一种可再生的通用型太赫兹超材料传感器的制作方法

本发明属于生物检测领域，涉及一种可再生的通用型太赫兹超材料传感器。

背景技术：

太赫兹(terahertz，thz，1thz＝10¹²hz)波是频率在0.1～10thz的电磁波，基于thz可以对化学和生物物质进行非标记、非接触和非破坏性检测的优点。thz波能够以一种纯物理过程、无需标记的方式在同一时间节点揭示多种生物大分子的结构和功能信息，从而可能为病原菌无标记检测提供一种与现有技术完全不同的革命性新型技术手段。然而，大多数微生物的大小约为太赫兹波长的λ/100，导致低散射横截面，因此thz对大部分细菌的响应信号较弱。

超材料mms(metamaterials)是由周期性排列的亚波长谐振单元和载体构成的人工复合电磁材料。在入射thz波的作用下，通过超材料的局域电场增强特性，可增强超材料与生物分子之间的相互作用，进而提高thz用于生物检测的灵敏度。已有研究报道基于超材料的thz检测技术应用于各种生物大分子检测与分析如葡萄糖、尿酸、乳糖、血清白蛋白等。但基于mms的太赫兹传感器直接用于检测生物样本仍存在以下不足：(1)缺乏特异的识别系统，特异性较差；(2)太赫兹超材料传感器都不具有可再生性，难以重复使用，检测成本较高，(3)截止目前报道的太赫兹超材料传感器，只能用于蛋白或核酸的单一捕获检测，尚不能满足同时检测核酸和蛋白等多种类靶标的需求

适配体是一段通过筛选后能够特异识别把物质的一段人工合成的核酸序列。与传统的抗体相比，适配体具有以下特点和优势：对目标靶分子具有与抗体相当亲和性；可以大量、快速的在体外合成，制备方法更为简单快捷；稳定性优于抗体，利于储存。适配体能有望代替抗体用于特异捕获核酸、蛋白等多种类靶标。

因此，急需一种特异检测多种类靶标的可再生太赫兹超材料生物传感器及相应的检测方法，用于病原菌及其耐药基因的准确、快速、联合、无标记检测。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种可再生的通用型太赫兹超材料传感器。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种可再生的通用型太赫兹超材料传感器，包括太赫兹超材料芯片，以及包被于其表面的通用型固定探针和包含特异酶切位点的适配体，所述通用型固定探针为5’端经巯基修饰的核苷酸序列，包括适配体结合区域，所述核苷酸序列如seqidno.1所示；所述适配体包括靶标特异识别区域、固定探针结合区域以及尿嘧啶酶切位点。

优选的，所述芯片由硅基底及其表面的亚波长金属谐振单元组成，谐振单元的材质进一步优选为金。

进一步优选的，所述芯片的几何参数为：硅基底的厚度h＝500μm，谐振单元开口宽度g＝2μm，谐振单元内环与环之间的距离d＝4μm，谐振单元的宽度w＝2μm，谐振单元表面金属膜的厚度为150nm。谐振单元开口宽度g＝2μm与细菌的尺寸相匹配以达到局域电场增强提高检测灵敏度。

优选的，所述适配体与固定探针互补结合。

进一步优选的，所述适配体序列为seqidno.2所示的s.aureus(金黄色葡萄球菌，staphylococcusaureus)适配体序列和seqidno.3所示的rpob(结核分枝杆菌利福平耐药基因)适配体序列。

上述传感器的构建方法，设计通用型固定探针，针对不同种类靶标，筛选特异的适配体序列，设计含有特异酶切位点的适配体序列，将不同靶标的特异适配体固定在超材料的不同反应模块，通过尿嘧啶剪切酶剪切包含特异酶切位点的适配体序列，构建可再生的通用型太赫兹超材料传感器。

优选的，将传感器的芯片浸泡于1μm巯基化修饰的固定探针溶液中，4℃孵育过夜，清洗，获得通用型的太赫兹超材料芯片。

优选的，将5μl适配体(1μm)溶液滴加到芯片的谐振单元金属膜表面，37℃孵育1小时清洗后，获得可再生性的太赫兹超材料生物传感器，于4℃保存备用。

利用上述传感器进行靶标检测的方法，包括步骤：

(1)针对不同的靶标，配置成不同浓度，备用；

(2)取步骤(1)配置的靶标溶液，滴加至传感器的反应区域，孵育，清洗，吹干；

(3)吹干后的传感器反应区域采用太赫兹时域光谱仪进行测量。

优选的，所述反应区域为芯片的金属谐振单元表面。

优选的，所述检测为多种类靶标的联合检测，靶标选自细胞、蛋白、核酸或小分子。进一步优选的，步骤(1)的具体方法是：致病菌的标准质控菌株，在37℃恒温培养振荡器过夜培养后，采用pbs溶液离心清洗3次，配置成不同浓度细菌溶液，备用。

进一步优选的，步骤(1)的具体方法是：利用超纯水将人工合成的耐药基因配置成不同浓度，备用。

优选的，步骤(2)中，靶标溶液的滴加量为5μl。

优选的，步骤(2)中，孵育条件为：37℃孵育1小时。

优选的，步骤(2)中采用超纯水清洗，氮气吹干。

优选的，步骤(3)的具体方法是：吹干后的传感器反应区域采用太赫兹时域光谱仪的透射型thz-tds系统进行测量，相对湿度控制在2％以内，温度控制在22～24℃，以靶标溶液浓度为零的样本的透射光谱信号作为空白信号，以加入不同浓度靶标溶液后透射光谱的共振频率位移作为靶标的定量检测信号。

上述传感器的再生方法，将检测后的传感器浸入含10单位尿嘧啶dna剪切酶(uracil-dnaexcisionmix)的缓冲液中，在37℃反应15分钟，用超纯水冲洗后氮气吹干，获得可重复使用的再生性的传感器，并用于下一次测量。

进一步优选的，所述缓冲液体系为：50mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，10mmedta，ph9.0。

本发明的有益效果在于：

本发明的通用型传感器将多种类待测靶标精准捕获于超材料芯片表面，并通过尿嘧啶剪切酶剪切适配体的特异酶切位点，获得可重复使用的再生性太赫兹超材料生物传感器。通过设计通用型固定探针，将不同种类靶标的特异适配体固定在超材料的不同反应模块，可实现病原菌及其耐药基因等多种类靶标的快速、无标记、特异、联合检测。本发明通过适配体特异识别并精准捕获靶标于超材料芯片表面，可在2小时内完成多种类靶标的检测，通过尿嘧啶剪切酶剪切适配体的酶切位点，获得的再生性太赫兹超材料生物传感器，可重复用于多种类靶标的联合检测。使用本发明的方法结果稳定可靠，可用于细菌和耐药基因等多种类靶标的特异、联合检测，重复检测次数达到6次，检测时间仅为2h，检测最低细菌浓度低至100cfu/ml。

本发明的主要创新性设计有三点：(1)设计通用型探针，(2)设计含有特异酶切位点的适配体，(3)在太赫兹超材料芯片表面设计多个反应模块，将不同靶标的特异适配体固定在超材料的不同反应模块。从而获得了以下检测效果：(1)通用型传感器可以通用于细胞、核酸、蛋白、小分子等多种类的靶标的特异检测(2)通过将不同靶标的特异适配体固定在超材料的不同反应模块，实现多种类靶标的联合、无标记检测(3)通过适配体特异捕获多种类靶标，使可再生的超材料传感器可重复使用6次，频移信号仍能保持为第1次检测频移信号的90％。(4)通用型超材料传感器减少固定探针与超材料孵育的步骤，单次检测时间被缩短至2h。

本发明在每次检测前不需要重新孵育固定探针，可重复检测，检测靶标丰富，核酸类靶标以及病原菌等均可以作为检测靶标。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为太赫兹超材料的立体结构图(a)和扫描电镜图(b)；

图2为可再生性太赫兹超材料生物传感器检测病原菌的原理示意图；

图3为可再生性太赫兹超材料传感器多次重复检测金黄色葡萄球菌的共振频率的变化；

图4为可再生性太赫兹超材料传感器多次重复检测1μmrpob序列溶液的共振频率的变化。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例：

可再生性通用型太赫兹超材料生物传感器：包括太赫兹超材料芯片，以及包被于超材料芯片表面的通用型固定探针和包含特异酶切位点的适配体，不同靶标的特异适配体固定在超材料的不同反应模块。太赫兹超材料超材料的结构和扫描电镜图如图1所示，太赫兹超材料衬底为硅，金属结构所选材料为金。应用光刻工艺制作超材料结构，制作流程包括镀膜、涂胶、曝光、湿法刻蚀和去胶。超材料几何参数包括衬底硅的厚度h＝500μm，开口宽度g＝2μm，结构单元内的环与环之间距离d＝4μm，结构单元的宽度w＝2μm,以及金膜的厚度150nm。

可再生性通用型太赫兹超材料生物传感器测靶标的原理图如图2所示，通过适配体将s.aureus或rpob精准捕获于超材料芯片表面，并通过尿嘧啶剪切酶剪切适配体的特异酶切位点，获得可重复使用的再生性太赫兹超材料生物传感器。

可再生性通用型太赫兹超材料生物传感器检测病原菌的方法，具体步骤如下：

(1)探针设计：采用nupack软件模拟和设计5’端巯基化修饰的通用型固定探针，针对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus，s.aureus)和结核分枝杆菌利福平耐药基因(rpob)，rpob序列如no.4所示的序列，设计包含特异酶切位点的s.aureus适配体序列和rpob适配体，将不同靶标的特异适配体固定在超材料的不同反应模块。适配体与通用型固定探针互补结合于超材料生物芯片表面，特异识别靶标，通过尿嘧啶剪切酶剪切包含特异酶切位点的适配体序列，构建再生性的太赫兹超材料传感器，具体序列见表1所示。

(2)通用型太赫兹超材料传感器的构建：将太赫兹超材料芯片浸泡于含1um巯基化修饰的固定探针的te(10mmtris,edta1mm,ph7.5)溶液中，4℃孵育过夜，超纯水清洗后获得通用型的太赫兹超材料生物芯片，取1μm适配体溶液5μl滴加到通用型太赫兹超材料金膜表面，37℃孵育1小时，超纯水清洗后氮气吹干，获得可再生性太赫兹超材料生物传感器，于4℃保存备用。

(3)待测靶标的准备：采用atcc25923s.aureus标准质控菌株，在lb培养基中，37℃恒温培养振荡器过夜培养后，10mmpbs缓冲液离心洗涤(5000rpm,5min)3次，使用pbs溶液配置成不同浓度细菌溶液备用。人工合成的rpob序列4000rpm离心5min，加入超纯水配置不同浓rpob样本于-20℃保存备用。

(4)通用型太赫兹超材料传感器对s.aureus的精准捕获：取5μls.aureu和rpob溶液滴加于可再生性太赫兹超材料生物传感器的相应反应模块，37℃孵育1小时后，超纯水清洗，37℃热板干燥后检测。

(8)太赫兹透射光谱检测：将干燥后的生物传感器反应区域采用太赫兹时域光谱仪进行检测，相对湿度控制在2％以内，温度控制在23±1℃，获得其thz-tds透射光谱结果，以靶标浓度为零的样本的透射光谱信号作为空白信号，采用加入不同浓度靶标后透射光谱的共振频率位移作为病原菌和rpob的定量检测信号。

(9)可再生性太赫兹超材料传感器的构建：将检测后的太赫兹超材料传感器在浸入含10单位尿嘧啶dna剪切酶(uracil-dnaexcisionmix)的缓冲液(50mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，10mmedta，ph9.0中，在37℃反应15min，用超纯水冲洗后氮气吹干，获得可重复使用的再生性的太赫兹超材料感器，并进行下一次测量。

表1探针序列设计

结果分析：将不同浓度的s.aureus菌液使用上述方法检测，检测的最低浓度低至100cfu/ml，获得的共振频率位移见表2。检测后的太赫兹超材料传感器通过上述酶切处理，获得可再生性的太赫兹超材料传感器，可用于10⁸cfu/mls.aureus菌液的6次重复检测，如图3。太赫兹超材料传感器通过上述酶切处理，获得可再生性的太赫兹超材料传感器，可用于人工合成1μmrpob序列溶液的6次重复检测，如图4。

表2检测不同浓度s.aureus菌液磁珠富集后太赫兹超材料的共振频率的位移

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院

<120>一种可再生的通用型太赫兹超材料传感器

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcatggtatttttcgttcgttaggattcaaatcagc36

<210>2

<211>81

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tccctacggcgctaacccccccagtccgtcctcccagcctcacaccgccaccgtgctaca60

acgcugauuugaauccuaacg81

<210>3

<211>40

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

caacagtcggcgcttgtgggtgcugauuugaauccuaacg40

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

acccacaagcgccgactgttg21