nm、630nm的波长下进行测定，按照三色方程公式计算地表水体中浮游藻类细胞的叶绿素a、b、c，再测定脱镁叶绿素校正含量，并用单色方程公式计算脱镁叶绿素校正含量。其中，分光光度法具体采用光程为1cm的比色皿，90%丙酮溶液作参比液进行比色，分光光度计采用波长为380~780nm的分光光度计，测定注意事项为测定750nm波长处的吸光度大于0.005，需用孔径为0.45μm聚四氟乙烯有机相针式过滤器过滤后在测定。其中，三色方程公式为：ρchl-a=[11.85(a647-a750)-1.54(a664-a750)-0.08(a630-a750)]v1/(v2l),ρchl-b=[21.03(a647-a750)-5.43(a664-a750)-2.66(a630-a750)]v1/(v2l),ρchl-c=[24.52(a630-a750)-7.60(a647-a750)-1.67(a664-a750)]v1/(v2l);pchl-a为水样中叶绿素a的质量浓度，单位μg/l，pchl-b为水样中叶绿素b的质量浓度，单位μg/l，ρchl-c为水样中叶绿素c的质量浓度，单位μg/l，a750为提取液在波长750nm处的吸光度值，a664为提取液在波长664nm处的吸光度值，a647为提取液在波长647nm处的吸光度值，a630为提取液在波长630nm处的吸光度值，v1为提取液体积，单位为ml，v2为水样体积，单位为l；l为比色皿光程，单位为cm。其中，单色方程测定脱镁叶绿素校正含量，具体测量步骤为向装有离心上清液的1cm比色皿内滴加40μl盐酸溶液进行酸化处理,处理时间为15min，然后于750nm、665nm处测定吸光度。其中，盐酸溶液为c(hc1)=0.1mol/l，配制方法是将8.5ml浓盐酸加人到500ml纯水中，冷却至室温后稀释至1000ml。其中，单色方程公式为:ρ,chl-a=26.7[(a664-a750)-(a665a-a750a)]v1/（v2l），ρphe-a=26.7[1.7(a665a-a750a)-(a664-a750)]v1/（v2l）；p,chl-a为水样中校正脱镁叶绿素a后叶绿素a的质量浓度，单位为μg/l；pphe-a为水样中脱镁叶绿素a的质量浓度，单位为μg/l；a750为提取液酸化前在波长750nm处的吸光度值；a664为提取液酸化前在波长664nm处的吸光度值；a750a为提取液酸化后在波长750nm处的吸光度值；a665a为提取液酸化后在波长665nm处的吸光度值；v1为提取液体积，单位为ml；v2为水样体积，单位为l；l为比色皿光程，单位为cm。当前第1页12