本发明涉及醋酸浓度检测方法，具体是一种低温苹果酸脱氢酶醋酸浓度检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
醋酸是无色的吸湿性液体，凝固后为无色晶体。尽管根据醋酸在水溶液中的离解能力它是一个弱酸，但是醋酸具有腐蚀性，其蒸汽对眼和鼻有刺激性作用。醋酸是一种简单的羧酸，是一个重要的化学试剂。醋酸也被用来制造电影胶片所需要的醋酸纤维素和木材用胶粘剂中的聚乙酸乙烯酯，以及很多合成纤维和织物。在所有化工产品中醋酸是唯一可以和石油化工竞争的煤化工产品。同时，醋酸广泛存在于食品、果汁、造纸、制药和其他工业产品中，在生产中是重要的参数之一。现有的测定醋酸含量的方法主要分为化学法。化学法主要为酸碱滴定法，此法操作简单，成本较低，但存在较大的误差，检测不准确。
技术实现要素：
为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种低温苹果酸脱氢酶醋酸浓度检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由乙酰辅酶a合成酶、腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐、辅酶a、l-苹果酸、nadh、低温苹果酸脱氢酶、柠檬酸合酶、ph8tris-hcl组成。
上述低温苹果酸脱氢酶醋酸浓度检测试剂盒，乙酰辅酶a合成酶5～50u/l、腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐0.5～2.5g/l和辅酶a5～50u/l，l-苹果酸0.5～2.5g/l，nadh7.5mmol/l，低温苹果酸脱氢酶5～500u/l，柠檬酸合酶5～500u/l。
上述低温苹果酸脱氢酶醋酸浓度检测试剂盒，所述低温苹果酸脱氢酶为海洋微生物中提取的低温嗜盐酶，其具体筛选方法为：从深海海泥、海水中采集样本，通过含0.1-0.2g/l溴甲酚绿的牛肉膏蛋白胨固体培养基进行初筛，筛选出产酸性较强的菌株，利用含mtt0.015g/l的牛肉膏蛋白胨固体培养基来检测菌株的动力性，进行第二次筛选，选择动力性较强的菌株测酶活，通过双重筛选准确的筛选出胶质芽孢杆菌(bacillusmucilaginosus)和粘性沙雷氏菌(serratiamarcescens)，即为高产mdhs的低温菌株。
应用上述低温苹果酸脱氢酶醋酸浓度检测试剂盒检测醋酸浓度的方法包括以下步骤：
(1)将测定的醋酸样品加入乙酰辅酶a合成酶、atp和辅酶a，在乙酰辅酶a合成酶催化作用下，辅酶a转化醋酸为乙酰辅酶a，并同时生成amp和焦磷酸；
(2)将nad+、l-苹果酸与苹果酸脱氢酶(mdh)依次加入步骤(1)的反应液中；
(3)将步骤2反应液混匀之后，立刻加入柠檬酸合酶，乙酰辅酶a转化草酰乙酸生成柠檬酸，反应中的草酰乙酸来源于步骤2；
(4)全程在340nm下测量nadh的吸光度值，依据公式(1)和公式(2)即可得到醋酸浓度(mol/ml)；
式中：△a340nm/min：每分钟吸光度的降低值
vt：反应总体积，ml
vs：样品体积，ml
df：稀释倍数
ε：nadh在340nm处的摩尔吸光度系数，6.22/μmol·cm
b：比色皿光径，cm。
本发明醋酸浓度测定方法原理如下：
在乙酰辅酶a合成酶(acs)催化作用下，辅酶a转化醋酸为乙酰辅酶a，并同时生成amp和焦磷酸，在柠檬酸合酶的作用下，乙酰辅酶a转化草酰乙酸生成柠檬酸，反应中的草酰乙酸来源于l-苹果酸与nad+在l-苹果酸脱氢酶(l-mdh)的作用下的产物，在此反应中nad+被还原成nadh，生成的nadh的量取决于醋酸的量，nadh的吸光度值可在340nm下测量。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明用于测定发酵液中醋酸浓度方法，所用试剂盒配置简单，原料来源广泛、成本低，环保安全，不需要使用有毒的有机溶剂；不同于市场上相关的中高温试剂盒，本发明试剂盒通过低温苹果酸脱氢酶作为辅酶用于测定醋酸的含量，在20℃室温环境中即可使用，操作简单。经实际检测验证，该方法稳定性好，测定的准确性与精密度较高。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
低温苹果酸脱氢酶醋酸浓度检测试剂盒，具体如下：
其中，低温苹果酸脱氢酶为海洋微生物中提取的低温嗜盐酶，其具体筛选方法为：从深海海泥、海水中采集样本，通过含0.1-0.2g/l溴甲酚绿的牛肉膏蛋白胨固体培养基进行初筛，筛选出产酸性较强的菌株，利用含mtt0.015g/l的牛肉膏蛋白胨固体培养基来检测菌株的动力性，进行第二次筛选，选择动力性较强的菌株测酶活，通过双重筛选准确的筛选出胶质芽孢杆菌(bacillusmucilaginosus)和粘性沙雷氏菌(serratiamarcescens)，即为高产mdhs的低温菌株。
使用上述试剂盒测定醋酸浓度，具体如下：
(1)将待测定的醋酸样品加入乙酰辅酶a合成酶、atp(腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐)和辅酶a，在乙酰辅酶a合成酶催化作用下，辅酶a转化醋酸为乙酰辅酶a，并同时生成amp和焦磷酸；
(2)将nad+、l-苹果酸与苹果酸脱氢酶(mdh)依次加入步骤(1)的反应液中；
(3)将步骤2反应液混匀之后，立刻加入柠檬酸合酶，乙酰辅酶a转化草酰乙酸生成柠檬酸，反应中的草酰乙酸来源于步骤(2)；
(4)全程在340nm下测量nadh的吸光度值，依据公式(1)和公式(2)即可得到醋酸浓度(mol/ml)；
式中：△a340nm/min：每分钟吸光度的降低值
vt：反应总体积，ml
vs：样品体积，ml
df：稀释倍数
ε：nadh在340nm处的摩尔吸光度系数，6.22/μmol·cm
b：比色皿光径，cm
n：醋酸浓度，mol/ml
u:mdh酶活，u/ml
t：反应时间，min
其中，nadh测定混合液为：0.1ml7.5mmol/lnadh，0.1ml0.5g/ll-苹果酸，2.8ml0.1mol/lph8tris-hcl缓冲液和0.1ml苹果酸脱氢酶液，于25℃监测反应体系在340nm吸光度变化，根据每分钟吸光度的降低值即可计算出酶活，则为每分钟氧化1μmol的nadh所需的酶量，由此计算出醋酸的含量。
根据以上测定方法，以市场上购买的醋酸检测试剂盒与本发明试剂盒为检测样本，分别进行稳定性追踪检测，得到自配试剂与对照试剂的高盐样品稳定性、37℃和20℃加速稳定性、长期稳定性试验结果(见表1)。
表1与对照试剂稳定性性能指标对照结果
由表1可以看出本发明以组分浓度为乙酰辅酶a合成酶5u/l，腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐0.5g/l，辅酶a5u/l，l-苹果酸0.5g/l，nadh7.5mmol/l，低温苹果酸脱氢酶100u/l，柠檬酸合酶100u/l，ph8tris-hcl0.1mol/l时，相比于对照组，稳定性较高，灵敏度与准确度都相对较高；并可在较低温度下使用，检测高盐样品中的醋酸浓度。
实施例2
低温苹果酸脱氢酶醋酸浓度检测试剂盒，具体如下：
其中，低温苹果酸脱氢酶为海洋微生物中提取的低温嗜盐酶，其具体筛选方法为：从深海海泥、海水中采集样本，通过含0.1-0.2g/l溴甲酚绿的牛肉膏蛋白胨固体培养基进行初筛，筛选出产酸性较强的菌株，利用含mtt0.015g/l的牛肉膏蛋白胨固体培养基来检测菌株的动力性，进行第二次筛选，选择动力性较强的菌株测酶活，通过双重筛选准确的筛选出胶质芽孢杆菌(bacillusmucilaginosus)和粘性沙雷氏菌(serratiamarcescens)，即为高产mdhs的低温菌株。
按照实施例1的方法进行检测。
表2与对照试剂稳定性性能指标对照结果
由表2可以看出本发明以组分浓度为乙酰辅酶a合成酶20u/l，腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐1.5g/l，辅酶a20u/l，l-苹果酸1.5g/l，nadh7.5mmol/l，低温苹果酸脱氢酶200u/l，柠檬酸合酶200u/l，ph8tris-hcl0.1mol/l时，相比于对照组，相比于对照组，稳定性是三组实例中最高，灵敏度与准确度都相对最高；并可在较低温度下使用，检测高盐样品中的醋酸浓度。
实施例3
低温苹果酸脱氢酶醋酸浓度检测试剂盒，具体如下：
其中，低温苹果酸脱氢酶为海洋微生物中提取的低温嗜盐酶，其具体筛选方法为：从深海海泥、海水中采集样本，通过含0.1-0.2g/l溴甲酚绿的牛肉膏蛋白胨固体培养基进行初筛，筛选出产酸性较强的菌株，利用含mtt0.015g/l的牛肉膏蛋白胨固体培养基来检测菌株的动力性，进行第二次筛选，选择动力性较强的菌株测酶活，通过双重筛选准确的筛选出胶质芽孢杆菌(bacillusmucilaginosus)和粘性沙雷氏菌(serratiamarcescens)，即为高产mdhs的低温菌株。
按照实施例1的方法进行检测。
表3与对照试剂稳定性性能指标对照结果
由表3可以看出本发明以组分浓度为乙酰辅酶a合成酶50u/l，腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐2.5g/l，辅酶a50u/l，l-苹果酸2.5g/l，nadh7.5mmol/l，低温苹果酸脱氢酶500u/l，柠檬酸合酶500u/l，ph8tris-hcl0.1mol/l时，相比于对照组，相比于对照组，稳定性较高，灵敏度与准确度都相对较高；并可在较低温度下使用，检测高盐样品中的醋酸浓度。
经过试验验证，采用本发明检测试剂盒及测定方法，可准确测出醋酸浓度。